申请/专利权人：郑州大学第一附属医院

申请日：2018-04-24

公开（公告）日：2018-09-18

公开（公告）号：CN108546758A

主分类号：C12Q1/6886(2018.01)I

分类号：C12Q1/6886(2018.01)I;C12N15/113(2010.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2021.11.09#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.10.16#实质审查的生效;2018.09.18#公开

摘要：本发明涉及胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc‑DCAF1‑1及其应用，可有效解决制备预测胰腺癌患者预后的试剂盒的问题，一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc‑DCAF1‑1，其转录本长度大于200个核苷酸，序列为SEQ NO:1，在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，该试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQ No：2和3、内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ No：4、5和从胰腺癌组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂。本发明非编码RNA Lnc‑DCAF1‑1作为胰腺癌预后新的分子标志物，可及时预测胰腺癌预后，并及时对胰腺癌患者进行治疗，延长患者生存时间，提高生存率，是胰腺癌预后上的一大创新。

主权项：1.一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc‑DCAF1‑1，为长链非编码RNA，其转录本长度大于200个核苷酸，该核苷酸序列为SEQ No：1。

全文数据：_种胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DGAF1-1及其应用技术领域[0001]本发明涉及肿瘤分子生物学，特别是一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I及其应用。背景技术[0002]胰腺癌是一种常见的恶性水平很高的消化道的恶性肿瘤。因为其有发病隐匿，进展迅速的临床特点，所以胰腺癌的确诊和防治难度很大。胰腺癌已经成为由于消化系统癌肿致死的主要病因之一。胰腺癌在导致发达国家因癌症而死亡的原因之中，在男性中占到第4位，而在女性中则占到第5位。患者的年纪也出现明显的年轻化的趋势。胰腺癌好发于男性，男性和女性发生胰腺癌的比例约为1.5:1。其起病相当隐匿，早期的临床表现也缺乏特异性的症状。大部分患者通常会出现腹部隐痛、恶心、呕吐、食欲不振等症状，与其他消化系统常见的疾病难以区分。因此初期的胰腺癌很难引起人们足够的重视。而与此相对的是，胰腺癌的进展则相当迅速。一般来说，很容易出现肿瘤的侵犯和迀移，比如侵犯邻近脏器，区域淋巴结的转移甚至转移至远处器官。统计显示，有65%左右的胰腺癌患者在明确确诊时已发生了浸润和迀移，预后极差。目前，临床上还没有理想的分子指标来评估预后及发生转移的风险。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。[0003]非编码RNA是指生物基因组中不编码蛋白质的RNA。根据转录本的长度，非编码RNA可被大致的划分为两大类:一类是长度小于200个核苷酸的小分子非编码RNA。目前研究较多的有微小RNAs、小干扰RNA和与piwi蛋白相作用的RNApiRNA等，在生物体内介导基因沉默、参与RNA剪切和蛋白质修饰、精细调控基因的转录和翻译等；另一类是大于200nt的长链非编码RNAs，其在非编码RNA中占据相当大的比例。长链非编码RNAs以前被认为是基因组的转录噪声，近几年有研究表明其在染色质重构，转录调控，转录后加工、蛋白质代谢等方面有重要的作用。长链非编码RNA分类长链非编码RNAs，是一类功能性的RNA，保守性一般较低。大量研究表明，长链非编码RNAs在基因组中的表达具有明显的时空特异性和组织特异性，其含量随着物种复杂度的增加而增加。长链非编码RNA在基因组中广泛的功能性组成包括在染色体动力学，端粒和在亚细胞结构组织中的一系列作用等。研究表明，基因调控的许多基本过程都有长链非编码RNA的广泛参与，包括染色质修饰、转录调控、转录后调控等调节过程。Lnc-DCAFl-I是一种新发现的非编码RNA，其转录本长度大于200个核苷酸。目前，非编码RNALnc-DCAFl-I在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。Lnc-DCAFl-I是否可以作为一种新的肿瘤标志物制备试剂及试剂盒，应用于预测胰腺癌患者预后至今未见有公开报道。发明内容[0004]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I及其应用，可有效解决制备预测胰腺癌患者预后的试剂盒的问题。[0005]本发明解决的技术方案是，一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I，其转录本长度大于200个核苷酸，序列为SEQNO:1;该胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用；所述的胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQNo:2和3、内参基因TUBAlA表达的引物序列，引物序列为SEQNo:4、5和从胰腺癌组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂。[0006]本发明Lnc-DCAFl-I是一种新发现的非编码RNA，可有效用于制备胰腺癌患者预后的试剂盒，非编码RNALnc-DCAFl-I作为胰腺癌预后新的分子标志物，可及时预测胰腺癌预后，并及时对胰腺癌患者进行治疗，延长患者生存时间，提高生存率，是胰腺癌预后上的一大创新，经济和社会效益巨大。附图说明[0007]图1为本发明实时荧光定量PCR分析Lnc-DCAFl-I在正常组织与胰腺癌中的表达差异图。[0008]图2为本发明对胰腺癌患者的预后影响生存曲线分析胰腺癌组织来源的Lnc-DCAFl-I表达高低图。具体实施方式[0009]以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。