申请/专利权人：浙江师范大学

申请日：2018-11-28

公开（公告）日：2021-05-18

公开（公告）号：CN109402078B

主分类号：C12N9/06(20060101)

分类号：C12N9/06(20060101);C12N15/53(20060101);C12N15/82(20060101);C12N1/21(20060101);A01H5/00(20180101);A01H5/12(20180101);A01H6/46(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.18#授权;2019.03.26#实质审查的生效;2019.03.01#公开

摘要：本发明属于基因工程技术领域，公开了一种水稻叶片衰老控制基因OsCKX11及其应用，水稻叶片衰老控制基因OsCKX11氨基酸序列与氨基酸序列SEQIDNo.1所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性。本发明通过定点突变水稻细胞分裂素氧化酶编码基因OsCKX11，分析其突变体表型变化发现，该基因功能缺失会使水稻叶片晚衰；在一些早衰的栽培品种中，利用基因工程技术敲除OsCKX11可以有目的地调控植物的衰老进程，调整植物群体发育时期以达到增产的目的，有非常重要的应用价值。

主权项：1.一种OsCKX11基因在抑制水稻叶片衰老中的用途，其特征在于，定点敲除OsCKX11，OsCKX11基因的氨基酸序列为SEQIDNo.1。

全文数据：一种水稻衰老控制基因OsCKX11及其应用技术领域本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻衰老控制基因OsCKX11及其应用。本发明使用反向遗传学技术鉴定OsCKX11的生物学功能，还涉及该基因突变后抑制水稻叶片早衰从而调节植株的发育影响水稻的产量。背景技术叶片衰老是叶片生长发育的最后一个阶段，叶片衰老是一个复杂的生理活动，一部分蛋白被激活表达的同时也有一部分蛋白被降解[1]。当叶片衰老时，随着叶绿素被降解以及体内水分的减少，光合速率逐渐降低，营养物质被运输到果实或者种子中储存。相关研究表明，当叶片处于衰老状态时，其内源细胞分裂素含量明显下降[3]；而当用外源细胞分裂素处理叶片时，对叶片的衰老有明显的抑制作用[4]。细胞分裂素在抑制植物叶片衰老时主要体现在以下几点：影响营养物质运输；影响脂质过氧化反应；影响植物体内其他激素的含量；在衰老后期抑制叶绿素的降解；抑制植物体内源L-丝氨酸的积累，降低丝氨酸对植物衰老的启动等[5,6,7]。细胞分裂素含量在植物体内的动态平衡需要细胞分裂素氧化酶Cytokininoxidasedehydrogenase，CKX维持，CKX能断裂细胞分裂素侧链使其失活，这个反应是不可逆的[8]。编码细胞分裂素氧化酶的是一个多基因家族，水稻体内有11种细胞分裂素氧化酶，不同细胞分裂素氧化酶之间的差异主要体现在它们的催化性能、亚细胞定位以及表达特征上[9]。近些年来培育的一些超级稻品种，其生育后期会受逆境胁迫，如极端温度、干旱、养分匮乏等，使功能叶片发生早衰。在农业生产中，叶片过早衰老常使植株光合速率迅速下降，光合产物的减少导致水稻结实率低，空秕率高，品质下降[10]。严重影响了超级稻产量潜力的发挥。本发明利用CRISPRCas9基因编辑技术定点敲除OsCKX11后，突变体出现了叶片晚衰的现象。根据理论上的推算，如果水稻的功能叶片衰老推迟1天，可以使水稻增产约2％，如果将这项发明应用于农业生产中，可以有效抑制超级稻的早衰，提高超级稻的产量。上文中涉及的参考文献如下：[1]BeckerW,ApelK.Differencesingeneexpressionbetweennaturalandartificiallyinducedleafsenescence[J].Planta,1993,1891:74-79.[2]LeeRH,WangCH,HuangLT,etal.Leafsenescenceinriceplants:cloningandcharacterizationofsenescenceup-regulatedgenes.[J].JournalofExperimentalBotany,2001,52358:1117.[3]ZwackPJ,RashotteAM.Cytokinininhibitionofleafsenescence[J].PlantSignaling&Behavior,2013,87:-.[4]ChangH,JonesML,BanowetzGM,etal.OverproductionofcytokininsinpetuniaflowerstransformedwithPSAG12-IPTdelayscorollasenescenceanddecreasessensitivitytoethylene.[J].PlantPhysiology,2003,1324:2174-83.[5]GanS,AmasinoRM.Cytokininsinplantsenescence:Fromsprayandpraytocloneandplay[J].Bioessays,1996,187:557–565.[6]ZhuYR,TaoHL,LvXY,etal.HighlevelofendogenousL-serineinitiatessenescenceinSpirodelapolyrrhiza.