申请/专利权人：中南民族大学

申请日：2018-04-28

公开（公告）日：2018-09-28

公开（公告）号：CN108588074A

主分类号：C12N15/113(2010.01)I

分类号：C12N15/113(2010.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;A01H5/00(2018.01)I;A01H6/46(2018.01)I;C12Q1/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.09#授权;2018.10.26#实质审查的生效;2018.09.28#公开

摘要：本发明首先根据已经发表的OsCKX 4基因序GeneBank，Accession NO.NC 029256，提取日本晴的RNA，逆转录得到cDNA，并以此为模板通过聚合酶链式反应PCR扩增OsCKX 4。PCR扩增引物对包括上游引物和下游引物。紧接着，本发明提供了上述细胞分裂素氧化酶OsCKX 4基因的表面展示载体pMAL‑p2x‑INP‑CKX。本发明提供了一种水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX 4表面展示体系，包括宿主大肠杆菌以及定向插入的表面展示载体pMAL‑p2x‑INP‑CKX。利用该体系构建细胞分裂素电化学生物传感器,对细胞分裂素异戊烯基腺嘌呤的含量进行检测。

主权项：1.一种细胞分裂素氧化酶OsCKX 4基因的PCR扩增引物对，包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

全文数据：细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及到水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4基因的克隆和细菌表面展示及其应用于细胞分裂素的电化学检测。背景技术[0002]细胞分裂素作为植物生长调节类激素，参与调控植物的生长与发育，准确分析植物激素在植物体内的含量分布对研究植物生命活动、作物遗传育种等具有巨大的意义。[0003]水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4能不可逆地专一催化异戊烯细胞分裂素的降解，CKX活性与它的辅酶FAD密切相关，其反应机制是:细胞分裂素与OsCKX4结合并发生催化反应，使细胞分裂素生成亚胺化合物的中间产物，同时OsCKX4内部FAD被还原为FADH2,中间产物水解并最终生成不饱和醛和腺嘌呤。OsCKX4在热裂解石墨电极表面实现直接电化学，其辅酶FAD氧化还原特峰位于-0.42V和-0.48V，加入细胞分裂素底物后，FAD氧化还原峰电流发生变化，因此可根据FAD氧化还原峰值的变化作为电化学检测的信号。然而，目前本领域中并没有采用上述机理来检测细胞分裂素含量的相关报道。发明内容[0004]本发明解决了现有技术中不足，提供了一种水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4在大肠杆菌Rosseta表面展示的体系，并利用该体系构建细胞分裂素电化学生物传感器，对细胞分裂素异戊烯基腺嘌呤的含量进行检测。[0005]实现本发明上述目的所采用的技术方案为：[0006]本发明首先根据已经发表的OsCKX4基因序（GeneBank，AccessionN0.NC029256，提取日本晴的RNA，逆转录得到cDNA，并以此为模板通过聚合酶链式反应PCR扩增0sCKX4。PCR扩增引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。其中5’端序列的上游引物包含XbaI限制性内切酶位点，3‘端序列的下游引物包含SalI限制性内切酶位点。[0007]紧接着，本发明提供了上述细胞分裂素氧化酶OsCKX4基因的表面展示载体PMAL-p2x-INP-CKX。其构建方法包括以下步骤：（1、取水稻日本晴新鲜幼叶，用TriZol法提取总RNA，反转录，Actin引物检测反转产物cDNA，以该cDNA为模板进行目的片段CKX的PCR扩增，扩增所用引物如权利要求1所示，得到PCR产物；（2、用XbaI和SalI双酶切步骤⑴中的PCR产物CKX和空载pMAL-p2x-INP，分别回收1520bp的目的条带和6700bp的载体条带，将回收产物目的条带和载体条带按摩尔比为3:1〜10:1的比例混合，用T4连接酶以16°C、16h进行连接;连接产物热击转化大肠杆菌DH5a，重组质粒挑取单克隆，PCR扩增鉴定，用XbaI和SalI双酶切鉴定及测序鉴定。[0008]关键性的，本发明提供了一种水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系，包括宿主大肠杆菌以及定向插入的表面展示载体pMAL-p2x-INP-CKX。所述的宿主大肠杆菌为大肠杆菌Rosseta。