申请/专利权人：江西师范大学

申请日：2018-07-28

公开（公告）日：2019-01-04

公开（公告）号：CN109142701A

主分类号：G01N33/50(2006.01)I

分类号：G01N33/50(2006.01)I;A61K36/45(2006.01)I;A61P29/00(2006.01)I;A61P19/02(2006.01)I

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2019.07.05#实质审查的生效;2019.01.04#公开

摘要：本发明涉及羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用，包括建立羊踯躅提取物的制备方法，构建羊踯躅提取物抗炎活性细胞检测模型，建立羊踯躅提取物抑制炎症细胞中炎症因子及相关基因表达的分析方法。本发明结果显示，羊踯躅叶片甲醇提取物有较强的抗炎活性，能够明显抑制由脂多糖LPS刺激的RAW264.7细胞中一氧化氮NO、肿瘤坏死因子‑αTNF‑α和白介素1βIL‑1β等炎症因子的分泌及其基因的表达，也显著抑制炎症相关通路中两个关键酶基因iNOS和COX‑2的表达。

主权项：1.一种检测羊踯躅提取物抗炎活性的方法，包括以下步骤：1将新鲜的羊踯躅叶片清洗干净，冷冻干燥后粉碎，得到羊踯躅叶片粉末；用甲醇溶液回流提取羊踯躅叶片粉末，得到羊踯躅叶的甲醇提取液；将羊踯躅叶的甲醇提取液过滤，再将滤液用旋转蒸发仪在45～50℃条件下浓缩成膏状，然后将浸膏冷冻干燥成粉末，用二甲亚砜将粉末溶解，得到羊踯躅提取物；2羊踯躅提取物的用药浓度评估：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时，再用不同浓度的羊踯躅提取物处理并再培养24小时；然后检测羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的细胞毒性作用，从而得出不同浓度的羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的毒性；3羊踯躅提取物抗炎活性的细胞检测模型构建及一氧化氮浓度测定：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中，培养12小时后去上清；加入含有脂多糖的DMEM培养基刺激RAW264.7细胞建立炎症模型；2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物，孵育24小时，检测培养液中一氧化氮的浓度，从而得出羊踯躅提取物对一氧化氮的抑制率；4羊踯躅提取物抑制炎症因子的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时；加入脂多糖与RAW264.7细胞共培养，2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物共培养24小时；测定细胞培养液中肿瘤坏死因子‑α和白细胞介素‑1β的浓度，从而得出羊踯躅提取物抑制RAW264.7细胞分泌的炎症因子活性；5羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育过夜；并用脂多糖预处理细胞2小时，然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时；收集细胞并提取细胞总RNA，反向转录RNA，对基因表达水平进行定量，用β‑actin基因的表达水平进行归一化，并计算基因的表达水平，从而得出羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的情况。

