申请/专利权人：中国农业科学院作物科学研究所

申请日：2014-12-29

公开（公告）日：2015-05-06

公开（公告）号：CN104593380A

主分类号：C12N15/29(2006.01)I

分类号：C12N15/29(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;C12N15/84(2006.01)I;C07K14/415(2006.01)I;A01H5/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2017.08.25#授权;2015.05.27#实质审查的生效;2015.05.06#公开

摘要：本发明涉及一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1a，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了有所述基因编码的玉米HKT转运蛋白及所述基因ZmHKT1；1a在转化植物中的应用。本发明所获得的有益效果在于：提供了一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1a及重组载体，本发明所提供的基因ZmHKT1；1a可以应用于提高转基因作物的耐盐能力。

主权项：一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1a，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

全文数据：用于提高植物耐盐性的编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKTI;1a及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种用于提高植物耐盐性的编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKTl;Ia及其应用。背景技术[0002]盐胁迫是影响作物生长发育和产量的主要非生物胁迫因素之一。据统计，在全世界范围内，大约有4.5亿公顷的可耕作土地正在遭受着不同程度的盐渍化，而且由于全球气候的不断变化以及不合理的施肥灌溉等原因，土壤盐渍化的范围也将不断扩大，这将严重地制约我国的经济和社会的发展。因此，除了利用一些传统的手段和方法来改善土壤外，培育耐盐农作物新品种已成为当务之急。由于植物耐盐性状自身的复杂性，使得采用传统的育种方法很难获得具有耐盐特性的优良品种。随着生物技术的发展，通过导入外源基因来提高农作物的耐盐性已成为现代作物育种的主要潮流。[0003]利用基因工程技术将具有优良性状的基因转入植物，以此来开发高效的转基因作物新品种是一项具有广阔应用前景的技术。就目前的研究情况而言，利用转基因技术在提高作物耐盐性方面已经取得了较大的进展，已有的部分研究表明，将耐盐基因过表达或者转入其它生物中，其异源转录产物和翻译产物可以提高转基因植物的耐盐性。[0004]HKT转运蛋白是一类非常重要的蛋白质，根据其第一个孔环结构（poredomain，PD氨基酸组成的不同主要将其分成两大类，不同类型的HKT转运蛋白在功能上具有显著的差异。近年来，有关小麦、水稻、拟南芥等植物的HKT转运蛋白在植物耐盐过程中发挥的作用已经被先后报道，但是关于玉米中的HKT转运蛋白在植物耐盐过程中的作用和应用的研究尚未见报道。[0005]因此，有必要对玉米HKT转运蛋白的编码核苷酸序列进行分离，从而为后期应用玉米HKT转运蛋白对植物进行定向改造奠定基础。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的编码玉米HKT转运蛋白的核苷酸序列及重组载体和应用。[0007]为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKTl;la，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0008]本发明的发明人在对玉米的耐盐机制进行研究的过程中，对玉米进行盐胁迫处理后提取玉米叶片总RNA后反转录得到了如SEQIDNO:1所示的DNA序列。[0009]具体的，所述基因ZmHKTl;Ia是按照以下方式获得的：[0010]将生长10天的玉米B73幼苗从蛭石：营养土比例为1:1的花盆中取出，并洗掉玉米根部的蛭石。然后将幼苗根部浸入浓度为250mmolLNaCl溶液中通气培养，取盐胁迫处理Ih后的玉米叶片为材料，进行RNA的提取等后续试验。