[0009]上述水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系的构建方法，包括如下步骤:将表面展示载体pMAL-p2x-INP-CKX转化至大肠杆菌Rosseta，取ImL活化的菌液转至IOOmL含氨苄抗性的TB液体培养基中，37°C，160rmin培养2h，OD6qq吸光度值为0.6时，在超净工作台中加入终浓度为5ygL核黄素和ImMIPTG，在28°C、160rmin条件下诱导表达24h。采用Western-blot分析蛋白的大小，并通过细胞分级分离验证目的蛋白是否展示在细胞表面。[0010]上述的水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系能够用于电化学检测细胞分裂素异戊烯基腺嘌呤。电化学检测系统包括三电极体系，分别是热裂解石墨电极EPG为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，其特征在于:所述的工作电极表面通过交联剂牛血清白蛋白（BSA和戊二醛GA交联固定有水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系的大肠杆菌菌液CKX-bacteria，得到CKX-bacteria-BSA-GA修饰的EPG电极。[0011]与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：（1、本发明首次克隆了OsCKX4基因，构建了OsCKX4的细菌表面展示体系，该体系的优势在于插入的冰晶核蛋白INP能够作为锚定蛋白将OsCKX4成功展示于细胞表面，解决了CKX原核表达的蛋白质包涵体问题。（2、由于细胞分裂素氧化酶展示在细菌表面，能够直接作为传感器的识别单元，减少了酶的提取纯化步骤。通过生物传感器检测细胞分裂素能够避免复杂的样品前处理，操作便捷、检测迅速。（3、通过在待检测样品中加入不同激素如油菜素内酯BR、脱落酸ABA、茉莉酸甲酯MeJA进行修饰电极的选择性分析，发现该修饰电极对异戊烯基腺嘌呤具有好的专一性，能避免其他植物激素的干扰。附图说明[0012]图1为水稻日本晴总RNA的电泳图。[0013]图2为Actin引物检测结果图。[0014]图3为CKX片段的PCR扩增结果图。[0015]图4为PCR鉴定重组质粒pMAL-p2x-INP-CKX结果图。[0016]图5为双酶切鉴定重组质粒pMAL-p2x-INP-CKXPCR结果图。[0017]图6为SDS-PAGE分析重组菌0sCKX4表面展示。[0018]图7为Western-blot分析重组菌0sCKX4表面展不。[0019]图8为重组菌细胞分级分离结果。[0020]图9为CKX-bacteria-BSA-GA修饰EPG电极a和空载体诱导菌液-BSA-GA修饰EPG电极b的循环伏安图。[0021]图10为CKX-bacteria-BSA-GA-EPG对细胞分裂素异戊烯基腺嘌呤循环伏安检测图。[0022]图11为CKX-bacteria-BSA-GA-EPG对不同植物激素异戊烯基腺嘌呤2-ip、脱落酸ABA、茉莉酸甲酯MeJA、和油菜素内酯BR的的选择性检测比较图。具体实施方式[0023]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。[0024]I.CKX的PCR扩增[0025]根据NCBI中检索到水稻日本晴0sCKX4基因开放阅读框序列，设计出特异性引物FR见表1，在F和R各插入酶切位点XbaI和SalI。取数片幼嫩的日本晴叶片，用液氮研磨组织呈粉末状并提取其RNA，总RNA的电泳图如图1所示，有28S、18S和5S三条带。以RNA为模板反转录成cDNA，PCR仪程序为:45°：，6011^11;70°：，51^11。产物〇0嫩质量用4^11引物做检测，检测结果如图2所示，检测结果正确，可作为扩增模板用于目的片段的扩增。图2中Lane1:DL5000Marker;Lane2-4:Actin引物检测cDNA质量。[0026]以cDNA为模板PCR扩增目的基因CKX，PCR程序:95°C，预变性3min;95°C，30s;63°C，30s;68°C，90s;31个循环;68°C，延伸7min;4°C，①。PCR扩增结果如图3所示，图3中，LaneI:DL5000Marker:Lane2:PCR扩增基因CKX。[0027]表1.0sCKX4引物设计[0028][0029]2.表达载体pMAL-p2x-INP-CKX的构建[0030]用XbaI和SalI双酶切实施方式1中的PCR产物CKX和空载pMAL-p2x-INP，分别回收1520bp的目的条带和6700bp的载体条带。[0031]用T4连接酶以16°C6h进行连接。连接产物热击转化大肠杆菌DH5a。重组质粒挑取单克隆，用PCR扩增鉴定，鉴定结果如图4所示，图4中Lanel:DL2000Marker;Lane2-5:质粒PCR鉴定结果。然后再用XbaI和SalI的双酶切鉴定，鉴定结果如图5所示，图5中Lane1:DL15000Marker;Lane2:DL2000Marker;Lane3〜4:重组质粒双酶切鉴定结果。