申请/专利权人：加拿大国家研究委员会

申请日：2017-05-31

公开（公告）日：2019-04-02

公开（公告）号：CN109563517A

主分类号：C12N15/54(2006.01)I

分类号：C12N15/54(2006.01)I;C12N9/10(2006.01)I;C12N15/60(2006.01)I;C12N9/88(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N5/10(2006.01)I;A01H5/10(2018.01)I;A01H6/20(2018.01)I;A23D9/00(2006.01)I;A23L33/115(2016.01)I;C12P7/64(2006.01)I

优先权：["2016.06.01 US 62/344,071"]

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2023.02.03#发明专利申请公布后的视为撤回;2019.06.21#实质审查的生效;2019.04.02#公开

摘要：提供了脂肪酸及其产生方法。还提供了用于产生脂肪酸的转基因生物、微生物、植物、种子和细胞以及相关的表达载体、噬菌体、质粒、核酸和酶。详细描述了用于产生脂肪酸诸如二十二碳二烯酸和二十二碳三烯酸的方法，包括菟葵欧洲菟葵EhELO1延伸酶的用途。

主权项：1.一种编码延伸酶的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：i与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；iiSEQ ID NO:5的密码子简并核苷酸序列；iii如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；iv编码与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽的核苷酸序列；或v编码具有SEQ ID NO:4的保守取代的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

全文数据：菟葵脂肪酸延伸酶及其在脂肪酸生产中的用途发明领域本发明总的来说涉及脂肪酸及其生产。更具体地，本发明涉及长链和极长链不饱和脂肪酸诸如二十二碳二烯酸DDA和二十二碳三烯酸DTA，以及与其生产相关的转基因生物、植物、种子、细胞、表达载体、噬菌体、质粒、核酸和酶。背景极长链-多不饱和脂肪酸VLC-PUFA或VLCPUFA是细胞膜的组分，并且是人和动物中生物活性化合物的前体。已经提出膳食补充VLCPUFA可以提供保护而抵御慢性疾病，增强眼睛和大脑的性能，并促进人和动物的整体健康和良好状况。然而，常规VLCPUFA市场主要集中在少数ω-3和ω-6VLCPUFA诸如二十碳五烯酸20:5n-3,EPA、二十二碳六烯酸22:6n-3,DHA和花生四烯酸20:4n-6,ARA。二十二碳二烯酸22:2n-6,DDA是一种ω-6脂肪酸，长度为22个碳，在13位与16位具有两个顺式双键。最近有报道称这种脂肪酸可能是哺乳动物DNA聚合酶和拓扑异构酶对于DNA复制、修复以及癌症发展和进展中牵涉的重组至关重要的两种酶Yonezawa等，2006,InternJMolMedicine18:583-588的强抑制剂。另外，还提出该脂肪酸对人II型环加氧酶COX-II一种负责诱导炎症的主要同种型具有抑制活性。例如，潜在的抗炎和抗增殖特性使这种脂肪酸成为VLCPUFA营养保健品的有吸引力的靶标Henry等，2002,JAgriFoodChem,50:2231-2234，并表明DDA可具有潜力作为抗氧化剂、炎症控制剂以及作为治疗炎症性病症诸如关节炎、过敏和或免疫系统病症的营养辅助疗法。还有人提出，DDA可能具有减少与心血管疾病相关的疼痛和炎症的潜力。然而，在自然界中尚不知晓这种脂肪酸的可容易获得的丰富来源。其不是由标准油籽作物诸如芸苔属Brassica或亚麻荠属Camelina产生的，也未报道为目前可获得的食用油产品的组分。二十二碳三烯酸22:3-13,16,19，在本文中称为DTA，是一种ω-3脂肪酸，其长度为22个碳，在13、16和19位具有3个顺式双键。DTA因其相似的结构仅添加了一个双键而可能具有与DDA类似的药物性质。这种脂肪酸没有已知的天然来源。欧洲菟葵Eranthishyemalis菟葵winteraconite是毛茛科Ranunculaceae的一种小块茎多年生草本植物，可以在鳞茎和种子中产生DDAAitzetmuller等，1996,Lipids,312:201-205，尽管这种脂肪酸的生物合成机制仍然未知。然而，由于低产量、低油含量和低适应性农艺性质，这种野生植物物种不适合这种脂肪酸的农业生产。菟葵不产生DTA。通常，长链PUFA和VLCFA似乎具有重要的生物学功能。长链PUFA通常存在于生物组织包括动物包括人的脑、眼睛和精子中。VLCFA被发现为细胞脂质的成分诸如鞘脂和甘油磷脂，但也是具有广泛生物学功能的重要脂质介质的前体。多种遗传性疾病诸如鱼鳞病、黄斑变性、肌病、精神发育迟滞和脱髓鞘，是由负责制造VLCFA的基因中的缺陷引起的。因此，制备和补充极长链脂肪酸的能力可提供治疗疾病的机会。除了较长的PUFA之外，PUFA诸如24:6n-3、24:5n-3和24:5n-6是组织诸如视网膜的重要组分，而单不饱和VLCFA构成神经系统的鞘磷脂的大组分。这些脂肪酸的生物学重要性刚刚开始被了解，但它们作为补充剂和治疗剂可能具有相当大的潜力。因此，需要替代的、另外的和或改进的长链和极长链不饱和脂肪酸产物和或其制备方法。发明概述提供了与延伸酶、编码该酶的核酸分子以及该酶和核酸分子任选地与第二延伸酶或编码第二延伸酶的核酸分子组合产生长链和极长链的不饱和和多不饱和脂肪酸的应用相关的各种实施方案。第一实施方案是编码延伸酶的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；SEQIDNO:5的密码子简并核苷酸序列；SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽的核苷酸序列；或编码具有SEQIDNO:4的保守取代的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另外的实施方案中，核酸分子包含与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列具有至少85％或至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包含SEQIDNO:5。在另一个实施方案中，核酸分子包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少90％或至少95％序列同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子编码包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽。另一个实施方案是分离的延伸酶，其包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，包含SEQIDNO:4的保守取代的氨基酸序列，或包含由上述核酸分子编码的氨基酸序列。在另外的实施方案中，分离的延伸酶包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，分离的延伸酶包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，分离的延伸酶由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成。另外的实施方案是包含如上所述的核酸分子的表达载体、噬菌体或质粒。在另外的实施方案中，所述表达载体、噬菌体或质粒还包含编码第二延伸酶的第二核酸分子，其中由第二核酸分子编码的第二延伸酶：是块状耳霉Conidiobolusthromboides延伸酶CtELO6，或其功能变体；由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。又一个实施方案是包含如上所述的核酸分子的转基因生物。在一个实施方案中，转基因生物还包含编码如上所述的第二延伸酶的第二核酸分子。其中由第二核酸分子编码的第二延伸酶：是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。在一个实施方案中，转基因生物是植物。在另外的实施方案中，植物是油籽植物。在一个实施方案中，植物是欧洲油菜Brassicanapus、芥菜型油菜Brassicajuncea、埃塞俄比亚芥Brassicacarinata、甘蓝Brassicaoleracea、黑芥Brassicanigra、芜菁Brassicarapa、白芥Sinapisalb、荠蓝Camelinasativa、琉璃苣borage琉璃苣属的种Boragosp.、亚麻亚麻属的种Linumsp.、大豆大豆属Glycine和Solasp.、向日葵向日葵属的种Helianthussp.、棉花棉属的种Gossypiumsp.、玉米玉蜀黍Zeamays、橄榄木犀榄属的种Oleasp.、红花红花属的种Carthamussp.、可可可可树Theobromacacoa或花生花生属的种Arachissp.。在另一个实施方案中，植物是荠蓝Camelinasativa或埃塞俄比亚芥Brassicacarinata。在一个实施方案中，转基因生物是微生物。在一个实施方案中，微生物是酵母、真菌、细菌或藻类。在另外的实施方案中，微生物是酵母，所述酵母是解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica、产脂内孢霉Endomycesvernalis、瘦弱红酵母Rhodotorulagracilis、粘红酵母Rhodotorulaglutinis、禾本红酵母Rhodotorulagraminis、圆红冬抱酵母Rhodosporidiumtoruloides、斯达氏油脂酵母Lipomycesstarkeyi、产油油脂酵母Lipomyecslipofer、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae或油性丝孢酵母Trichosporonoleaginous。在另一个实施方案中，微生物是真菌，所述真菌是破囊壶菌属的种Thaustochytriumsp.