[0011]以盐胁迫处理后的玉米B73叶片为材料，提取叶片总RNA后反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别在其5’UTR和3’UTR设计In-fusion引物进行PCR反应，上游引物为^!!!·!!々-infusion-FSEQIDN0:3，下游引物为ZmHKTl;la-infusion-R:SEQIDNOdhSOyL反应体系：5XTransStartFastPfuBuffer10yL，TransStartFastPfuDNAPolymeraselyL，2.5mMdNTPs5yL,ZmHKTl；la-infusion-Fl.5yL,ZmHKTl；la-infusion-Rl.5yL,cDNA2yL,ddH2029yL。反应程序：95°C预变性5min，然后95°C解链30sec，56°C退火30sec，72°C延伸45sec，反应32个循环，72°C延伸7min。将PCR产物用凝胶回收试剂盒AXYGEN回收纯化获得SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。[0012]本发明还提供了一种玉米HKT转运蛋白，其特征在于：由SEQIDN0:2所示的氨基酸序列组成。[0013]应当理解的是，本领域技术人员可以根据SEQIDN0:2所示的氨基酸序列在不影响其活性的条件下，对该序列进行取代、缺失或插入一个或几个氨基酸以获得具有同等活性的蛋白质。[0014]本发明还提供了所述基因的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为pCAMBIA3301-ZmHKTl；la〇[0015]本发明还提供了含有所述基因的工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。[0016]可选的，所述基因工程菌内含有重组载体pCAMBIA3301-ZmHKTl;la的核苷酸片段，[0017]本发明还提供了玉米HKT转运蛋白的编码基因ZmHKTI;Ia在转化植物中的应用。[0018]进一步地，所述植物包括玉米、烟草、水稻、棉花、大豆、高粱。优选的，当所述植物为烟草时，能够取得最好的提高耐盐能力的效果。[0019]进一步地，所述应用是在烟草内转化所述基因ZmHKTl;la，从而使得玉米表达具有SEQIDN0:2所不的氣基酸序列的蛋白，提尚烟草的耐盐能力。[0020]本发明所获得的有益效果在于：提供了一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKTl;Ia及重组载体，本发明所提供的基因ZmHKTl;Ia可以应用于提高转基因作物的耐盐能力。附图说明[0021]图1为植物重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKTl;Ia片段图谱[0022]其中ZmHKTl;Ia代表玉米HKT转运蛋白的编码基因。[0023]图2为ZmHKTl;Ia转基因烟草植株T2代的PCR鉴定[0024]1，0200011«^;1，!120;2，野生型烟草；3和4，分别为1-7、1-13转基因株系。扩增产物大小为942bp。[0025]图3为ZmHKTl;Ia转基因烟草植株T2代的RT-PCR分析[0026]1，0200011«^;1，!120;2，野生型烟草；3和4，分别为1-7、1-13转基因株系。扩增产物大小均为259bp，参照基因Actin的扩增产物大小为106bp。[0027]图4为T2代ZmHKTl;Ia转基因烟草幼苗在不同浓度NaCl处理后的生长状况[0028]I表示在OmMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况，II表示在200mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况，III在300mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况。其中1-7和1-13是转基因株系。[0029]图5为盐胁迫对T2代ZmHKTl;Ia转基因烟草幼苗鲜重的影响[0030]横坐标代表不同的烟草株系，纵坐标代表烟草幼苗的鲜重FW。200表示在200mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况，300表示在300mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况。WT代表野生型烟草幼苗，1-7和1-13是转基因幼苗。林表示有极显著差异P〈〇.01。