[0010]本发明在具体实施中，一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I，为新发现的一种非编码RNALnc-DCAFl-I分子标志物，为长链非编码RNA，其转录本长度大于200个核苷酸，该核苷酸序列为SEQNo:1:该胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用；所述的胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQNo:2和3、内参基因TUBAlA表达的引物序列，引物序列为SEQNo:4、5和从胰腺癌组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂，其中：所述的检测胰腺癌组织中Lnc-DCAFl-I表达量的试剂盒为实时荧光定PCR检测试剂盒。[0011]所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物，包括用于检测Lnc-DCAFl-I表达的特异性引物，引物序列为SEQNO:2、3,以及内参基因TUBAlA表达的引物序列，引物序列为SEQNO:4、5。[0012]所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒，除Lnc-DCAFl-I的引物外，还含有从胰腺癌组织中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。包括：1从胰腺癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75%乙醇，DEPC水；2以总RNA为模板将Lnc-DCAFl-I逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和01igodT引物的混合物；3将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括Lnc-DCAFl-I实时荧光定量PCR特异性引物、TUBAlA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。[0013]本发明通过荧光定量PCR与生存曲线分析发现胰腺癌组织来源的Lnc-DCAFl-I与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高。此法为预测胰腺癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高胰腺癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。并经实地试验，取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：实施例1制备检测Lnc-DCAFl-I表达量的试剂用于制备胰腺癌患者预后的试剂盒（用于30次反应）1.Trizo120ml2.抑制RNA降解溶剂40ml3.氯仿80ml4.异丙醇80ml5.DEPC水IOml6.10随机引物和01丨8〇11'引物的混合物10^17.5乂逆转录反应缓冲液15^18.IOmM含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTPΙΟΟμΙ9.20〇υμ1M-MLV逆转录酶50μ110.SYBRGreenqPCRMix500μ111.3μΜ目的基因Lnc-DCAFl-I特异性引物其序列如SEQNO:2、3所示）50μ112.3μΜ内参基因TUBAlA特异性引物其序列如SEQNO:4、5所示）50μ1实施例2组织样本Lnc-DCAFl-I的检测1、收集待测胰腺癌或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制RNA降解溶剂的冻存管中，放至_80°C冰箱备用。[0014]2、组织中RNA的抽提：1先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取IOOmg组织粉末加入已盛有Iml的Trizol液的EP管中。组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%，充分混合均匀。[0015]2室温放置5分钟，然后加入200yL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡0.5分钟。12000转分钟离心10分钟。[0016]3取上层水相于一新的EP管中（勿中间的沉淀层和下层液混入），加入500yL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10分钟，12000转分钟离心10分钟。[0017]4小心地弃去上清液，加入Iml的75%乙醇，涡旋混匀，4°C下12000转分钟离心5分钟。重复操作一次。[0018]5弃去上清液尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5〜10分钟（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用50yLDEPC处理过的水将RNA溶解。[0019]6RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸IyLRNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度。核酸浓度测定仪的测定的㈤260㈤280比值，比值在1.8-2.0之间认为RNA纯度很好。最后，RNA贮存于-80°C冰箱备用。[0020]3、Lnc-DCAFl-lRNA的逆转录:使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒①7170S。具体步骤如下。[0021]1去除基因组DNA:将模板TotalRNA，5XgDNAEraserBuffer在冰上解冻，5XRTBuffer、10XRTPrimerMix、DEPC-treatedWater在室温（15-25°C解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。RNA的变性，把RNA样品在65°C条件下热变性5分钟后，立即置于冰水中冷却。按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。[0022]2在PCR仪上或水浴中，37°C孵育2分钟。