[J].PlantScience,2004,1665:1159-1166.[7]GreenboimwainbergY,MaymonI,BorochovR,etal.Crosstalkbetweengibberellinandcytokinin:theArabidopsisGAresponseinhibitorSPINDLYplaysapositiveroleincytokininsignaling.[J].PlantCell,2005,171:92-102.[8]AshikariM；SakakibaraH；LinS；YamamotoT；TakashiT；NishimuraA；AngelesER；QianQ；KitanoH；MatsuokaM.Cytokininoxidaseregulatesricegrainproduction.[J].Science,2005,3095735:741.[9]GaoS,ChuC.CYTOKININOXIDASEDEHYDROGENASE4IntegratesCytokininandAuxinSignalingtoControlRiceCrownRootFormation.[J].PlantPhysiology,2014,1653:1035-1046.[10]徐庆国.超级稻的研究现状与发展对策探讨[J].作物研究,2006,201:13-16.综上所述，现有技术存在的问题是在当前农业生产中的常规稻育种、超级稻育种以及杂交育种的过程中，存在叶片早衰的现象，严重影响种子的灌浆，进而影响水稻的产量和品质。而通过改良水稻细胞分裂素含量的方法来抑制水稻叶片衰老的方法尚未见报道。发明内容针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种水稻叶片衰老控制基因OsCKX11及其应用。本发明是这样实现的，一种水稻叶片衰老控制基因OsCKX11，所述水稻衰老控制基因OsCKX11氨基酸序列与氨基酸序列SEQIDNo.2所示的氨基酸序列具有至少30％的同源性。本发明的另一目的在于提供一种利用所述水稻衰老控制基因OsCKX11衍生的衍生物，衍生物的氨基酸序列为在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失或多个氨基酸生成。本发明的另一目的在于提供一种编码所述水稻衰老控制基因OsCKX11的基因，所述基因核苷酸序列为SEQIDNo.1。本发明的另一目的在于提供一种利用所述基因衍生的核苷酸序列衍生物，所述核苷酸序列衍生物包括在SEQIDNo.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。本发明的另一目的在于提供一种基因构建的质粒。本发明的另一目的在于提供一种利用所述质粒构建的表达载体。本发明的另一目的在于提供一种含有所述的表达载体的核苷酸序列的转化子。进一步，转化子的细胞为大肠杆菌。进一步，转化子的细胞为农杆菌。综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过定点突变水稻细胞分裂素氧化酶编码基因OsCKX11，分析其突变体表型变化发现，该基因功能缺失会使水稻叶片晚衰。在一些早衰的栽培品种中，利用基因工程技术敲除OsCKX11可以有目的地调控植物的衰老进程，调整植物群体发育时期以达到增产的目的，有非常重要的应用价值。本发明从定点突变OsCKX11基因能抑制水稻叶片的早衰，提出利用OsCKX11基因进行生育后期延缓超级稻衰老的水稻育种的改良方法，达到提高超级稻产量，改善品质的目的。利用基因工程技术改良超级稻，不仅可以稳定地抑制其叶片早衰，还可以降低肥料使用，增加效益。本发明对OsCKX11突变体的表型分析：将鉴定得到的OsCKX11的纯合突变体种植于人工智能培养室以及大田浙江金华和海南陵水，均表现出一致的表型性状。不论是植株的正常衰老还是在离体状态下，突变体叶片均晚衰图3，抽穗后叶绿素含量以及灌浆期光合速率也比野生型高图4。OsCKX11突变后，抽穗后水稻叶片的叶绿素含量增加约10％，灌浆期光合速率升高约20％。附图说明图1是本发明实施例提供的靶点位置及突变方式示意图；CX11-1,CX11-2,CX11-3代表三个独立的转基因株系。图2是本发明实施例提供的鉴定突变体的酶切电泳图；纯合突变体酶切后只有一条带，杂合突变体有三条带。图3是本发明实施例提供的突变体叶片晚衰图。图中：A、大田间自然衰老的突变体及野生型整株表型对比；B、孕穗期剑叶离体黑暗处理4天后的表型。图4是本发明实施例提供的田间植株的叶绿素含量及光合速率图。图中：A、抽穗后植株的叶绿素含量，横轴代表抽穗后时间天；B、灌浆期实时光合速率。