[0031]图6为盐胁迫对T2代ZmHKTl;Ia转基因烟草幼苗主根长的影响[0032]横坐标代表不同的烟草株系，纵坐标代表烟草幼苗的主根长MRL。200表示在200mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况，300表示在300mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况。WT代表野生型烟草幼苗，1-7和1-13是转基因幼苗。**表示有极显著差异P〈〇.〇l。具体实施方式[0033]下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。[0034]实施例1玉米HKT转运蛋白的编码基因ZmHKTl;Ia的获得以及植物表达载体pCAMBIA3301-ZmHKTl;Ia的构建。[0035]将生长10天的玉米B73幼苗从蛭石：营养土为1:1的花盆中取出，并洗掉玉米根部的蛭石。然后将幼苗根部浸入浓度为250mmolLNaCl溶液中通气培养，取处理Ih后的玉米叶片为材料，进彳TRNA的提取等后续试验。[0036]以盐胁迫处理后的玉米B73叶片为材料，按照北京全式金生物技术有限公司生产的RNA提取试剂盒EasyPure™PlantRNAKit的说明书提取叶片总RNA，按照北京全式金生物技术有限公司提供的RNA反转录试剂盒TransScriptIIFirst-StandcDNASynthesisSuperMix的说明书，取Iyg总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别在其5’UTR和3’UTR设计In-fusion引物进行PCR反应，上游引物为：ZmHKTl;la-infusion-F:SEQIDN0:3，下游引物为ZmHKTl;la-infusion-R:SEQIDNOdhSOyL反应体系：5XTransStartFastPfuBuffer10uL?TransStartFastPfuDNAPolymeraseluL?2.5mMdNTPs5uL?ZmHKTl；Ia-infusion-F1.5uL?ZmHKTl；la-infusion-R1.5uL?cDNA2uL?ddH2〇29uL〇[0037]PCR反应程序：95°C预变性5min，然后95°C解链30sec，56°C退火30sec，72°C延伸45sec，反应32个循环，72°C延伸7min。将PCR产物用凝胶回收试剂盒AXYGEN回收纯化。[0038]提取植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用NcoI和BstEII双酶切，20yL酶切体系为：10XNEBuffer3·12μL，NcoIlμL，BstEIIlμL，质粒DNA4μL，ddH2012μL，37。C水浴酶切Ih后，60°C水浴酶切Ih。将pCAMBIA3301线性化质粒大片段用凝胶回收试剂盒AXYGEN回收纯化。然后将上述PCR产物与pCAMBIA3301酶切纯化产物进行In-fusionHD反应，5yL反应体系：5XIn-fusionHDEnzymepremixIyUPCR产物2yL，pCAMBIA3301酶切纯化产物2yL，50°C水浴反应20min，然后取2.5yL反应产物转化Trans5a感受态细胞，提取阳性质粒，获得如图1所示结构的植物重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKTl;la，进行酶切电泳检测和测序验证，获得如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。[0039]实施例2农杆菌EHA105介导叶盘法转化烟草[0040]制备农杆菌感受态，并将含ZmHKTl;Ia基因的植物表达载体pCAMBIA3301-ZmHKTl;Ia转化农杆菌感受态，详细过程如下：从含有50ygmL利福平的YEB平板上挑取EHA105单克隆，接种于50ml含50ygmL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28°C培养至OD值为0.5，然后菌液冰浴30min，将菌液转移至无菌的离心管中，4000rpm离心，收集菌液，将菌液悬浮于2mL预冷的IOOmMCaCl2含20%的甘油）溶液中，200yL管分装，待用。取5yL的pCAMBIA3301-ZmHKTl;Ia载体质粒，加入200yLEHA105感受态细胞中，混合均匀后，冰浴30min，液氮冷冻5min，37°C热激5min，冰浴5min，加入800yLYEB液体培养基，28°C200rpm摇床预培养4h，菌液涂板于YEB含50ygmL利福平+lOOygmL卡那霉素）固体培养基上，28°C暗培养2天，挑取单克隆检测，并选取阳性克隆摇菌，用于转化烟草。