全文数据：一种羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用技术领域本发明涉及羊踯躅提取物，尤其涉及羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和将羊踯躅提取物用于抗炎的方法。背景技术炎症是指机体受到物理损伤、细菌感染和其他有害刺激所引起的一种以防御反应为主的复杂的生理和病理反应，是机体的一种防御机制，主要表现为红、热、肿、痛甚至功能障碍等临床症状。风湿性关节炎RA、慢性支气管炎、慢性胃炎、炎症性肠病、动脉粥样硬化、老年痴呆和神经退行性疾病等多种疾病都伴随着炎症反应，所以能否有效的控制炎症的发展在疾病的治疗中起到了重要的作用。现有的抗炎药物主要分为载体抗炎药物和非甾体抗炎药物。非甾体抗炎药物主要以缓解为主治标不治本，抗炎效果不明显。甾体抗炎药物虽然疗效确切但常伴随着明显的不良反应。中草药在我国的应用已有数千年历史，是我国的宝贵财富，千百年来为华夏子孙的繁衍提供了健康保障。中药不但资源丰富，疗效显著，而且还具有副作用小，多成分多靶点的优点，因此从中药中研发新型抗炎药物逐步成为研究的热点，是众多国内外科学家和药企的攻关课题。炎症是一个复杂的生理和病理过程，涉及到多种细胞的参与和细胞因子的释放，其中，巨噬细胞起着重要的作用。脂多糖lipopolysacchrides,LPS是一种强有力的天然免疫因子。它能激活巨噬细胞，激活NF-κB、MAPKs、JAK等信号转导通路，从而诱导iNOS、COX-2等炎症相关因子的基因表达，使细胞分泌大量一氧化氮NO、肿瘤坏死因子TNF-α和白介素1βIL-1β等炎症因子，最终导致一系列的炎症反应。羊踯躅RhododendronmolleG.Don，别名黄踯躅、黄杜鹃、羊不食草、闹羊花，为杜鹃花科、杜鹃花属落叶灌木。羊踯躅是一种药用植物，花中含有木毒素和石楠素，叶片中含有黄酮类、杜鹃花毒素、煤地衣酸甲酯，既可以驱风、镇痛及祛湿，也可以作为一种麻醉药剂，并且具有治疗伤折、风湿、皮肤顽癣等病症的功效。临床上也有用羊踯躅单方治疗类风湿性关节炎的报道，结果显示治疗组114例中临床缓解19例17％，显效48例42％，好转33例29％，无效14例12％，总有效率88％；对照组32例中显效7例22％，好转16例50％，无效9例28％，总有效率72％。由上述临床报道可知，羊踯躅作为单方具有显著的治疗类风湿性关节炎作用，具有重要的开发前景，但是目前其抗炎机制尚不明确，限制了其临床应用及进一步开发。因此，研究建立羊踯躅抗炎活性及其分子机制的检测方法具有十分重要的意义。发明内容本发明主要基于羊踯躅单方可治疗类风湿性关节炎的重要性，但其抗炎机制尚不明确，限制了其临床应用及进一步开发的实际背景，提供羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用方法。构建羊踯躅提取物抗炎活性细胞检测模型，建立羊踯躅提取物抑制LPS刺激后的RAW264.7细胞中炎症因子及相关基因表达的分析方法，进而实现快速准确的分析羊踯躅提取物的抗炎活性，探明抗炎的分子机制，进而为开发治疗类风湿性关节炎药物提供技术支持和科学依据。本发明通过以下技术方案来实现的：一种检测羊踯躅提取物抗炎活性的方法，包括以下步骤：1将新鲜的羊踯躅叶片清洗干净，冷冻干燥后粉碎，得到羊踯躅叶片粉末在-20℃条件下储存；用甲醇溶液1:10，WV回流提取羊踯躅叶片粉末三次，每次1.5小时，得到羊踯躅叶的甲醇提取液；将羊踯躅叶的甲醇提取液过滤，再将滤液用旋转蒸发仪在45～50℃条件下浓缩成膏状，然后将浸膏冷冻干燥成粉末，用二甲亚砜DMSO将粉末溶解，得到羊踯躅提取物在-20℃条件下保存；2羊踯躅提取物的用药浓度评估细胞毒性试验：将处于对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时，再用不同浓度的羊踯躅提取物处理并再培养24小时；然后用四唑盐比色法MTT法检测羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的细胞毒性作用，从而得出不同浓度的羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的毒性；3羊踯躅提取物抗炎活性的细胞检测模型构建及一氧化氮NO浓度测定：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中，培养12小时后去上清；加入含有脂多糖LPS，1μgmL的DMEM培养基Dulbecco'smodifiedeaglemedium，改良的杜氏伊格尔培养基刺激RAW264.7细胞建立炎症模型；2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物，孵育24小时，用一氧化氮检测是试剂盒检测培养液中NO的浓度，从而得出羊踯躅提取物对NO的抑制率；4羊踯躅提取物抑制炎症因子的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时；加入LPS1μgmL与RAW264.7细胞共培养，2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物共培养24小时；用酶联免疫吸附法ELISA试剂盒ABCOM测定细胞培养液中肿瘤坏死因子-αTNF-α和白细胞介素-1βIL-1β的浓度，从而得出羊踯躅提取物抑制RAW264.7细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-1β活性；5羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育过夜；并用LPS1μgmL预处理细胞2小时，然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时；收集细胞用Trizol提取细胞总RNA，用反转录系统试剂盒PROMEGA，美国反向转录RNA1μg，运用实时荧光定量试剂盒TAKARA对基因表达水平进行定量，用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2-△△CT计算基因的表达水平，从而得出羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的情况。根据上述内容，可以得出，本发明的羊踯躅提取物可以用于抑制炎症。我们还发现，本发明的羊踯躅提取物能够应用于风湿性关节炎药物领域。本发明的技术效果是：本发明建立了羊踯躅抗炎活性提取物的提取方法及抗炎活性检测方法，构建羊踯躅提取物抗炎活性细胞检测模型，建立羊踯躅提取物抑制LPS刺激后的RAW264.7细胞中炎症因子及相关基因表达的分析方法，进而实现快速准确的分析羊踯躅提取物的抗炎活性，探明抗炎的分子机制，进而为开发治疗类风湿性关节炎药物提供技术支持和科学依据，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。本发明所建立的提取工艺简单、炎症反应的细胞检测模型灵敏、高效、可靠，适于羊踯躅混合提取物及其单体化合物的高通量抗炎药物筛选的细胞模型。附图说明图1为本发明的羊踯躅叶片甲醇提取物对RAW264.7细胞毒性试验的数据图；羊踯躅叶片甲醇提取物的浓度在小于等于100μgmL时，细胞活性达95％以上，该浓度下对细胞没有明显的毒性。图2为本发明中羊踯躅叶片甲醇提取物对LPS刺激的RAW264.7细胞NO分泌的影响的数据图；如图结果显示，羊踯躅叶甲醇提取物在100μgmL时，对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO的抑制率为51％。图3为本发明中羊踯躅叶片甲醇提取物对LPS刺激的RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β分泌的影响的数据图。如图所示，羊踯躅叶甲醇提取物在100μgmL时，对LPS刺激的RAW264.7细胞的TNF-α图3A和IL-1β图3B的抑制率分别为47％和50％。图4为本发明中羊踯躅叶片甲醇提取物对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症相关基因表达的影响的数据图。如图所示，羊踯躅叶甲醇提取物在100μgmL时，对LPS刺激的RAW264.7细胞中TNF-α图4A、IL-1β图4B、IL-6图4C、COX-2图4D和iNOS图4E的表达量分别降低到1.5、76、84、26、30倍。羊踯躅叶甲醇提取物能显著地抑制LPS刺激的RAW264.7细胞炎症相关基因的表达。具体实施方式下面将结合附图实施例详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。1羊踯躅甲醇提取物的制备：实验材料羊踯躅RhododendronmolleG.Don的叶在7月采集于中国湖南省。将一野外采集的新鲜的羊踯躅的叶子洗涤干净，置于冷冻干燥机中干燥，48小时后将叶片取出，用打粉机将叶片打成粉末并过80目筛子。将羊踯躅叶片粉末10g用甲醇溶液1:10，WV室温浸泡过夜，然后回流提取三次，每次1.5小时。再将甲醇提取液抽滤过0.45μm滤膜，再用旋转蒸发仪控制温度在45℃、真空度在-0.08MPa将提取液浓缩成膏状。然后将浸膏放置于冷冻干燥机中干燥36小时，得到干燥的羊踯躅抗炎活性提取物的粉末1.09g，保存在-20℃冰箱中备用。技术指标为浸膏得率30％以上；浸膏冷冻干燥后的干燥粉末得率达10％以上。2细胞培养：本发明选用小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院典型培养物保藏委员会细胞库。RAW264.7巨噬细胞在37℃、5％CO2的培养条件下，用含有10％的胎牛血清的、青霉素100UmL、链霉素100μgmL的DMEM培养基培养。3羊踯躅提取物的用药浓度评估细胞毒性试验：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中，密度为3×104个细胞孔，37℃、5％CO2条件下培养12小时。然后用不同浓度0、5、10、30、50、100、200、400μgmL的羊踯躅提取物处理24小时，每个浓度设置三个复孔。24小时后，弃上清，用PBS冲洗两次，将10μLMTT5mgmL和90μLDMEM加入到每个孔中继续培养。4小时后弃上清，并在每个孔中加入150μLDMSO，以酶标仪于波长570nm处测定每孔OD值。