、裂殖壶菌的种Schizochytriumsp.、日本壶菌属的种Japonochytriumsp.、网粘菌属的种Labyrinthulasp.或吾肯氏壶菌属的种Ulkeniasp.。在另一个实施方案中，微生物是藻类，所述藻类是寇氏隐甲藻Crypthecodiniumcohnii、链状膝沟藻Conyaulaxcatenella、多边膝沟藻Conyaulaxpolyedra、简单螺沟藻Gyrodiniumsimplex、寇氏裸甲藻Gyrodiniumcohnii,球等鞭金藻Isochysisgalbana、鲁兹巴夫藻Pavlovalutheri、强壮前沟藻Amphidiniumcarteri、卵形隐藻Cryptomonasovata、尼氏裸甲藻Gymnodiniumnelsoni、心形原甲藻Prorocentrumcordatum、假微型海链藻Thalassiosirapseudonana或三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum。另一个实施方案是遗传修饰的种子，其包含如上所述的核酸分子。在一个实施方案中，所述遗传修饰的种子是欧洲油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥、甘蓝、黑芥、芜菁、白芥、荠蓝、琉璃苣琉璃苣属的种、亚麻亚麻属的种、大豆大豆属和Solasp.、向日葵向日葵属的种、棉花棉属的种、玉米玉蜀黍、橄榄木犀榄属的种、红花红花属的种、可可可可树或花生花生属的种种子。在另外的实施方案中，所述遗传修饰的种子是荠蓝或埃塞俄比亚芥种子。在另一个实施方案中，种子包含编码第二延伸酶的第二核酸分子，其中由第二核酸分子编码的第二延伸酶：是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或包含SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。另一个实施方案是遗传修饰的细胞，其包含如上所述的核酸分子。在一个实施方案中，所述遗传修饰的细胞是欧洲油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥、甘蓝、黑芥、芜菁、白芥、荠蓝、琉璃苣琉璃苣属的种、亚麻亚麻属的种、大豆大豆属和Solasp.、向日葵向日葵属的种、棉花棉属的种、玉米玉蜀黍、橄榄木犀榄属的种、红花红花属的种、可可可可树或花生花生属的种细胞。在另外的实施方案中，遗传修饰的细胞是荠蓝或埃塞俄比亚芥细胞。在另一个实施方案中，细胞包含编码第二延伸酶的第二核酸分子，其中由第二核酸分子编码的第二延伸酶：是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或包含SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。另一个实施方案是用于产生包含20个或更多个碳的至少一种不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：提供包含如上所述的核酸分子的转基因生物；在转基因生物中表达所述核酸分子；以及使转基因生物产生所述至少一种不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，通过该方法产生的所述至少一种不饱和脂肪酸是C20、C22或C24不饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，通过该方法产生的所述至少一种不饱和脂肪酸是20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；26:1-19脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；24:2-15,18脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；24:3-15,18,21脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；22:3-10,13,16脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；24:4-12,15,18,21脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；24:4-9,12,15,18脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；24:5-9,12,15,18,21脂肪酸；24:6-6,9,12,15,18,21脂肪酸；或其中两种或更多种的组合。在另外的实施方案中，通过该方法产生的所述至少一种不饱和脂肪酸是二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或DDA与DTA的组合。在该方法的一些实施方案中，向转基因生物提供包含EhELO1底物脂肪酸或其前体的原料。在一个实施方案中，原料包含18:1-9脂肪酸；18:1-11脂肪酸；20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；18:2-9,12脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；18:3-9,12,15脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；18:3-6,9,12脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；18:4-6,9,12,15脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；20:4-5,8,11,14脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；20:5-5,8,11,14,17脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；22:6-4,7,10,13,16,19脂肪酸；或其中两种或更多种的组合。在另一个实施方案中，原料包含20:2-11,14脂肪酸或20:3-11,14,17脂肪酸。在一个实施方案中，该方法还包括从转基因生物或其组织或部分中纯化所述至少一种不饱和脂肪酸的一种或多种不饱和脂肪酸的步骤。在一个实施方案中，该方法中使用的转基因生物是油籽植物。在另外的实施方案中，油籽植物是欧洲油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥、甘蓝、黑芥、芜菁、白芥、荠蓝、琉璃苣琉璃苣属的种、亚麻亚麻属的种、大豆大豆属和Solasp.、向日葵向日葵属的种、棉花棉属的种、玉米玉蜀黍、橄榄木犀榄属的种、红花红花属的种、可可可可树或花生花生属的种。在另一个实施方案中，油籽植物是荠蓝或埃塞俄比亚芥。在一个实施方案中，该方法中使用的转基因生物是微生物。在一个实施方案中，微生物是酵母、真菌、细菌或藻类。在另外的实施方案中，微生物是酵母，所述酵母是解脂耶氏酵母、产脂内孢霉、瘦弱红酵母、粘红酵母、禾本红酵母、圆红冬抱酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母、酿酒酵母或油性丝孢酵母。在另一个实施方案中，微生物是真菌，所述真菌是破囊壶菌属的种、裂殖壶菌的种、日本壶菌属的种、网粘菌属的种或吾肯氏壶菌属的种。在另一个实施方案中，微生物是藻类，所述藻类是寇氏隐甲藻、链状膝沟藻、多边膝沟藻、简单螺沟藻、寇氏裸甲藻、球等鞭金藻、鲁兹巴夫藻、强壮前沟藻、卵形隐藻、尼氏裸甲藻、心形原甲藻、假微型海链藻或三角褐指藻。在另一个实施方案中，转基因生物是油质转基因生物，其产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸、18:2-9,12脂肪酸、18:3-9,12,15脂肪酸，或其中一种或多种的组合。在该方法的另一个实施方案中，所述转基因生物表达第二延伸酶，其产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者。在一个实施方案中，第二延伸酶：是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。另一个实施方案是用于从底物原料产生包含20个或更多个碳的至少一种不饱和脂肪酸的离体方法，该方法包括：提供底物原料，所述底物原料包含EhELO1底物脂肪酸；将底物原料暴露于如本文所述的延伸酶；并且使延伸酶产生所述至少一种不饱和脂肪酸。在所述离体方法的一个实施方案中，底物原料包含18:1-9脂肪酸；18:1-11脂肪酸；20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；18:2-9,12脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；18:3-9,12,15脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；18:3-6,9,12脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；18:4-6,9,12,15脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；20:4-5,8,11,14脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；20:5-5,8,11,14,17脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；22:6-4,7,10,13,16,19脂肪酸；或其中两种或更多种的组合。在另外的实施方案中，原料包含20:2-11,14脂肪酸或20:3-11,14,17脂肪酸。在另一个实施方案中，所述离体方法包括纯化步骤以纯化由该方法产生的所述至少一种不饱和脂肪酸的一种或多种不饱和脂肪酸。在所述离体方法的另一个实施方案中，产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者的第二延伸酶用于使底物原料富集20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者。