申请/专利权人：上海交通大学

申请日：2017-11-07

公开（公告）日：2018-03-23

公开（公告）号：CN107828807A

主分类号：C12N15/60(2006.01)I

分类号：C12N15/60(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;A01H5/00(2018.01)I;A01H6/46(2018.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2020.12.11#发明专利申请公布后的驳回;2018.04.17#实质审查的生效;2018.03.23#公开

摘要：一种基于ubiquitin‑1启动子的植物抗蚜性实现方法，利用基因工程手段从椒样薄荷中克隆到EβF合成酶E‑β‑farnesenesynthase,EβFS基因EβF，构建ubiquitin‑1启动子驱动EβF载体，将该基因通过基因枪转化方法转入小麦，在小麦中催化FPP合成[反]‑β‑法呢烯，通过在小麦中合成蚜虫警报素[反]‑β‑法呢烯，达到转基因小麦释放[反]‑β‑法呢烯，从而趋避蚜虫的作用。

主权项：一种具有抗蚜虫功能的基因，其特征在于，具体为合成酶基因EβFS，从椒样薄荷Mentha×piperita中克隆得到。

全文数据：基于ubiquitin-1启动子的植物抗畅性实现方法技术领域[0001]本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种基于ubiquitin-Ι启动子驱动E0F基因的增强植物抗蚜性的方法。背景技术[0002]蚜虫是农业生产中的主要害虫之一，我国小麦主要种植地区小麦生育期间气温升高，出现“暖冬”，致使蚜虫危害猖獗，每年在小麦生产上因蚜虫及其传播的病毒所造成的经济损失十分严重。由于目前我国小麦主栽品种对蚜虫的抗性都不强，如何有效防治蚜虫已成为小麦生产上的重大问题之一。农药在抵抗虫害中起着重要作用，然而害虫对农药逐渐产生抗药性，此外，农药还容易污染环境。转基因技术在帮助农作物抵抗咀嚼式口器的害虫方面作出了重大贡献。例如，转Bt毒蛋白的棉花对于棉铃虫具有高抗效果。因此，防治蚜虫是一个刻不容缓的世界性课题。[0003][反]-β_法呢稀φ-β-farnesene是广泛存在于植物和动物中的倍半碗。大量研究结果表明，[反]-β_法呢烯是蚜虫报警信息素的主要成分。当蚜虫受到天敌捕食或者拟寄生物攻击时，植物会释放出[反]-β_法呢烯，使周围的蚜虫感知并迅速逃离。发明内容[0004]本发明提出一种基于ubiquitin-Ι启动子的植物抗蚊性实现方法，与化学防治相比，利用基因工程手段获得的抗虫转基因植物具有只对目标害虫有效，而对非危害生物没有影响的优点，植物表达产生的抗虫物质存在于植物体内，不会对环境造成污染，且成本低，利于推广。[0005]本发明是通过以下技术方案实现的：[0006]本发明涉及一种具有抗蚜虫功能的基因，具体为合成酶基因EI3FS，从椒样薄荷MenthaXpiperita中克隆得到，其核苷酸序列如序列1所示。[0007]本发明涉及一种基于ubiquitin-Ι启动子的植物抗蚊性实现方法，通过从椒样薄荷MenthaXpiperita中克隆得到EPF合成酶基因EPFS，通过构建表达载体并将该基因采用基因枪方法导入小麦中，实现小麦抗蚜性的增强。[0008]所述的表达载体，即ubiquitin-Ι启动子驱动EK7载体，通过将椒样薄荷EK7S基因连于植物过量表达载体上，构建得到含EPFS基因序列的植物过量表达载体。[0009]所述的ubiquitin-ι启动子具体为:pDE1005的组成型启动子。技术效果[0010]与现有技术相比，本发明对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物或林业植物等。附图说明[0011]图1为本发明PDEl005:proUBI:EffS载体构建示意图；[0012]图2为实施例中转Ubiquitin-I启动子驱动EffS基因Tl代小麦PCR鉴定示意图；[0013]图中：M:DL2000marker;+:pDE1005:proUBI:EPFS质粒;CK:野生型FiIeder春小麦；1-1，1-3，1-5，2-3，2-5，2-6，3-1，3-5，3-6:转ubiquitin-1启动子驱动EPFS基因Tl代小麦植株，简称EB。[0014]图3为实施例中转Ubiquitin-I启动子驱动EPFS基因Tl代小麦半定量PCR分析示意图。具体实施方式[0015]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册NewYork:ColdspringharborLaboratoryPress,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂盒均为市售或公开渠道可以获得的试剂盒。实施例1[0016]椒样薄荷Eff基因的克隆[0017]1.椒样薄荷基因组总RNA的提取:取椒样薄荷叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEppendorfEP离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN生化科技有限公司植物总RNA试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。[0018]2.椒样薄荷Ei3F基因的克隆：以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA;根据EPF基因的序列设计基因特异性引物，通过PCR从总cDNA中扩增EPFS因，并测序。[0019]通过上述步骤，获得了椒样薄荷Ei3F基因的全长1650bp，其核苷酸编码序列如SEQIDNO.1所示，并推导出其蛋白编码序列如SEQIDNO.2所示，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。