最后进行测序鉴定。[0032]3.重组体蛋白的表达[0033]将pMAL-p2x_INP_CKX转化至大肠杆菌Rosseta，取ImL活化的菌液转至IOOmL含氨苄抗性的TB液体培养基中，37°C，160rmin培养约2h，0D6Q吸光度值为0.6时，在超净工作台中加入终浓度为5ygL核黄素和ImMIPTG，在28°C、160rmin条件下诱导表达24h。离心收集菌体，用缓冲液悬浮后超声破碎8min，破碎4s，停6s，将混合液于4°C，12000g，离心12min，并采用SDS-PAGE及Western-blot分析蛋白样品。SDS-PAGE分析图如图6所示，其中Lane1:ProteinMarker;Lane2〜4:空载体pMAL_p2x_INP转化大肠杆菌诱导表达上清、混合、沉淀；Lane5〜7:pMAL-p2x-INP_CKX转化大肠杆菌诱导表达上清、混合、沉淀；Lane8:pMAL_p2x_INP_CKX转化大肠杆菌未诱导混合样。Western-blot分析图如图7所示，图中Lane1:空载体pMAL_p2x_INP转化大肠杆菌诱导表达混合;Lane2〜4:pMAL-p2x-INP_CKX转化大肠杆菌诱导表达上清、混合、沉淀。[0034]重组蛋白进行细胞分级离心分析，重组蛋白在超高速离心机中30000rmin离心lh，收集上清液细胞质组分），再次在超高速离心机中30000rmin离心lh，沉淀为细胞外膜组分，上清为细胞内膜组分，分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分析，结果如图8所示，图8中，LaneI:ProteinMarker:Lane2:空载体转化菌混合样；Lane3:重组蛋白未诱导混合样;Lane4〜6:重组蛋白诱导混合、上清、沉淀;Lane7:重组蛋白细胞质组分;Lane8:重组蛋白细胞内膜组分;Lane9:重组蛋白细胞外膜组分;Lane10:空载体转化菌细胞质组分；Lane11:空载体转化菌细胞内膜组分;Lane12:空载体转化菌细胞外膜组分。[0035]4.细菌表面展示细胞分裂素氧化酶电化学检测异戊烯基腺嘌呤的研究[0036]ICKX-bacteria-BSA-GA-EPG修饰电极的制备[0037]在麂皮材料上添加少量0.05μπι的氧化铝粉末，用CldH2O浸润，热裂解石墨电极EPG，直径3mm于麂皮上顺时针打磨仔细抛光，在ddH20中超声清洗3min2次，再用乙醇溶液中清洗1次，于室温晾干。取4.5yL2.5%WVGA溶液、4.5yL2.5%WVBSA溶液和8yLCKX-bacteria混合均匀作为电极的修饰液，修饰液均匀滴涂在EPG表面，4°C交联固定，制备了CKX-bacteria-BSA-GA-EPG的修饰电极。[0038]2修饰电极的传感行为表征[0039]修饰电极插入3mL0.IMPBS溶液的测定池内，加入异戊烯基腺嘌呤作为底物并利用循环伏安法（CV来研究该传感器传感行为。在pH7.0、0.IMPBS中无氧条件下CKX-bacteria-BSA-GA修饰EPG电极a和空载体诱导菌液-BSA-GA修饰EPG电极⑹的循环伏安图如图9所示，扫速0.5Vs_1。直接电子传递结果表明：CKX-bacteria氧化还原峰电位分别为-0.42V和-0.48V，与FAD的氧化还原峰电位相近（图9a，而图9b观察不到任何氧化还原峰，说明CKX-bacteria成功固定在电极表面，并表现出FAD特征峰，可用于异戊稀基腺噪呤的催化氧化。[0040]3修饰电极检测异戊烯基腺嘌呤[0041]在-0.8〜-0.IV范围内加入不同浓度异戊烯基腺嘌呤，在pH7.0、0.IMPBS中无氧条件下CKX-bacteria-BSA-GA-EPG对细胞分裂素异戊烯基腺嘌呤循环伏安检测图如图10所示，扫速0.5VS-1，图10中内插图为检测线性范围_。1〜7:异戊烯基腺嘌呤浓度分别为0，1，3，5,7,9,ΙΙμΜ。由图10中可以看出修饰电极传感的氧化峰电流升高，并伴随着还原峰电流降低，表明异戊烯基腺嘌呤和CKX-bacteria识别结合，FAD被还原为FADH2,FADH2在电极表面发生氧化导致氧化峰电流升高和还原峰电流的降低。异戊烯基腺嘌呤的检测浓度在1〜9μΜ范围内和还原峰电流差值之间具有良好的线性关系，线性回归方程为y=0.12χ+0.8997，（R2=0.9833，检测限LOD为0.7yMSN=3。[0042]4修饰电极的选择性[0043]实验选用经典的植物激素中的MeJA、ABA和BR作为干扰物质，研究了CKX-bacteria-BSA-GA-EPG修饰电极的选择性。图11为CKX-bacteria-BSA-GA-EPG对不同植物激素异戊烯基腺嘌呤（2-ip、脱落酸ABA、茉莉酸甲酯MeJA、和油菜素内酯BR的的选择性检测比较，结果显示加入不同浓度的MeJA、ABA和BR，相对于异戊烯基腺嘌呤，实验选取植物激素为3、7和1ΙμΜ三个浓度，选取还原峰电流变化值作为检测信号，每个浓度激素平行检测3次，在不同浓度下，修饰电极对异戊稀基腺噪呤响应远大于其他几种激素，表明CKX-bacteria修饰EPG电极对于2-ip具有好的选择性。

权利要求：1.一种细胞分裂素氧化酶OsCKX4基因的PCR扩增引物对，包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2所不。2.—种细胞分裂素氧化酶OsCKX4基因的表面展示载体pMAL-p2x-INP-CKX。3.权利要求2中所述表面展示载体pMAL-p2x-INP-CKX的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1、取水稻日本晴新鲜幼叶，用TriZol法提取总RNA，反转录，Actin引物检测反转产物cDNA，以该cDNA为模板进行目的片段CKX的PCR扩增，扩增所用引物如权利要求1所示，得到PCR产物；2、用XbaI和SalI双酶切步骤⑴中的PCR产物CKX和空载pMAL-p2x-INP，分别回收1520bp的目的条带和6700bp的载体条带，将回收产物目的条带和载体条带按摩尔比为3:1〜10:1的比例混合，用T4连接酶以16°C、16h进行连接;连接产物热击转化大肠杆菌DH5a，重组质粒挑取单克隆，PCR扩增鉴定，用XbaI和SalI双酶切鉴定及测序鉴定。4.一种水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系，包括宿主大肠杆菌以及定向插入的权利要求2中所述的表面展示载体pMAL-p2x-INP-CKX。5.根据权利要求4所述的水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系，其特征在于:所述的宿主大肠杆菌为大肠杆菌Rosseta。6.权利要求4所述水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系的构建方法，其特征在于包括如下步骤:将表面展示载体pMAL-p2x-INP-CKX转化至大肠杆菌Rosseta，取ImL活化的菌液转至IOOmL含氨苄抗性的TB液体培养基中，37°C，160rmin培养2h，0D6Q吸光度值为0.6时，在超净工作台中加入终浓度为5ygL核黄素和ImMIPTG，在28°C、160rmin条件下诱导表达24h。7.权利要求4所述的水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系在电化学检测细胞分裂素异戊烯基腺嘌呤中的用途。8.基于权利要求4所述的水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系的电化学检测传统，包括三电极体系，分别是热裂解石墨电极EPG为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，其特征在于:所述的工作电极表面通过交联剂牛血清白蛋白（BSA和戊二醛GA交联固定有水稻日本晴细胞分裂素氧化酶OsCKX4表面展示体系的大肠杆菌菌液CKX-bacteria，得到CKX-bacteria-BSA-GA修饰的EPG电极。

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