在一个实施方案中，第二延伸酶：是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。另一个实施方案是如上所述的核酸分子用于产生包含20个或更多个碳的不饱和脂肪酸的用途。在一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸是C20、C22或C24不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，所述核酸分子用于产生20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；26:1-19脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；24:2-15,18脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；24:3-15,18,21脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；22:3-10,13,16脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；24:4-12,15,18,21脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；24:4-9,12,15,18脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；24:5-9,12,15,18,21脂肪酸；24:6-6,9,12,15,18,21脂肪酸；或其中两种或更多种的组合。在另外的实施方案中，所述核酸分子用于产生二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或DDA和DTA的组合。另一个实施方案是由如上所述的转基因生物产生的油产品，所述油产品包含二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或其混合物。在一个实施方案中，油产品由如上所述的转基因植物产生。在另一个实施方案中，通过如上所述的方法或离体方法生产所述油产品。附图说明和序列表参考以下描述和附图将更好地理解本发明的特征、方面和优点，其中：图1显示欧洲菟葵中DDA的假设的潜在生物合成途径；图2显示从补充有二十碳二烯酸20:2-11,14的酵母转化体获得的脂肪酸甲酯的气相色谱分析，所述酵母转化体含有EhELO1pYES2.1EhELO1或pYES2.1对照；图3显示与已知标准DDA22:2:13,16-标准品，下图相比，来自在表达EhELO1pYES2.1EhELO1，上图的酵母转化体中发现的第二个新峰的脂肪酸甲酯的质谱；图4显示用于产生转基因荠蓝和拟南芥的含有在napin启动子下的EhELO1和DsRed2的植物表达载体DE质粒；图5显示通过种子特异性表达EhELO1在荠蓝中产生DDA。A从表达EhELO1的转基因亚麻荠制备的脂肪酸甲酯的GC分析。B从亚麻荠对照制备的脂肪酸甲酯的GC分析；图6显示通过EhELO1的种子特异性表达在拟南芥fad3突变体中产生DDA。A从三个独立的表达EhELO1转基因拟南芥制备的脂肪酸甲酯的GC分析。B从拟南芥对照制备的脂肪酸甲酯的GC分析；图7显示用于产生转基因埃塞俄比亚芥的含有在napin启动子下的EhELO1和PPT草胺膦选择标记的植物表达载体；图8显示与未转化的野生型相比，来自EhELO1转基因埃塞俄比亚芥种子的总脂肪酸的气相色谱图；和图9显示含有在napin启动子下的EhELO1、DsRed2和CtELO6的植物表达载体DEE6质粒。以下是文件中出现的序列表：SEQIDNO:1是具有以下序列的引物：TCTAGAATGGAGTCCATTTCTGCTAGSEQIDNO:2是具有以下序列的引物：TCTAGATTAAACCAGCTTCTTATCCTTGSEQIDNO:3是欧洲菟葵EhELO1的全长cDNAatgcttccttcatttgtttcaaaaATGGAGTCCATTTCTGCTAGTGTACGCTACTGGCTAGTAGAACACCCATTGGTGAGCGGATTCGAGTGGATAGAAGGCGAAACATTTGGTTCATCGCCAAAATTTCTTCTAACCACGGTAGCCACCTACCTCTCCCTAACCTACATCCTCTCCATCACCCTTCTTTCACCGAAACCTCCAGTGAAAACCCCCTCCAAGACCCTTACCATCCTCCGGTCTATCTCCGCAATACATAACCTGATTCTCCTTGCCCTCTCCTTCATAATGGCCTTGGGAGCGACATTAGCAACCACCACCAAAATGCCAAGCAAGCAATGGATCTGTTTCCCAGCAAACAAAACCCGATCACAGGGTCCACTATTTTTCTGGGCTTATGTGTTCTACCTATCCAAGATACTTGAATACGTAGATACCCTCTTGATCATCCTCCACAACGACGCAAGGAGACTCACATTTCTCCATGTCTACCATCACACTGTTGTTACTATCATGTGTTACCTTTGGCTACACACTACACAATCTCTCTTACCTTTGGGGATTGTTACCAATGCCACCGTGCATACTGTCATGTATGCTTATTATTTCATGTGCACACTTGGGAAAAGGCCATCTTGGAAGAGGTTAGTGACAGATTTCCAGATCATTCAGTTTTGGTTTGGTCTCGGGATCTCCACGTTGATGTTGTGGTTCCATTTTACTGGAACTGGCTGCTCTGGGATTTGGGGATGGGGTTTTTCTTATGTCTTCAATGCTTCTCTTCTTGCTCTATTTAGTGCTTTTCATGCTAACAACTACGCCAACAAGGACAAGGATAAGAAGCTGGTTTAActgcctatttatggggtctattcgtgtggctatatcaccatcccacgcgatcagaatctatttaggatatccttgtatcaataagttaagtttgtttSEQIDNO:4是EhELO1脂肪酸延伸酶多肽的氨基酸序列：MESISASVRYWLVEHPLVSGFEWIEGETFGSSPKFLLTTVATYLSLTYILSITLLSPKPPVKTPSKTLTILRSISAIHNLILLALSFIMALGATLATTTKMPSKQWICFPANKTRSQGPLFFWAYVFYLSKILEYVDTLLIILHNDARRLTFLHVYHHTVVTIMCYLWLHTTQSLLPLGIVTNATVHTVMYAYYFMCTLGKRPSWKRLVTDFQIIQFWFGLGISTLMLWFHFTGTGCSGIWGWGFSYVFNASLLALFSAFHANNYANKDKDKKLVSEQIDNO:5是EhELO1脂肪酸延伸酶基因的cDNA序列的编码序列：ATGGAGTCCATTTCTGCTAGTGTACGCTACTGGCTAGTAGAACACCCATTGGTGAGCGGATTCGAGTGGATAGAAGGCGAAACATTTGGTTCATCGCCAAAATTTCTTCTAACCACGGTAGCCACCTACCTCTCCCTAACCTACATCCTCTCCATCACCCTTCTTTCACCGAAACCTCCAGTGAAAACCCCCTCCAAGACCCTTACCATCCTCCGGTCTATCTCCGCAATACATAACCTGATTCTCCTTGCCCTCTCCTTCATAATGGCCTTGGGAGCGACATTAGCAACCACCACCAAAATGCCAAGCAAGCAATGGATCTGTTTCCCAGCAAACAAAACCCGATCACAGGGTCCACTATTTTTCTGGGCTTATGTGTTCTACCTATCCAAGATACTTGAATACGTAGATACCCTCTTGATCATCCTCCACAACGACGCAAGGAGACTCACATTTCTCCATGTCTACCATCACACTGTTGTTACTATCATGTGTTACCTTTGGCTACACACTACACAATCTCTCTTACCTTTGGGGATTGTTACCAATGCCACCGTGCATACTGTCATGTATGCTTATTATTTCATGTGCACACTTGGGAAAAGGCCATCTTGGAAGAGGTTAGTGACAGATTTCCAGATCATTCAGTTTTGGTTTGGTCTCGGGATCTCCACGTTGATGTTGTGGTTCCATTTTACTGGAACTGGCTGCTCTGGGATTTGGGGATGGGGTTTTTCTTATGTCTTCAATGCTTCTCTTCTTGCTCTATTTAGTGCTTTTCATGCTAACAACTACGCCAACAAGGACAAGGATAAGAAGCTGGTTTAASEQIDNO:6是EhELO1脂肪酸延伸酶基因的cDNA序列的密码子优化的编码序列，其中密码子优化根据芸苔属中的密码子用法来进行：ATGGAGTCCATCTCTGCAAGCGTCCGTTATTGGCTTGTAGAGCACCCACTTGTGTCAGGATTCGAGTGGATCGAGGGAGAGACTTTTGGTTCTTCTCCAAAATTTTTGCTGACCACTGTGGCTACTTATCTATCGTTAACGTATATTCTGTCCATCACTCTTCTCTCTCCTAAACCGCCTGTCAAAACACCGTCTAAGACTCTTACGATCTTAAGATCTATTAGCGCTATTCACAACTTGATCTTGTTGGCTCTTAGTTTTATCATGGCACTTGGAGCAACATTGGCGACAACTACCAAGATGCCCAGCAAGCAATGGATCTGTTTCCCGGCTAACAAGACCAGGAGCCAGGGTCCATTGTTCTTCTGGGCATACGTTTTTTATCTAAGTAAAATCCTGGAATACGTCGATACCCTCCTTATAATCCTCCACAACGACGCGAGGAGACTAACTTTTTTGCATGTGTATCACCACACTGTGGTTACCATCATGTGTTATTTGTGGCTTCATACTACCCAATCACTTTTGCCCTTAGGAATAGTTACAAACGCCACAGTGCATACCGTAATGTACGCTTACTACTTCATGTGTACCCTGGGAAAACGTCCATCTTGGAAGAGACTAGTCACAGATTTCCAAATTATCCAATTCTGGTTTGGTCTCGGGATCTCGACCCTTATGCTCTGGTTTCACTTCACAGGCACTGGTTGTAGCGGAATCTGGGGTTGGGGATTTTCATACGTCTTTAACGCTTCCTTGTTGGCTCTATTCAGTGCTTTCCATGCAAACAACTACGCCAACAAGGACAAGGATAAGAAGCTAGTCTGATSEQIDNO:7是块状耳霉CtELO6的编码区cDNAATGAGTTTATTAAATACATTGGATACTATTACTTCAAGCAATAATGTTGTATCAGCATACAACGATGCCCCAGTAGACTATTTAATTAAAGTAGTAGATTTAGCTTTAACTGCTAACAAAGCAGTCTTCAATGTTATAGAAGCCAAAGTTAACGTATGGATGCCAACATTGATGATAAACTTAAGAGAACAGGTCTCTAATTTAATCTCACCAATAAGTAAATACTTGCCATTGTTAGATCCTATCGAAGTGTTTTCTATCTTGTTTTTATATATCTTTGTTGTGTTTTTTTGGCTCAAAGTAGCTTCTAGCTTCCTCCCACGTTTCGAAGTAAGATTATTTTCCCTTTTCCATAATTTCTGTATGGTCGTTTTATCCGCCTATATGTGCTCTTCCATCCTATTACAAGCTTATGCAGATAAGTATATTCTATTCACTAACCCCGTCGATCACTCTCCAAATGGTATTCCAATGGCTAAAATAATATGGTTATTTTATATTTCCAAAATCCCAGAGTTCGTTGACACTATGATCATGTTGGTTAAACAAAACTACCGCCAAATCTCCTTTTTACATGTCTACCATCATAGTTCGATCTTTGCTATTTGGTGGATTGTTACCTTGATGGCACCAAATGGTGATGCTTATTTCTCAGCTGCATTGAACTCATTTATTCATGTTGTTATGTACGGATATTATTTACTCTCTGCACTTGGATTCAAATCCGTCTCCTTTGTTAAGAAATATATTACTATGGGACAAATGACTCAATTTGCACTCAACTTTGTTCAAGCTAGTTATAATATTGTAGACAGAAATTACTTACGTCCACAAGTCCATGAGCAAGGATTAGCCTATCCTTATGCTCTTTCCGTTTTACTTTGGTTCTATATGATCTCTATGTTGGTGTTATTCGCTAACTTTTATATTCAAGATCGTATCCGTCAATCAAAGTTAAAGTCTCAACAAAAGGGAAAGAAAATGAATTAG详述以下描述是仅作为示例的特定实施例，并且旨在供本领域技术人员使用。本文的实施例和实施方案旨在作为非限制性实施例和实施方案。本文描述了长链和极长链脂肪酸，及其制备方法。脂肪酸链的长度不同，并且可以通过脂肪族尾部中的碳数来表征。如本文中所用，“长链”脂肪酸具有拥有13至21个碳的脂肪族尾部，“极长链”脂肪酸具有拥有22个或更多个碳的脂肪族尾部。脂肪酸还可表征为饱和或不饱和的。饱和脂肪酸在碳原子之间不含任何双键，而不饱和脂肪酸在碳原子之间具有一个或多个双键。如本文中所用，术语“不饱和脂肪酸”旨在包括在脂肪酸链内包含一个或多个双键的任何脂肪酸。为了更清楚，如本文中所用，“不饱和脂肪酸”包括单不饱和脂肪酸在脂肪酸链内仅包含一个双键的脂肪酸和多不饱和脂肪酸在脂肪酸链内包含两个或更多个双键的脂肪酸。脂肪酸终止于一端α末端的羧基COOH和相对末端ω末端的甲基CH3。脂肪酸中碳原子的位置从脂肪酸的羧基末端或甲基末端计数，其中COOH或CH3基团的碳被指定为位置1。当碳原子位置从CH3末端提供时，其是使用n-x、ω-x或omega-x命名法提供的。例如，ω-3脂肪酸在从脂肪酸的CH3末端算起的第三个碳之后包括双键。有几种命名脂肪酸的系统，包括惯用名，也称为俗名，诸如二十二碳二烯酸DDA；系统名称或IUPAC名称；Δx命名法，其中每个双键由Δx表示，前面是顺式或反式；n-x命名法，也被视为ω-x或omega-x，如上所述；以及通过采用C:Dx形式的脂质编号，其中C是碳原子数，D是双键数，x表示双键的位置，如从脂肪酸的羧基末端开始计数的。例如，22:2-13,16表示具有22个碳和2个双键的脂肪酸，其中双键位于第13个碳与第14个碳之间以及第16个碳与第17个碳之间，如从脂肪酸的COOH末端开始计数的。提供了不饱和长链和极长链脂肪酸，诸如DDA和DTA，以及与其产生相关的转基因生物、植物、种子、细胞、表达载体、噬菌体、质粒、核酸和酶。还考虑了包含这些脂肪酸的营养保健品和功能性食品、药物、补充剂、化妆品和或个人护理产品。下式I中提供了DDA的结构。下式IV中提供了DTA的结构。由于在欧洲菟葵的成熟种子中观察到的DDA的量，本发明人假设DDA生物合成可以在发育中的种子中发生，因此参与DDA生物合成的基因和酶可能在种子发育期间高度表达。不希望受理论束缚，本发明人假设的DDA生物合成的潜在途径示于图1中。通常有两种类型的缩合酶，其通过向脂肪的羧基末端添加两个碳单元来负责脂肪酸的延伸。第一种属于酮酰辅酶A合酶KCS也称为脂肪酸延伸1，FAE1型，另一种属于延伸缺陷型样延伸酶ELO型。潜在途径涉及始于亚油酸18:2-9,12的两个延伸步骤，如图1中的“延伸”步骤所示。本发明人推测这些类型的酶中的一种可以在催化所示的延伸中起作用。先前没有发表过关于在陆地植物中鉴定该多不饱和脂肪酸PUFA延伸步骤的报道。基于假设的潜在途径，缩合酶可以是限速性的，并且可在该途径中涉及的延伸步骤中提供底物特异性。本发明人在本文中假设使用诸如简并RT-PCR克隆和或EST测序和同源性搜索的技术从种子中分离和分析总RNA可以允许鉴定参与DDA合成的先前未知的基因。有人提出，涉及靶向选定的延伸酶的保守结构域的简并引物和来自其他物种的相关序列的RT-PCR技术可用于扩增未知基因的一部分，可能允许通过测序确定其身份。如果由鉴定的部分cDNA编码的氨基酸序列与预测的酶同源，则可采用RACE方法来检索基因的全长序列。还考虑了替代方法，诸如涉及对来自发育中种子的转录物的约500,000个cDNA片段的随机组进行测序的方法，以及使用多种同源性搜索工具来鉴定与来自其他物种的延伸酶同源的候选序列。作为本文进一步描述的实验的结果，候选菟葵基因被鉴定为可能参与DDA生物合成。该基因被称为“EhELO1”其全长cDNA序列在SEQIDNO:3中提供，其cDNA的编码部分在SEQIDNO:5中提供。为了潜在地获得对该候选基因编码的酶的功能、活性水平和或底物特异性的了解，通过克隆该基因并使用其转化酵母酿酒酵母来进行基于酵母的功能研究。由于酵母宿主系统不产生二十碳二烯酸20:2-11,14，EDA脂肪酸底物，因此将该脂肪酸底物提供给酵母。从表达该候选基因的酵母转化体获得的脂肪酸产物的分析证实，那些表达EhELO1的转化体产生DDA，标志着该基因参与DDA产生。这些结果证实，从欧洲菟葵分离的EhELO1编码功能性延伸酶，其负责向EDA的羧基末端添加两个碳单元，产生DDA。然后在植物中进行EhELO1基因的功能性表达研究，以进一步研究DDA、DTA和其他脂肪酸的产生。将菟葵EhELO1在亚麻荠属、拟南芥属和埃塞俄比亚芥中功能性表达。成功观察到DDA或DDA和DTA二者的产生。为了通过菟葵EhELO1延伸酶提供更多20:2-11,14脂肪酸底物以转化为DDA，进一步提出在某些应用中，可将EhELO1延伸酶与来自块状耳霉的延伸酶CtELO6一起使用，后者产生20:2-11,14脂肪酸DDA生物合成的底物。产生植物表达质粒以提供EhELO1延伸酶和CtELO6延伸酶二者。来自菟葵欧洲菟葵的延伸酶基因EhELO1在本文中已被发现参与DDA和DTA以及包含20个或更多个碳的其他不饱和脂肪酸诸如C20、C22和C24不饱和脂肪酸的生物合成。本文描述的结果表明该基因可用于在转基因生物包括植物和或微生物中产生包含20个或更多个碳的不饱和脂肪酸。例如，这种脂肪酸产生可以提供不饱和脂肪酸诸如DDA和或DTA，以用于营养保健品、功能性食品、药品、补充剂、化妆品和或个人护理行业产品和市场。可通过EhELO1延长的底物脂肪酸在本文中称为“EhELO1底物脂肪酸”，并且包括例如以下脂肪酸：18:1-9脂肪酸；18:1-11脂肪酸；18:2-9,12脂肪酸；18:3-9,12,15脂肪酸；18:3-6,9,12脂肪酸；18:4-6,9,12,15脂肪酸；20:1-11脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；20:4-5,8,11,14脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；20:5-5,8,11,14,17脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸和22:6-4,7,10,13,16,19脂肪酸。在一个实施方案中，本文提供了编码延伸酶的核酸分子，所述核酸分子包含：与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；SEQIDNO:5的密码子简并核苷酸序列；SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽的核苷酸序列；或编码具有SEQIDNO:4的保守取代氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。本文还提供了分离的延伸酶，其包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，包含SEQIDNO:4的保守取代的氨基酸序列，或包含由上述核酸分子编码的氨基酸序列。另外还提供了用于产生包含20个或更多个碳的至少一种不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：提供包含如本文所述的核酸分子的转基因生物；在转基因生物中表达所述核酸分子；以及允许所述转基因生物产生所述至少一种不饱和脂肪酸。通过该方法产生的所述至少一种不饱和脂肪酸可以是C20、C22或C24不饱和脂肪酸。