[0041]用YEB含50ygmL利福平+lOOygmL卡那霉素液体培养基培养包含ZmHKTl;Ia基因的植物表达载体的农杆菌EHA105，以烟草叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将从玉米中克隆得到的ZmHKTl;Ia基因导入烟草叶片。取组培瓶中去掉叶缘和主脉的烟草植株顶端叶盘（0.4X0.6cm2作为转化受体，浸入备好的农杆菌菌液（0D为0.6〜0.8中感染lOmin，用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液后，转入上面铺一层无菌滤纸的MS基本培养基上，28°C暗培养3d，然后将材料转入含有抗生素的分化培养基上继代培养4代，两周继代一次，待分化出的抗性芽长至2〜3cm高时，切下小芽转入生根培养基中诱导生根，初步获得抗性植株。[0042]烟草组织培养基以MS培养基为基础，？!15.8，100邱3、121°：灭菌151^11。共培养培养基MS培养基）1L:MURASHIGESK00GBASALMEDIUMwVITAMINSMS盐）4.43g，蔗糖30g，琼脂8g，pH5·8〇[0043]烟草分化培养基：MS培养基+3mgL6-BA+0.2mgLNAA+10mgLPPT+500mgLCef，pH5.8〇[0044]烟草诱导生根培养基:MS培养基+10mgLPPT+500mgLCef，pH5.8。[0045]实施例3ZmHKTl;la转基因植株的分子鉴定PCR及RT-PCR[0046]IPCR检测[0047]取T2代转基因植株嫩叶及野生型嫩叶，采取CTAB法提取基因组DNA。将ZmHKTl;Ia基因作为检测目标，根据ZmHKTl;Ia基因序列合成扩增引物，扩增片段长为942bp，引物序列为：ZmHKTl;Ia-Fl:GACGACAGTCTCCAGCATGASEQIDNO:5,ZmHKTl；Ia-Rl：AGCACATACAGCACGACGACSEQIDN0:6;分别以ZmHKTl;la转基因植株（l-7和l-13、野生型植株DNAWT、阳性质粒、水为模板，以ZmHKTl;Ia-Fl和ZmHKTl;Ia-Rl为引物，进行PCR检测。扩增体系为：2XTaqPCRMasterMix+dye10yL，引物ZmHKTl;Ia-Fl和ZmHKTl;Ia-Rl各0·5yL，DNA模板IyUddH2O8yL。反应程序为：94°C预变性5min，然后94°C解链30sec，56°C退火30sec，72°C延伸50sec，反应35个循环，72°C延伸7min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析（图2。图中可以看出，4个ZmHKTl;Ia转基因株系（1-7和1-13均扩增出与阳性对照相同的特异性条带，野生型植株WT和空白对照中均没有扩增出条带。[0048]⑵RT-PCR检测[0049]采用北京全式金生物技术有限公司生产的RNA提取试剂盒EasyPure™PlantRNAKit提取T2代ZmHKTl;Ia转基因烟草叶片（1-7和1-13和野生型烟草叶片WT的总RNA，反转录成第一链cDNA，并以烟草管家基因Actin为内参进行RT-PCR。其中目的基因扩增片段长度为259bp，引物序列为：HKT-F-259:GTCGTCGTGCTGTATGTGCTSEQIDN0:7,HKT-R-259:TGTTGAGGACGCTGAAGTTGSEQIDN0:8;内参基因扩增片段长度为106bp，引物序列为：丁-Actin-F:CAAGGAAATCACCGCTTTGGSEQIDNO:9，T-Actin-R:AAGGGATGCGAGGATGGASEQIDNO:10。分别建立20yL的反应体系:2XTaqPCRMasterMix+dye10yL，目的基因正反向引物和内参基因正反向引物各〇.5yL，cDNA模板lyL，CldH2O8yL。反应程序为：94°C预变性5min，然后94°C解链30sec，56°C退火，72°C延伸30sec，目的基因和内参基因分别反应28和25个循环，72°C延伸7min。根据RT-PCR检测结果（图3,ZmHKTl;Ia转基因株系（1-7和1-13中ZmHKT1;Ia基因的表达量明显高于野生型烟草WT，由此证明ZmHKT1;Ia基因已经转入到烟草基因组DNA中并表达。[0050]实施例4转基因植株后代的耐盐性分析[0051]1转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后的表型分析[0052]为了检测转基因植株的耐盐性，对转基因株系（1-7和1-13进行了盐胁迫处理。