每个株系检测20株植物，每株植物检测三个主穗剑叶的叶绿素含量及光合速率；***p浙江师范大学一种水稻衰老控制基因OsCKX11及其应用2SIPOSequenceListing1.011557DNA人工序列ArtificialSEQuence12518PRT人工序列ArtificialSEQuence2MetMetLeuAlaTyrMetAspHisAlaAlaAlaAlaAlaGluProAsp151015AlaGlyAlaGluProAlaValAlaAlaValAspAlaAlaGluPheAla202530AlaAlaMetAspPheGlyGlyLeuValSerAlaArgProAlaAlaVal354045ValArgProAlaSerSerAspAspValAlaSerAlaIleArgAlaAla505560AlaArgThrAlaHisLeuThrValAlaAlaArgGlyAsnGlyHisSer65707580ValAlaGlyGlnAlaMetAlaArgGlyGlyLeuValLeuAspMetArg859095AlaLeuProArgArgMetGlnLeuValValAlaProSerGlyGluLys100105110PheAlaAspValProGlyGlyAlaLeuTrpGluGluValLeuHisTrp115120125AlaValSerLysHisGlyLeuAlaProAlaSerTrpThrAspTyrLeu130135140ArgLeuThrValGlyGlyThrLeuSerAsnGlyGlyValSerGlyGln145150155160SerPheArgTyrGlyProGlnValSerAsnValAlaGlnLeuGluVal165170175ValThrGlyAspGlyGluCysHisValCysSerArgSerAlaAspPro180185190AspLeuPhePheAlaValLeuGlyGlyLeuGlyGlnPheGlyValIle195200205ThrArgAlaArgIleProLeuSerProAlaProGlnThrValArgTrp210215220ThrArgValValTyrAlaSerPheAlaAspTyrAlaAlaAspAlaGlu225230235240TrpLeuValThrArgProProHisGluAlaPheAspTyrValGluGly245250255PheAlaPheValArgSerAspAspProValAsnGlyTrpProThrVal260265270ProIleProAspGlyAlaHisPheAspAlaSerLeuLeuProAlaAsn275280285AlaGlyProValLeuTyrCysLeuGluValAlaLeuTyrGlnArgGly290295300GlyGlyGlyAspGlyGlyGlyAspAspMetAspLysArgValGlyGlu305310315320MetMetArgGlnLeuLysTyrValArgGlyLeuGluPheAlaAlaGly325330335ValGlyTyrValAspPheLeuSerArgValAsnArgValGluAspGlu340345350AlaArgArgAsnGlySerTrpAlaAlaProHisProTrpLeuAsnLeu355360365PheIleSerSerArgAspIleAlaAlaPheAspArgAlaValLeuAsn370375380GlyMetLeuAlaAspGlyValAspGlyProMetLeuIleTyrProMet385390395400LeuLysSerLysTrpAspProAlaThrSerValAlaLeuProAsnGly405410415GluIlePheTyrLeuValAlaLeuLeuArgPheCysArgProTyrPro420425430GlyGlyGlyProProValAspGluLeuValAlaGlnAsnAsnAlaIle435440445IleAspAlaCysArgSerAsnGlyTyrAspTyrLysIleTyrPhePro450455460SerTyrHisAlaGlnSerAspTrpSerArgHisPheGlyAlaLysTrp465470475480SerArgPheValAspArgLysAlaArgTyrAspProLeuAlaIleLeu485490495AlaProGlyGlnAsnIlePheAlaArgThrProSerSerValAlaAla500505510AlaAlaAlaValIleVal515

权利要求：1.一种水稻衰老控制基因OsCKX11，其特征在于，所述水稻衰老控制基因OsCKX11氨基酸序列与氨基酸序列SEQIDNo.2所示的氨基酸序列具有至少30％的同源性。2.一种利用权利要求1所述水稻衰老控制基因OsCKX11衍生的衍生物，其特征在于，衍生物的氨基酸序列为在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失或多个氨基酸生成。3.一种编码权利要求1所述水稻衰老控制基因OsCKX11的基因，其特征在于，所述基因核苷酸序列为SEQIDNo.1。4.一种利用权利要求3所述基因衍生的核苷酸序列衍生物，其特征在于，所述核苷酸序列衍生物包括在SEQIDNo.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。5.一种利用权利要求3所述基因构建的质粒。6.一种利用权利要求5所述质粒构建的表达载体。7.一种含有权利要求6所述的表达载体的核苷酸序列的转化子。8.如权利要求7所述的转化子，其特征在于，转化子的细胞为大肠杆菌。9.如权利要求7所述的转化子，其特征在于，转化子的细胞为农杆菌。

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