例如，所述至少一种不饱和脂肪酸可以是20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；26:1-19脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；24:2-15,18脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；24:3-15,18,21脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；22:3-10,13,16脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；24:4-12,15,18,21脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；24:4-9,12,15,18脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；24:5-9,12,15,18,21脂肪酸；24:6-6,9,12,15,18,21脂肪酸；或其中两种或更多种的组合。所述至少一种不饱和脂肪酸可以是二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或DDA和DTA二者的组合。在转基因生物不产生所述延伸酶的脂肪酸底物或不产生足够量的这种底物的实施方案中，可以向转基因生物提供包含EhELO1底物脂肪酸或其前体的原料。例如，EhELO1底物脂肪酸可包含18:1-9脂肪酸；18:1-11脂肪酸；20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；18:2-9,12脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；18:3-9,12,15脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；18:3-6,9,12脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；18:4-6,9,12,15脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；20:4-5,8,11,14脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；20:5-5,8,11,14,17脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；22:6-4,7,10,13,16,19脂肪酸；或其中两种或更多种的组合。为了促进分别产生DDA或DTA，原料可包含20:2-11,14脂肪酸或其前体，或20:3-11,14,17脂肪酸或其前体。在某些实施方案中，可以选择底物原料以促进转基因生物更多地产生一种脂肪酸而非另一种脂肪酸；例如，DTA多于DTA，反之亦然。例如，富含20:2-11,14脂肪酸和或18:2-9,12脂肪酸的原料可有利于DDA生产，而富含20:3-11,14,17脂肪酸和或18:3-9,12,15脂肪酸的原料可有利于DTA的生产。下面提供分别为式II、V、III和VI的20:2-11,14、20:3-11,14,17、18:2-9,12和18:3-9,12,15EhELO1底物脂肪酸的结构。本领域技术人员将理解，可将延伸酶或其变体作为化学催化剂离体使用，实现底物脂肪酸原料向包含20个或更多个碳任选20、22或24个碳的不饱和脂肪酸的转化。在某些实施方案中，底物原料可包含18:1-9脂肪酸；18:1-11脂肪酸；20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；18:2-9,12脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；18:3-9,12,15脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；18:3-6,9,12脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；18:4-6,9,12,15脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；20:4-5,8,11,14脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；20:5-5,8,11,14,17脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；22:6-4,7,10,13,16,19脂肪酸；或其中两种或更多种的组合。在其他实施方案中，原料可包含20:2-11,14脂肪酸和或20:3-11,14,17脂肪酸。当需要DDA和或DTA产生，以及当原料包含不足的20:2-11,14脂肪酸和或20:3-11,14,17脂肪酸时，可额外地将产生20:2-11,14脂肪、20:3-11,14,17脂肪酸或两者的延伸酶用于使所述原料富集所述脂肪酸。这种延伸酶可以是例如块状耳霉延伸酶CtELO6，或其变体。同样，这些实施方案中的某些还可包括任选的纯化步骤，其中纯化所述至少一种产生的脂肪酸，例如DDA、DTA或两者，以提供分离的脂肪酸或脂肪酸混合物样品，例如分离的DDA样品、分离的DTA样品或分离的DDA和DTA混合物样品。取决于所用的原料，这种纯化步骤可能是想要的。如本文中所用，从起始材料“纯化”的“分离的”脂肪酸或脂肪酸混合物是指相对于从其纯化出所述分离的脂肪酸或脂肪酸混合物的原材料而言，实质上富集了产生的脂肪酸或脂肪酸混合物的样品。如果样品中脂肪酸或脂肪酸混合物的比例相对于样品中的总脂肪酸群增加了至少50％，则可认为富集是实质性的。不要求分离的脂肪酸样品是纯样品，或纯化步骤除去了所有污染物以使脂肪酸或脂肪酸混合物被认为是分离的或纯化的。例如，分离的脂肪酸或脂肪酸混合物对于产生的脂肪酸或脂肪酸混合物可具有90％或更高的纯度。因此，提供了另一个实施方案，其是用于从底物原料产生包含20个或更多个碳的至少一种不饱和脂肪酸的离体方法，所述方法包括：提供底物原料，所述底物原料包含EhELO1底物脂肪酸；将底物原料暴露于如本文所述的延伸酶；并使延伸酶产生所述至少一种不饱和脂肪酸。或者，根据预期的特定应用，可以进一步纯化通过本文所述方法例如但不限于本文所述的离体方法产生的全油产品，以获得富集的或纯的DDA、DTA或其混合物。作为另一个实施方案，提供了转基因生物，其已经修饰而产生包含20个或更多个碳的至少一种不饱和脂肪酸。转基因生物可以是遗传修饰的种子、细胞、转基因植物、植物种子或植物细胞，其包含编码延伸酶的核酸分子，如本文所述。本发明的转基因生物还可任选地包含块状耳霉延伸酶CtELO6基因或其变体。如将理解的，本文提及的转基因生物可以是任何合适的生物体，其可以被遗传修饰以用于异源基因表达。适合用作转基因生物的生物可包括单细胞或多细胞生物。合适的生物的实例可包括例如植物细胞、植物和微生物微生物。实际上，适合用作转基因生物的生物可包括各种类型的植物、真菌、细菌和或藻类。在某些实施方案中，本文提及的转基因生物可以是植物，诸如油籽植物，其经遗传修饰以表达如本文所述的延伸酶，或其功能等同物。在某些实施方案中，转基因生物可以是遗传修饰的欧洲油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥、甘蓝、黑芥、芜菁、白芥、荠蓝、琉璃苣琉璃苣属的种、亚麻亚麻属的种、大豆大豆属和Solasp.、向日葵向日葵属的种、棉花棉属的种、玉米玉蜀黍、橄榄木犀榄属的种、红花红花属的种、可可可可树或花生花生属的种。本申请的发明人已观察到，如本文所述的方法令人惊讶地在一个表达低水平的芥酸和高量的亚油酸和或亚麻酸的埃塞俄比芥品种中产生DDA和DTA。不受理论束缚，有可能这个品种的埃塞俄比亚芥具有可供用于生产DDA和DTA的脂肪酸前体库。因此，本文所述的方法还可能在已培育或改变以表达低水平芥酸的各种芸苔属植物例如，芥菜型油菜、欧洲油菜中很好地起作用。因此，在某些优选实施方案中，转基因生物可以是埃塞俄比亚芥、芥菜型油菜或欧洲油菜。在一个非常优选的实施方案中，转基因生物可以是埃塞俄比亚芥。在某些其他实施方案中，本文提及的转基因生物可以是经遗传修饰以表达如本文所述的延伸酶或其功能等同物的酵母。在某些实施方案中，转基因生物可以是遗传修饰的解脂耶氏酵母、产脂内孢霉、瘦弱红酵母、粘红酵母、禾本红酵母、圆红冬抱酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母、酿酒酵母或油性丝孢酵母。本领域技术人员将认识到酵母不产生用于该方法的底物，因此可以添加脂肪酸底物，如下文进一步描述的。在某些其他实施方案中，本文提及的转基因生物可以是真菌，其经遗传修饰以表达如本文所述的延伸酶或其功能等同物。在某些实施方案中，转基因生物可以是遗传修饰的破囊腔菌属的种、裂殖壶菌的种、日本壶菌属的种、网粘菌属的种或吾肯氏壶菌属的种。本领域技术人员将认识到真菌不产生该方法的底物，因此可以添加脂肪酸底物，如下面进一步描述的。在某些其他实施方案中，本文提及的转基因生物可以是藻类，其经遗传修饰以表达如本文所述的延伸酶或其功能等同物。在某些实施方案中，转基因生物可以是遗传修饰的寇氏隐甲藻、链状膝沟藻、多边膝沟藻、简单螺沟藻、寇氏裸甲藻、球等鞭金藻、鲁兹巴夫藻、强壮前沟藻、卵形隐藻、尼氏裸甲藻、心形原甲藻、假微型海链藻或三角褐指藻。本领域技术人员将认识到藻类不产生用于该方法的底物，因此可以添加脂肪酸底物，如下文进一步描述的。本领域技术人员将清楚用于产生能够异源基因表达的转基因生物的合适技术。实际上，用于产生单细胞或多细胞转基因生物包括动物、植物、真菌、细菌和或藻类单细胞或多细胞转基因生物的合适的克隆和或重组核酸技术在本领域中是公认的。举例来说，可以通过转染、电穿孔、病毒感染或本领域已知的其他合适方法将包含一个或多个拷贝的特定基因各自由合适的启动子序列例如，组成型或诱导型启动子驱动的载体病毒、质粒或其他引入细胞中。用于过表达特定基因或将特定基因导入细胞的合适表达载体技术是本领域已知的参见例如MolecularCloning:ALaboratoryManual第4版,2012,ColdSpringHarborLaboratoryPress。在植物中，可以使用例如土壤杆菌属Agrobacterium介导的植物转化方法。技术人员将能够基于待转基因修饰的生物选择合适的表达载体和或基因导入方法。应理解，基因表达可以指从核酸分子产生多肽。