抑制率％＝细胞对照组光吸收值-药物组光吸收值细胞对照组光吸收值x100％结果表明，羊踯躅叶片甲醇提取物的浓度在小于等于200μgmL以下时，细胞活性达95％以上，表明浓度低于200μgmL提取物对细胞没有明显的毒性，100-200μgmL的药物浓度可用于后续实验图1。4羊踯躅提取物抗炎活性的细胞检测模型构建及一氧化氮NO浓度测定：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔板，调整细胞浓度为5×105细胞孔，在37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。12小时后去上清，除空白组外其余各组加入含有LPS1μgmL的DMEM培养基刺激RAW264.7细胞建立炎症模型。2小时后加入不同浓度的提取物，37℃、5％CO2孵育24小时，培养结束后取细胞培养上清液100μL转置干净的96孔板中。分别加入Griess试剂A液和B液各50μL，避光显色10分钟，540nm下用酶标仪测各孔吸光度OD值，重复3次。结果表明在给予LPS刺激后的RAW264.7细胞炎症因子NO分泌量较空白对照显著升高近9倍，表明该细胞炎症模型建模成功图2。随后在添加羊踯躅叶甲醇提取物在100和200μgmL时，LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO显著下降，抑制率分别为51％和68％，表明100μgmL以上的羊踯躅提取物具有较好的抗炎活性。5羊踯躅提取物抑制炎症因子的分析方法：取长至70％-80％的RAW264.7细胞接种于24孔板，密度为5×105个细胞mL，每孔1mL，37℃、5％CO2培养过夜。12小时后吸去上清液，除空白组外其余各组加入含有LPS1μgmL的DMEM培养基，2小时后实验组加入不同浓度的提取物，空白组和LPS组加入相应的DMSO，37℃、5％CO2培养24小时。培养结束后取上清，用ELISA试剂盒测按说明书操作测上清中TNF-α和IL-1β含量。结果表明在给予LPS刺激后的RAW264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-1β分泌量明显升高，表明该细胞炎症模型建模成功图3。然后给予羊踯躅叶甲醇提取液的实验组TNF-α和IL-1β分泌含量显著下降，在100μgmL的浓度时对TNF-α和IL-1β的抑制率分别为47％和50％，表明羊踯躅叶甲醇提取物对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-1β有显著地抑制活性。6羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的分析方法：取长至70％-80％的RAW264.7细胞1×106细胞孔接种于6孔板中，37℃、5％CO2培养过夜。12小时后吸去上清液，除空白组外其余各组加入含有LPS1μgmL的DMEM培养基预处理细胞2小时，然后用不同浓度的提取物处理细胞。37℃和5％CO2孵育12小时后，除去上清，将六孔培养板至于冰盒上，用4℃预冷的PBS冲洗细胞3次，加入1mL的Trizol裂解液裂解细胞，吹打混匀并转移到无RNA酶的离心管中静置5分钟，加入300μL的氯仿，剧烈震荡15秒，静置15分钟，然后4℃、12000转离心15分钟。取上清加600μL异丙醇轻轻震荡15秒，-20℃静置30分钟，然后4℃、12000转离心10分钟。弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇洗涤，然后4℃、12000转离心5分钟。去上清，吸净残余乙醇，自然干燥，后加入RNA溶解液溶解RNA，-80℃保存，备用。用反转录系统试剂盒PROMEGA，美国根据操作步骤将RNA反转录成cDNA。运用实时荧光定量试剂盒对TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS的mRNA的表达水平进行定量。该反应体系共20μL，10μL的PremixExTaqII、0.4μL的ROX染料、0.8μL的引物、1μL的cDNA模板和6μL的H2O进行反应，PCR循环如下：95℃1分钟，95℃15秒60℃30秒40个周期，每组测试三次。用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2-△△CT计算基因的表达水平。结果表明在给予LPS刺激后的RAW264.7细胞炎症相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS的表达水平显著升高，在LPS的刺激下RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS的mRNA水平较空白组分别上升5.5、1528、1257、152、420倍，表明LPS刺激RAW264.7细胞炎症模型建模成功图4。然后给予羊踯躅叶甲醇提取液的实验组炎症相关基因表达量显著下降，在100μgmL的浓度时对TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS的表达量分别降低到1.5、76、84、26、30倍。进一步说明羊踯躅叶甲醇提取物对LPS刺激的RAW264.7炎症细胞具有较好的抗炎活性。