迅速置于冰上放置备用。[0023]3逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应。按照下表的逆转录反应体系配制混合液。[0024]442°C孵育60分钟以进行逆转录反应，随后80°C孵育10分钟失活逆转录酶后放于冰上。对于二级结构复杂或高GC含量的模板，可以提高逆转录温度至50°C，以增强逆转录效率。[0025]5得到的cDNA可立即或-80°C冻存后用于后续实时荧光定量PCR，cDNA宜避免过多的反复冻融。[0026]4、利用Lnc-DCAFl-I的特异性引物进行实时定量PCR:特异性引物在生工生物工程上海股份有限公司合成，包括用于检测Lnc-DCAFl-I表达的特异性引物，引物序列为SEQNO:2、3,以及内参基因TUBAlA表达的引物序列，引物序列为SEQNO:4、5。实时定量PCR其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoFastTMSYBRGreenqPCRMix2X，具体步骤如下。[0027]1融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFastTMSYBRGreenqPCRMix完全融解并混匀后置于冰盒内。[0028]2冰浴上设置PCR反应体系（以96孔板为例）：3通常DNA模板的量以I-IOngcDNA为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μΜ时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度。如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μ1，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。[0029]4用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。[0030]5将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。[0031]6PCR反应程序:在实时荧光定量PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95°C2分钟。采用如下的PCR程序，本程序是以ABI7900HT荧光定量PCR仪为例：a.预变性:95°C2minb.变性:95°C15secc.退火延伸:60°C15_30secd.重复步骤b和步骤c，总共40个循环e.恪解曲线分析可选）：95°C15sec,60°C15sec,95°C15secf.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果三步法只需在退火延伸后加一步72°C30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。[0032]5、Lnc-DCAFl-l表达量的数据分析:本实验数据纳入60例胰腺癌患者及其正常对照组织。实时定量PCR的结果分析采用相对定量方法即2^^%法。具体如下:首先，将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因Lnc-DCAFl-I的Ct值减去自身内参基因TUBAlA的Ct值，得到的数就是ACt;换成公式就是：ACt=Ct目的基因Lnc-DCAFl-D-Ct内参基因TUBA1A;然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因Lnc-DCAFl-I的△Ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的ACt减去正常对照组织组样本的ACt，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-AACt。最后，对-AACt进行2的幂运算，即就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。我们发现，胰腺癌的肿瘤组织中Lnc-DCAFl-I的表达量比正常对照高（见图1，差异具有统计学差异ρ0·05〇[0033]6、通过对上述实验所纳入的60例胰腺癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的胰腺癌患者中，选取荧光实时定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较。肿瘤组织中Lnc-DCAFl-I表达高于正常对照组织的患者定义为Lnc-DCAFl-I高表达组，其余为低表达组。通过Kaplan-Meier生存分析，Lnc-DCAFl-I高表达患者的生存期比Lnc-DCAFl-I低表达组的患者明显降低，预后更差见图2，差异具有有统计学意义p0.05。因此，Lnc-DCAFl-I可作为胰腺癌患者预后的特异性分子标志物。[0034]由以上可以清楚的看出，本发明公开了一种新的胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I，用于制备胰腺癌患者的试剂盒，通过检测胰腺癌肿瘤组织来源的Lnc-DCAFl-I的试剂盒。通过研究证实Lnc-CIT-I在胰腺癌中表达上调，高表达Lnc-DCAFl-I的胰腺癌患者，其总体生存率更差。因此，通过检测胰腺癌患者肿瘤组织中Lnc-DCAFl-I的表达水平，可以对胰腺癌患者做出预后检查诊断，准确率高达96%以上，并进行及时治疗，提高患者生存率和生存质量，具有深远的临床应用意义和推广应用价值，经济和社会效益巨大。

权利要求：1.一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I，为长链非编码RNA，其转录本长度大于200个核苷酸，该核苷酸序列为SEQNo:1。2.权利要求1所述的胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。3.权利要求2所述的胰腺癌预后分子标志物非编码RNALnc-DCAFl-I在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQN〇:2和3、内参基因TUBAlA表达的引物序列，引物序列为SEQN〇:4、5和从胰腺组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂。

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