基因表达可以包括转录和翻译过程，因此基因表达可以指核酸分子诸如mRNA的产生即转录，蛋白质的产生即翻译或两者。异源表达是指在天然不具有或表达该核酸分子的生物体中表达该核酸分子。还应理解，细胞中特定核酸分子的过表达可以指与野生型、基线或未处理水平相比增加细胞内特定核酸分子的表达。在将核酸分子插入细胞的背景下引入核酸分子或基因可以指“转染”、“转化”或“转导”，并且可包括将核酸序列整合或引入到真核或原核细胞，其中可任选地将核酸序列整合到细胞基因组中，或瞬时表达例如，转染的mRNA。将核酸分子插入细胞产生了“遗传修饰的”细胞。插入细胞中的核酸分子可称为“外源”核酸分子；意指源自细胞外的核酸分子。外源核酸分子可以源自相同物种或源自与其所引入的生物体不同的物种。可以通过将蛋白质或酶本身递送到细胞中，或通过在细胞内表达编码该蛋白质或酶的mRNA，导致其翻译，从而将蛋白质或酶引入细胞中。如本领域技术人员所知，用于表达特定基因的核苷酸序列可以编码或包括一种或多种合适的特征，如例如“GenesVII”,Lewin,B.OxfordUniversityPress2000或“MolecularCloning:ALaboratoryManual”,Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratory，第3版2001中所述。可将编码多肽或蛋白质的核苷酸序列整合到合适的载体或表达盒诸如商购可得的载体或表达盒中。载体也可以使用标准分子生物学技术，例如Sambrook等ColdSpringHarborLaboratory,3rdedition2001所述的技术来单独构建或修饰。本领域技术人员将认识到载体可包括编码所需元件的核苷酸序列，所述元件可与编码多肽或蛋白质的核苷酸序列可操作地连接。编码所需元件的此类核苷酸序列可包括合适的转录启动子、转录增强子、转录终止子、翻译起始子、翻译终止子、核糖体结合位点，5'-非翻译区、3'-非翻译区、帽结构、poly-A尾和或复制起始点。合适载体的选择可取决于若干因素，包括但不限于待整合到载体内的核酸的大小、所需的转录和翻译控制元件的类型、所需的表达水平、所需的拷贝数、是否需要染色体整合、所需的选择方法的类型，或者意欲待转化的宿主细胞或宿主范围。本文所述的结果表明，本文鉴定的延伸酶可用于在转基因生物包括油籽植物和或微生物中产生包含20个或更多个碳的各种不饱和脂肪酸，包括DDA和或DTA。本文鉴定的全长延伸酶的cDNA核苷酸序列和氨基酸序列，包括5'和3'非翻译区，分别在SEQIDNO:3和4中提供。SEQIDNO:5提供了SEQIDNO:3中提供的全长cDNA核酸序列的编码序列部分。SEQIDNO:6提供了SEQIDNO:3中提供的核酸序列的密码子优化的编码区，针对在芸苔属中表达进行了密码子优化。SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6中的每一个与天然存在的基因组序列不同，并且包括在本发明的范围内。应当理解，延伸酶基因的功能变体是可能的，并且包括在本发明的范围内。延伸酶基因的变体可包括任何合适的核酸分子，其具有与未修饰基因的核苷酸序列不同的核苷酸序列，但仍编码与未修饰的基因产物功能相同或相似的蛋白质。举例来说，应理解遗传密码存在简并性，并且特定氨基酸序列可由不止一种核苷酸序列如下表1中所示编码。因此，在某些实施方案中，延伸酶基因变体可包括任何合适的核酸分子，其包含与SEQIDNO:3或5或6的核苷酸序列不同但仍编码具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，例如所述核苷酸序列的密码子简并形式。在一些实施方案中，序列的密码子简并形式可以根据除欧洲菟葵外的物种的密码子频率进行密码子优化。表1–密码子简并性氨基酸密码子AlaAGCT,GCC,GCA,GCGArgRCGT,CGC,CGA,CGG,AGA,AGGAsnNAAT,AACAspDGAT,GACCysCTGT,TGCGlnQCAA,CAGGluEGAA,GAGGlyGGGT,GGC,GGA,GGGHisHCAT,CACIleIATT,ATC,ATALeuLTTA,TTG,CTT,CTC,CTA,CTGLysKAAA,AAGMetMATGPheFTTT,TTCProPCCT,CCC,CCA,CCGSerSTCT,TCC,TCA,TCG,AGT,AGCThrTACT,ACC,ACA,ACGTrpWTGGTyrYTAT,TACValVGTT,GTC,GTA,GTG起始ATG终止TAG,TGA,TAA作为进一步的实例，应当理解，在某些实施方案中，延伸酶基因变体还可包括编码与SEQIDNO:4的氨基酸序列不同但仍然保持未修饰的基因产物的相同或类似的功能的氨基酸序列的延伸酶基因的突变形式。举例来说，应理解，可以存在一个或多个保守氨基酸取代，其不会实质上影响基因产物的功能。在一些实施方案中，序列可包含1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多15，以上到20个、最多25个、最多30个、最多35个、最多40个、最多45个、最多50个、最多55个、最多60个、最多65个、最多70个、最多75个、最多80个、最多85个、最多90个、最多95个、最多100个或更多个保守氨基酸取代。在某些实施方案中，高达5％、高达10％、高达15％、高达20％、高达25％、高达30％、高达35％、高达40％、高达45％或高达50％的氨基酸可被保守取代。如将认识到的，保守氨基酸取代可包括其中氨基酸取代具有相似性质的另一氨基酸，使得蛋白质的折叠、活性或其他功能不受显著影响的氨基酸取代。可以是可取代的可互换的芳香族氨基酸的实例可包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。可以是可取代的可互换的疏水性氨基酸的实例可包括亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。可以是可取代的可互换的极性氨基酸的实例可包括谷氨酰胺和天冬酰胺。可以是可取代的可互换的碱性氨基酸的实例可包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。可以是可取代的可互换的酸性氨基酸的实例可包括天冬氨酸和谷氨酸。可以是可取代的可互换的小氨基酸的实例可包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。表2中提供了保守氨基酸取代的其他实例。在一些实施方案中，保守取代可限于“非常高度保守”或“高度保守”的氨基酸取代，如表2中所定义。如本文中所用，术语“保守取代的氨基酸序列”意指包含如表2的最右列所定义的一个或多个“保守取代”的氨基酸序列。表2-示例性保守氨基酸取代其他突变诸如插入、缺失或取代也是可能的，只要酶功能不被破坏即可。不影响酶的整体功能的位于酶活性部位外的氨基酸残基的插入或缺失可以是这种变体的实例。在某些实施方案中，延伸酶基因的变体可包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的核苷酸序列，其编码具有与菟葵EhELO1延伸酶SEQIDNO:4的功能相同或类似的功能性的延伸酶。如本文中所提及的，相对于特定序列或其指定的部分的百分比％同一性或％序列同一性可被定义为在将该特定序列的全长或其指定部分与主题序列对齐和必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性如通过程序WU-BLAST-2.0，将搜索参数设置成默认值产生的Altschul等，J.Mol.Biol.1990215:403-410；blast.wustl.edublastREADME.html处的网站后，候选序列中与主题序列或其指定的部分中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。举例来说，百分比同一性值可以通过匹配的相同核苷酸或氨基酸的数量除以将对其报告百分比同一性的序列长度来确定。百分比％氨基酸序列相似性可以通过与用于确定百分比氨基酸序列同一性的计算相同的计算来确定，但是，例如，除了计算中的相同氨基酸之外，还可以包括保守氨基酸取代。寡核苷酸比对算法诸如BLASTGenBank；使用默认参数可用于计算百分比序列同一性。两个核酸序列可以基本相同的另一指征alternativeindication是两个序列在中等严格条件或优选严格条件下彼此杂交。在中等严格条件下与滤膜结合序列的杂交可以例如根据Ausubel等编辑,1989,CurrentProtocolsinMolecularBiology，第1卷，GreenPublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,atp.2.10.3进行。或者，在严格条件下与滤膜结合序列的杂交可以例如根据Ausubel等编辑，1989同上进行。杂交条件可根据已知方法视目标序列而修改参见，例如，Tijssen,1993,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分，第2章"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",Elsevier,NewYork。通常，作为非限制性实例，严格条件可以是比在确定的离子强度和pH下该特定序列的热熔点低约5℃。本文使用的核苷酸、多核苷酸或核酸分子将被理解为在适当时包括呈单体和二聚体所谓的串联形式的双链和单链分子，及其转录产物。应当理解，菟葵EhELO1延伸酶的功能变体是可能的，并且包括在本发明的范围内。菟葵EhELO1延伸酶的变体可以包括任何合适的酶，其具有与SEQIDNO:4中所示的未修饰序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列，但是仍然编码与未修饰的基因产物功能相同或相似的蛋白质。举例来说，应当理解，本文所述的基本上不影响该基因产物功能的一个或多个保守氨基酸取代是可能的。其他突变，诸如插入、缺失或取代，也可以是可能的，只要酶功能不被破坏。在转基因生物本身能够产生足够的延伸酶的脂肪酸底物的实施方案中，可以不需要进一步供应底物脂肪酸。举例来说，转基因生物可以是油质转基因生物，其天然地或作为基因工程的结果而产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸、18:2-9,12脂肪酸、18:3-9,12,15脂肪酸或其组合。