权利要求：1.一种检测羊踯躅提取物抗炎活性的方法，包括以下步骤：1将新鲜的羊踯躅叶片清洗干净，冷冻干燥后粉碎，得到羊踯躅叶片粉末；用甲醇溶液回流提取羊踯躅叶片粉末，得到羊踯躅叶的甲醇提取液；将羊踯躅叶的甲醇提取液过滤，再将滤液用旋转蒸发仪在45～50℃条件下浓缩成膏状，然后将浸膏冷冻干燥成粉末，用二甲亚砜将粉末溶解，得到羊踯躅提取物；2羊踯躅提取物的用药浓度评估：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时，再用不同浓度的羊踯躅提取物处理并再培养24小时；然后检测羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的细胞毒性作用，从而得出不同浓度的羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的毒性；3羊踯躅提取物抗炎活性的细胞检测模型构建及一氧化氮浓度测定：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中，培养12小时后去上清；加入含有脂多糖的DMEM培养基刺激RAW264.7细胞建立炎症模型；2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物，孵育24小时，检测培养液中一氧化氮的浓度，从而得出羊踯躅提取物对一氧化氮的抑制率；4羊踯躅提取物抑制炎症因子的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时；加入脂多糖与RAW264.7细胞共培养，2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物共培养24小时；测定细胞培养液中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的浓度，从而得出羊踯躅提取物抑制RAW264.7细胞分泌的炎症因子活性；5羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育过夜；并用脂多糖预处理细胞2小时，然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时；收集细胞并提取细胞总RNA，反向转录RNA，对基因表达水平进行定量，用β-actin基因的表达水平进行归一化，并计算基因的表达水平，从而得出羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1中，用甲醇溶液回流提取羊踯躅叶片粉末三次，每次1.5小时。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤2中，用四唑盐比色法检测羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的细胞毒性作用，确定细胞抗炎检测的用药浓度应小于等于200μgmL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤3中，用一氧化氮检测是试剂盒检测培养液中一氧化氮的浓度；添加羊踯躅叶提取物100μgmL以上时，NO抑制率大于50％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤4中，用酶联免疫吸附法试剂盒测定细胞培养液中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的浓度，添加100μgmL提取物后，细胞炎症因子TNF-α和IL-1β的抑制率大于40％。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤5中，收集细胞用Trizol提取细胞总RNA，用反转录系统试剂盒反向转录RNA，运用实时荧光定量试剂盒对基因表达水平进行定量，用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2-△△CT计算基因的表达水平，添加羊踯躅叶提取物100μgmL后，显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS基因的表达。7.一种羊踯躅提取物的应用，其特征在于：所述的羊踯躅提取物用于抑制炎症。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的羊踯躅提取物用于制备风湿性关节炎药物。

百度查询： 江西师范大学 一种羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用

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