将在含有pptlOygmL的MS培养基上生长一周的ZmHKTl;Ia转基因烟草幼苗（1-7和1-13和在MS培养基上生长5〜6天的野生型烟草幼苗WT，分别转移到MS+0mMNaCl、MS+200mMNaCl和MS+300mMNaCl的培养基上进行盐胁迫处理，每个转基因株系设置3个重复，每个重复包含5株幼苗。对盐胁迫处理7天后的幼苗进行表型鉴定（图4。[0053]由图4可以看出，在200mMNaCl处理下，转基因株系（1-7和1-13依旧保持较好的生长状态，而野生型烟草WT，叶片发黄，主根基本上停止伸长;在300mMNaCl处理下，转基因株系的叶片虽然较处理前变黄，但整体上仍然可以维持一定的生活状态，而野生型烟草叶片完全失绿，基本上失去了生存能力。[0054]2转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后的指标检测[0055]将在含有pptlOygmL的MS培养基上生长一周的ZmHKTl;Ia转基因烟草幼苗（1-7和1-13和在MS培养基上生长5〜6天的野生型烟草幼苗WT，分别转移到MS+0mMNaCl、MS+200mMNaCl和MS+300mMNaCl的培养基上进行盐胁迫处理，每个转基因株系设置3个重复，每个重复包含5株幼苗。对盐胁迫处理7天后的幼苗进行鲜重的称量和主根长的测定（结果见图5、图6。[0056]由图5可以看出，无论在200禮他：1处理下还是在30〇111]\1恥：1处理下，2111!«1'1;13转基因株系的鲜重显著高于野生型烟草在同样处理下的鲜重；同样地，由图6可知，在200mM和300mMNaCl处理下，ZmHKTl;Ia转基因株系的主根长显著长于野生型烟草在同样处理下的主根长。[0057]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKTl;la，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.—种玉米HKT转运蛋白，其特征在于，由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成。3.含有权利要求1所述基因ZmHKT1;Ia的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT1;Ia。4.含有权利要求1所述基因ZmHKTl;Ia的工程菌。5.权利要求1所述的基因ZmHKTI;Ia在转化植物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是在烟草内转化所述基因ZmHKTl;Ia，提尚烟草的耐盐能力。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述应用的步骤包括：从含有50ygmL利福平的YEB平板上挑取农杆菌EHA105单克隆，接种于50ml含50ygmL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28°C培养至㈤值为0.5，然后菌液冰浴30min，将菌液转移至无菌的离心管中，4000rpm离心，收集菌液，将菌液悬浮于2mL预冷的含20%的甘油的IOOmMCaCl2溶液中，200yL管分装，待用；取5yL的pCAMBIA3301-ZmHKTl;la载体质粒，加入200yLEHA105感受态细胞中，混合均匀后，冰浴30min，液氮冷冻5min，37°C热激5min，冰浴5min，加入800yLYEB液体培养基，28°C200rpm摇床预培养4h，菌液涂板于含50ygmL利福平+100ygmL卡那霉素的YEB固体培养基上，28°C暗培养2天，挑取单克隆检测，并选取阳性克隆摇菌，用于转化烟草；用含50ygmL利福平和100ygmL卡那霉素的YEB液体培养基培养包含ZmHKTl;Ia基因的植物表达载体的农杆菌EHA105,以烟草叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将从玉米中克隆得到的ZmHKTl;Ia基因导入烟草叶片;取组培瓶中去掉叶缘和主脉的烟草植株顶端叶盘作为转化受体，浸入备好的OD为0.6〜0.8的农杆菌菌液中感染IOmin，用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液后，转入上面铺一层无菌滤纸的MS基本培养基上，28°C暗培养3d，然后将材料转入含有抗生素的分化培养基上继代培养4代，两周继代一次，待分化出的抗性芽长至2〜3cm高时，切下小芽转入生根培养基中诱导生根，初步获得抗性植株。

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