在某些另外的实施方案中，转基因生物可以是表达天然地或异源地第二延伸酶的转基因生物，所述第二延伸酶进一步产生底物脂肪酸20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者。举例来说，产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者的第二延伸酶可以是块状耳霉延伸酶CtELO6由SEQIDNO:7编码的多肽或其变体或功能等同物。在另一个实施方案中，本文提供了包含编码延伸酶或其变体的核苷酸序列的核酸分子、表达载体、噬菌体或质粒。在某些实施方案中，本文提供了核酸、表达载体、噬菌体或质粒，其包含与SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的核酸具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％,至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核酸序列。在某些另外的实施方案中，本文提供了核酸、表达载体、噬菌体或质粒，其包含编码与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在某些实施方案中，此类核酸分子、表达载体、噬菌体或质粒还包含编码产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者的延伸酶的核苷酸序列诸如但不限于块状耳霉延伸酶CtELO6基因或其变体。在某些其他实施方案中，可将如本文所述的核酸分子、表达载体、噬菌体或质粒与包含编码产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者的延伸酶的核苷酸序列诸如但不限于块状耳霉延伸酶CtELO6基因或其变体的核酸分子、表达载体、噬菌体或质粒组合使用。合适的延伸酶的实例可以是CTELO6基因，其编码区cDNA序列示于SEQIDNO:7中。块状耳霉延伸酶CtELO6基因的变体包括，例如，与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子和具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子。块状耳霉延伸酶CtELO6酶的变体包括，例如，包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列和由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列的酶。应当理解，还设想了包含一种或多种如本文所述的核酸分子、多肽、表达载体、噬菌体、质粒和或细胞或由其组成的组合物。例如，组合物可另外包含一种或多种生理学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或缓冲剂。还应理解，在另一个实施方案中，本文提供了核酸分子，其包含编码EhELO1延伸酶SEQIDNO:4的cDNA序列，或具有SEQIDNO：5或SEQIDNO:6所示的核苷酸序列的cDNA序列。例如，由于不存在内含子，此类cDNA序列与EhELO1延伸酶基因的天然存在的序列不同。包括在本发明范围内的是以下核酸分子：a作为EhELO1延伸酶基因、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的互补序列的核酸分子；b能够在严格杂交条件下与EhELO1延伸酶基因、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6杂交的核酸分子；或c包含与EhELO1延伸酶基因、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或a、b或c中定义的核酸分子具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的核酸序列的核酸分子。所述核酸分子的特征还在于一系列序列同一性，例如在上述任何两个百分比之间变化的序列同一性。还考虑了中间值，诸如76.6％和93.17％，以及中间值之间的范围。如上所述，目前没有DDA或DTA的商业来源。因此，在另外的实施方案中，本文提供了包含分离的二十二碳二烯酸DDA、分离的二十二碳三烯酸DTA或分离的DDA和DTA混合物的脂肪酸产物，其通过本文所述的任何方法生产。例如，可使用如本文所述的纯化步骤，使用如本文所述的原料富集方法，使用产生如本文所述的富集的脂肪酸底物的转基因生物，或其任何组合来获得分离的DDA、分离的DTA或分离的DDA和DTA的混合物。应理解，如本文所述的脂肪酸产物可用于本领域技术人员已知的任何范围的应用中。举例来说，此类脂肪酸产品可用于营养保健品、药物即抗氧化剂、抗癌剂或抗炎剂、补充剂、化妆品和或个人护理品即口红、保湿剂或化妆品应用。应当理解，转基因生物可以产生长链或极长链不饱和脂肪酸诸如DDA、DTA或两者，作为新型全油的一部分。因此，本文提供了通过本文描述的任何方法或多种方法产生的包含DDA、DTA或两者的全油。全油可以是可食用食品。根据预期的特定应用，这种全油可以直接使用，或者可被进一步纯化以获得富集的或纯的DDA、DTA或其混合物。在某些实施方案中，可采用纯化步骤，其中纯化由转基因生物产生的DDA、DTA或两者，以提供分离的DDA样品、分离的DTA样品或分离的DDA和DTA的混合物样品。这种纯化步骤可涉及除去全油的不想要的组分。例如，可通过蒸馏除去极短链的脂肪酸。此外，当转基因生物产生包含芥酸的全油并且应用于人时，可能需要从全油中减少或除去芥酸的纯化步骤。提供以下实施例用于说明目的，旨在供本领域技术人员使用。应当理解，这些实施例旨在是非限制性的，并且，如本领域技术人员在考虑本文的教导后将会知道的，许多变化和修改是可能的。实施例1：用于组织取样的欧洲菟葵的生长为了获得用于研究的发育中的种子，将欧洲菟葵的球茎种植在土壤中并在4℃下于黑暗中保持一个月。春化后，球茎开始萌发并生长。开花后，对发育中的豆荚进行标记。收获在不同阶段开花后2至3周龄的发育种子并用于随后的研究，包括脂肪酸分析和总RNA分离。实施例2：欧洲菟葵种子的脂肪酸分析使用气相色谱GC分析处于不同发育阶段的欧洲菟葵种子的脂肪酸组成。用玻璃棒压碎散装的发育种子，并使用3N甲醇HCl在80℃下衍生FAME脂肪酸甲酯1小时。用水和己烷萃取总FAME两次。在配备有膜厚度为0.25-μm的DB-23柱30m×0.25mmJ&WScientific的Agilent6890N气相色谱仪上分析2微升的总FAME样品。将柱温保持在160℃持续1分钟，然后以4℃分钟的速率升至240℃。根据真正的脂肪酸标准品的保留时间鉴定脂肪酸。通过GC分析从欧洲菟葵的发育中的种子测定的总脂肪酸组成示于下表3中。如所显示的，发育中的种子以总脂肪酸的约60％的水平产生DDA。因此，这些结果表明获得的种子可用于分离总RNA，以克隆可能编码参与DDA合成的一种或多种延伸酶的基因。表3–从开花后2-3周的欧洲菟葵提取的发育中的种子的总脂肪酸组成脂肪酸组成量％wt16:0+16:1-Δ51.40718:0+18:1-Δ51.40518:1-Δ92.35418:2-Δ9,Δ127.32018:3-Δ9,Δ12,Δ150.66020:0trace20:1-Δ53.85820:1-Δ111.41620:2-Δ11,Δ149.45020:3,Δ5,Δ11,148.53522:1-Δ131.39422:2-Δ13,Δ1659.70322:3-Δ5,Δ13,Δ161.680其它0.818实施例3:RNA分离和测序在欧洲菟葵的发育中的种子中发现的大量DDA脂肪酸22:2-13cis，16cis；高达59.7％表明来自欧洲菟葵的发育中的种子可以是用于鉴定参与DDA的生物合成的基因的良好资源。为了鉴定一种或多种候选基因，在通过RNeasyPlantMini柱纯化之前，首先通过TRIzol试剂Invitrogen分离来自约20粒发育中的种子开花后2-3周的总RNA。通过柱上DNaseI消化步骤用无RNase-的DNase组Qiagen消除基因组DNA污染。使用Bioanalyzer和凝胶电泳确测定总RNA的质量。通过Bioanalyzer测量的该样品的RNA完整性数RIN为9.5，表明RNA样品的质量良好。然后将样品送去进行RNA-seqIllumina测序分析。实施例4：鉴定参与DDA的合成和装配的基因的EST的生物信息学分析、EhELO1cDNA的测序和克隆使用IlluminaRNA测序设备对发育中的种子中的RNA转录物进行测序。序列的生物信息学分析显示，在与ELO样延伸酶同源的基因中发现了两个短的重叠群。该基因命名为EhELO1。第一重叠群包含位于cDNA的5'末端的563bp，包括起始密码子，而第二重叠群包含位于cDNA的3'末端的461bp，包括终止密码子。存在一个376bp的重叠区域。然后使用来自这两个重叠群的该序列信息来获得EhELO1cDNA的全长序列。使用Q5聚合酶，利用根据这两个重叠群的序列信息设计的两个特异性引物DM719:5′-TCTAGAATGGAGTCCATTTCTGCTAG-3′SEQIDNO:1和DM720:5′-TCTAGATTAAACCAGCTTCTTATCCTTG-3′SEQIDNO:2进行全长EhELO1cDNA的PCR扩增。从琼脂糖凝胶中洗脱出828bp预期大小的PCR产物，然后如下所述克隆到pYES2.1酵母表达载体EhELO1pYES2.1中并进行测序。对从三个独立克隆中提取的重组质粒进行测序。测序结果显示EhELO1的ORF编码275个氨基酸的多肽SEQIDNO:4，分子量为31.3kDa。BLAST结果显示该蛋白质与GNS1SUR4膜蛋白家族拟南芥AT3G06470具有54％的同一性。包括5'和3'非翻译区的全长EhELO1的cDNA核苷酸序列和翻译的ORF分别示于SEQIDNO:3和4中。SEQIDNO:5提供SEQIDNO:3的编码序列。在SEQIDNO:6中提供了SEQIDNO:3的编码序列的密码子优化形式。根据芸苔属中的密码子用法进行密码子优化。实施例5：通过在酿酒酵母中表达对来自欧洲菟葵的EhELO1进行功能分析为了确定EhELO1的功能，制备用于转化至酵母酿酒酵母INVSc1中的构建体。举例来说，如下制备EhELO1pYES2.1构建体：使用Q5DNA聚合酶NewEnglandBiolabs，利用引物DM719SEQIDNO:1和DM720SEQIDNO:2通过PCR扩增cDNA的编码区，并在TaqDNA聚合酶处理后将其直接克隆到pYES2.1Topo-TA表达载体Invitrogen中。