[0020]表1扩增中所采用的PCR引物[0021]表2PCR的反应体系实施例2[0022]含Eff基因的植物过量表达载体的构建[0023]将EPF基因部分序列利用重组酶构建在植物过量表达载体pDE1005上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了SpeI的酶切位点，反向引物中引入了SacI的酶切位点，引物如表3所示，其启动子为ubiquitin-Ι启动子；[0024]表3pDE1005-Eff体构建的PCR引物实施例3[0025]基因枪法转化小麦幼胚获得转基因小麦植株[0026]1.幼胚培养:选取开花后14d左右的幼穗，收集适当大小的籽粒幼胚大小为1.0-ΐ.5mm，在超净工作台内用70%乙醇表面消毒30s，10%次氯酸钠消毒10-12min，无菌水冲洗3次，轻轻剥取幼胚，接种在SD2培养基上诱导愈伤组织。[0027]2.基因枪转化小麦幼胚:接种8d左右的幼胚愈伤组织用做外源基因的受体。含有目的基因的质粒DNA包裹金粉子弹进行转化。基因枪轰击前将受体在高渗透压培养基SD2+0.4molL-I山梨醇）上预处理4h。轰击后的愈伤组织在高渗透压培养基上继续放置16h，转移到SD2培养基上进行14d的恢复培养，然后转移到12MS添加除草剂35mgL-I的培养基上进行愈伤组织筛选并分化成苗。移栽生长健壮的抗性植株到花盆中。[0028]3.转基因小麦的PCR检测：利用pDE1005-Ei3F体构建的PCR引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化小麦基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。[0029]本实施例将所述利用基因枪法转化小麦幼胚，获得经PCR检测的转基因小麦植株。实施例4[0030]转ubiquitin-Ι启动子驱动EffS基因Tl代小麦目的基因半定量分析[0031]用TIANGEN生化科技有限公司RNA抽提试剂盒RNAplantPlus植物总RNA提取试剂从转ubiquitin-1启动子驱动Ef3FS基因Tl代小麦和非转基因小麦CK的叶片中提取总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度，用Takara公司PrimeSm'p域）RTreagentKitPerfectRealTime将RNA反转录为cDNA。[0032]设计半定量基因（EPFS-RT-FP:TGGGATACCATTACGAACCTCAG，EPFS-RT-RP:GTGAGAGCCAATGTCATCCCAA和内参（ACTINACTIN-RT-FP:CCAACAGAGAGAAAATGACCCAGA，ACTIN-RT-RP:AACCTCCACTGAGAACAACATTACC引物引物，由上海生工合成。[0033]PCR反应体系为:正向引物（10μΜ0.5μί，反向引物（10μΜ0.5μί，2ΧPremixΙΟμΜ，DNA模板样品）（IOOngyL2yL，加ddH20至20yL〇PCR反应参数为:94。。IOmin，IcycIe;94。。40s，55°C40s，72°C40s，28cycles;72°C10min，lcycle;KTC终止。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并在UVP凝胶成像系统（TransilluminatorWhiteUV，UVP，inc.，USA紫外光下拍照。结果如图3所示，表明转ubiquitiη-1启动子驱动EPFS基因T1代小麦的EPFS基因表达量得到了显著提高。实施例5[0034]转ubiquitin-Ι启动子驱动Ef3FS基因Tl代小麦于光照培养室中进行抗蚜虫性鉴定。[0035]将同一虫龄的麦蚜分别接于待测转基因植株和3株野生型小麦展开的嫩叶上，每株接10头，培养10天后，统计叶片上蚜虫数量。结果表1所示，与野生型对照相比，转ubiquitin-Ι启动子驱动EPFS基因小麦植株获得了显著提高的抗蚊性。[0036]表1转基因小麦对蚜虫的抗性鉴定[0037]结果显示，三个转ubiquitin-Ι启动子驱动EK7S基因Tl代小麦植株上蚊虫数量显著低于野生型对照。[0038]上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

权利要求：1.一种具有抗蚊虫功能的基因，其特征在于，具体为合成酶基因EPFS，从椒样薄荷MenthaXpiperita中克隆得到。2.—种基于ubiquitin-Ι启动子的植物抗蚊性实现方法，其特征在于，通过从椒样薄荷MenthaXpiperita中克隆得到EK7合成酶基因EK7S，通过构建表达载体并将该基因采用基因枪方法导入小麦中，实现小麦抗蚜性的增强。3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的表达载体为玉米ubiquitin-Ι启动子驱动Ei3F载体，通过将椒样薄荷EPFS基因连于植物过量表达载体上，构建得到含EPFS基因序列的植物过量表达载体。4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的基因枪方法是指：以幼胚愈伤组织用做外源基因的受体，将含有目的基因的质粒DNA包裹金粉子弹进行转化，然后在培养基上经恢复培养和筛选得到。5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的基因枪方法中，基因枪轰击前将受体在高渗透压SD2+0.4molL-I山梨醇的培养基上预处理;轰击后的愈伤组织在高渗透压培养基上继续放置16h，转移到SD2培养基上进行14d的恢复培养，然后转移到12MS添加除草剂35mgL-l的培养基上进行愈伤组织筛选并分化成苗。

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