证实插入序列与原始cDNA相同，并且相对于GAL1启动子处于有义方向。为了确定EhELO1pYES2.1的功能，将构建体转化到酵母酿酒酵母INVSc1中。表达由GAL1启动子控制。在–URA选择培养基上选择酵母转化体，并用特异性引物通过集落PCR筛选。为了评估延伸酶活性，将PCR阳性转化体在含有2％葡萄糖、0.67％缺乏尿嘧啶的细菌酵母氮碱基的10mL合成酵母培养基中于28℃下生长至饱和2天。然后用蒸馏水洗涤培养物两次，并在0.1％tergitol存在的情况下用含有或不含250μM二十碳二烯酸20:2-11,14底物的10mL诱导培养基含有2％半乳糖的合成酵母培养基诱导其延伸活性以合成DDA。将诱导的培养物在20℃孵育2天，以允许充分表达和新产物的合成。实施例6：转化的酵母细胞的脂肪酸分析对于酵母细胞的脂肪酸分析，通过离心沉淀细胞，用0.1％的tergitol洗涤一次，用水洗涤一次。用3N甲醇HCl在80℃下将脂肪酸转化为其甲酯，持续1小时。加入1mL水后，用2mL己烷萃取样品两次。合并己烷萃取物并在N2下干燥，并重悬于200μL己烷中。在配备有DB-23柱30-mx0.25-mmx0.25-μm的Hewlett-Packard5890A气相色谱仪上分析脂肪酸组成。温度程序是在160℃下等温1分钟，以梯度4℃分钟升至240℃，然后在240℃等温10分钟。对于二十二碳二烯酸甲酯的GCMS分析，将样品在氮气流下干燥，将残余物溶于100μL己烷中。使用与Agilent6890N气相色谱仪使用G1701DAMSDChemstation软件用于仪器控制和数据分析偶联并配备有膜厚度为0.25-μm的30-mx0.25-mmDB-23柱J&WScientific的Agilent5973质量选择检测器完成分析。色谱条件包括使用0.4mlmin的氢气流、160℃的初始温度1分钟以及随后4℃min的温度斜坡升至240℃的条件，分流进样至色谱柱上20:1。在标准电子冲击条件70eV下运行质量选择检测器，以2.26次扫描秒扫描40-700的有效mz范围。总脂肪酸产物分析表明，与载体对照相比，表达EhELO1的转化体产生了三种新产物参见图2。第二产物的保留时间与DDA标准的相同。该峰的GCMS分析证实其与DDA标准见图3相同，证实其确实是DDA，22:2-13,16。该结果证实从欧洲菟葵分离的EhELO1编码功能性延伸酶，其催化向二十碳二烯酸脂肪酸的羧基末端添加两个碳单元。由转化体产生的另外的产物是ω-7脂肪酸，包括20:1-13和26:1-19脂肪酸，其从18:1-11伸长而产生20:1-13、22:1-15、24:1-17，最后是26:1-19。实施例7：EhELO1在酵母中转化多种脂肪酸的多能性为了确定从菟葵中发现的延伸酶EhELO1的不同活性，将双键数量和位置以及链长不同的各种可能的常见脂肪酸和稀有脂肪酸外源地提供给表达延伸酶EhELO1的酵母转化体以用于体内活性测定。测量底物至产物的转化率并用于比较脂肪酸底物之间的延伸效率。从质粒EhELO1pYES2.1释放EhELO1编码序列，并将其亚克隆到另一种酵母表达载体pHVX2中处于磷酸甘油酸激酶1组成型启动子的控制下，得到质粒EhELO1pHVX2。将重组质粒转化到酿酒酵母INVSc1中。将具有EhELO1或空载体pHVX2的酵母转化体在30℃下生长1天。在tergitol存在的情况下，在补充有或不含0.25mM各种游离脂肪酸的相同培养基中将过夜培养物稀释至OD600为0.1。在20℃孵育2天后，收获酵母细胞，用tergitol洗涤一次，并用水洗涤一次。通过酸转甲基化方法将酵母转化体中的总脂肪酸转化为FAME，并通过气相色谱分析。如表4所示，具有2至5个双键的18C至22C的多不饱和脂肪酸是EhELO1的有利底物，其中20:3-11,14,17是最优选的。然而，该延伸酶对一些单不饱和脂肪酸如18:1-11也具有高活性。表4-酿酒酵母中EhELO1对脂肪酸底物的延伸效率酿酒酵母。数字是从FAME的峰面积计算的。值是四次重复的平均值加标准偏差。底物产物延伸效率％18:1-920:1-113.3±0.0720:1-1122:1-1312.6±0.2322:1-13无反应0.0±0.0018:1-1120:1-1349.4±1.7918:1-OH无反应0.0±0.0018:2-9,12亚油酸20:2-11,1444.6±3.2620:2-11,1422:2-13,16DDA,n-648.5±2.1222:2-13,16DDA,n-624:2-15,183.4±0.1718:3-9,12,15亚麻酸20:3-11,14,1754.7±0.8320:3-11,14,1722:3-13,16,19DTA,n-361.8±0.3522:3-13,16,19DTA,n-324:3-15,18,219.7±0.1318:3-6,9,12γ-亚麻酸20:3-8,11,1428.3±1.9520:3-8,11,1422:3-10,13,1646.4±1.4418:4-6,9,12,15SDA20:4-8,11,14,1725.0±0.3720:4-8,11,14,1722:4-10,13,16,1950.3±0.5322:4-10,13,16,1924:4-12,15,18,2132.7±0.4920:4-5,8,11,14ARA22:4-7,10,13,1636.2±0.9222:4-7,10,13,1624:4-9,12,15,1820.5±0.3720:5-5,8,11,14,17EPA22:5-7,10,13,16,19DPA39.8±0.4322:5-7,10,13,16,19DPA24:5-9,12,15,18,2131.9±0.1922:6-4,7,10,13,16,19DHA24:6-6,9,12,15,18,2110.8±0.52实施例8：来自欧洲菟葵的EhELO1在亚麻荠属中的表达为了证实EhELO1在异源油籽植物中具有功能，将该基因在种子特异性欧洲油菜napin贮藏蛋白启动子的控制下与作为选择标记的红色荧光蛋白基因图4和卡那霉素抗性基因一起在亚麻荠中表达。通过电穿孔将正确的构建体引入根癌土壤杆菌菌株GV3101pMP90。通过植物内土壤杆菌浸润方法将含有候选基因的重组质粒引入到具有低20:1-11和18:3-9,12,15的亚麻荠fad3和fae1RNAi品系中，为EhELO1提供更高水平的底物亚油酸以合成二十二碳二烯酸。将亚麻荠属植物浸入携带该构建体的根癌土壤杆菌转化体中30秒，同时轻轻搅拌。将浸渍的植物水平放置在托盘中并用塑料盖覆盖以保持高湿度。将浸渍的植物T0置于黑暗中24小时，并在16小时光照120μEm-2s-1下在22℃下移至生长室直至成熟。许多实验室已经证明这种方法对转化两种植物都是有效的。当植物成熟时，收获干燥的种子并标记为T1种子。基于卡那霉素抗性或DsRed2表达选择推定的转基因种子。通过使用该方法，产生了16株转基因亚麻荠属植物。单个种子的脂肪酸分析显示欧洲菟葵延伸酶在亚麻荠属中具有活性。如图5所示，与未转化的突变型对照品系相比，转基因亚麻荠属产生三种新的脂肪酸：20:3-11,14,17、22:3-13,16,19和22:2-13,16。其中，22:2-13,16是所产生的新脂肪酸中最丰富的见表5脂肪酸。表5显示了与3粒未转化的种子相比，16株转基因亚麻荠的详细脂肪酸组成按重量百分比计。通过DsRed2的荧光选择了31粒亚麻荠属转基因种子并将其生长用于下一代T2种子。表5-转基因荠蓝fad3和fae1RNAi品系中的脂肪酸组成值表示为总脂肪酸的重量百分比％TFA实施例9：来自欧洲菟葵的EhELO1在拟南芥属中的表达使用EhELO1和DsRed2质粒构建体图5和如上针对亚麻荠属所述的花浸法将处于种子特异性napin启动子控制下的EhELO1转化到拟南芥属野生型，fad3突变体和fad3fae1双突变体植物中。通过DsRed2的荧光选择来自fad3突变体的转基因种子并将其生长用于下一代T2种子。三粒独立荧光种子的脂肪酸分析表明菟葵延伸酶在拟南芥fad3突变型植物中具有活性。如图6所示，与未转化的突变型对照相比，转基因拟南芥突变型植物产生一种新的脂肪酸，鉴定为22:2-13,16DDA。与上述转基因亚麻荠属中的那些相比，DDA的量较低。实施例10：在埃塞俄比亚芥中表达来自欧洲菟葵的EhELO1为了在埃塞俄比亚芥中产生DDA，制备含有处于种子特异性napin启动子控制下的EhELO1基因以及PPT草胺膦选择标记的构建体图7。通过植物内土壤杆菌浸润转化将重组质粒引入具有高水平底物亚油酸的埃塞俄比亚芥中。通过使用该方法，产生了一株转基因植物。来自转基因植物的10粒种子的库的脂肪酸分析显示，欧洲菟葵延伸酶在转基因植物中具有高度活性。图8显示了总脂肪酸的GC分析，上图来自转基因埃塞俄比亚芥种子，下图来自未转化的野生型埃塞俄比亚芥种子。如图8所示，与未转化的野生型相比，转基因埃塞俄比亚芥产生两种主要的新脂肪酸，22:2-13,16和22:3-13,16,19。其中，DDA22:2-13,16是最丰富的表6，达到总脂肪酸的20％以上。表6-转基因埃塞俄比亚芥种子的脂肪酸组成占总脂肪酸的百分比实施例11：不同世代的埃塞俄比亚芥转基因种子中目标脂肪酸的稳定性为了观察转基因种子的脂肪酸组成的遗传性，生长一个优良的T1系以产生T2种子，从其中选择两个优良的T2系并生长以产生T3种子。如表7所示，种子中的脂肪酸组成在三个世代中相对稳定，事实上，T2和T3种子中的两种目标脂肪酸DDA和DTA甚至略高于T1种子。表7-转基因埃塞俄比亚芥T1、T2和T3种子的脂肪酸组成实施例12：来自欧洲菟葵的EhELO1的表达与来自块状耳霉的CtELO6延伸酶的表达组合为了增加20:2-11,14脂肪作为EhELO1的底物的产量以产生DDA，构建了具有含有来自菟葵的EhELO1、来自块状耳霉的延伸酶CtELO6SEQIDNO:7和DsRed2的三基因盒的新的植物表达质粒表达盒示于图9中。通过测序确认质粒，并将其转化到亚麻荠属或拟南芥属中。已经在酵母酿酒酵母中研究了延伸酶CtELO6的功能，其中观察到其以大于20％的延伸效率延伸18:2:9,12脂肪酸。因此，预期植物中通过CtELO6产生20:2:11,14可为EhELO1提供更多的底物，从而在表达CtELO6和EhELO1两者的植物中提供增加的DDA产生。已经通过以上示例描述了说明性实施方案。本领域技术人员将理解，在不脱离权利要求所限定的本发明的范围的情况下，可以进行许多变化和修改。序列表NationalResearchCouncilofCanada菟葵脂肪酸延伸酶及其在脂肪酸生产中的用途2016-045-02US62344,0712016-06-017BiSSAP1.3.6126DNA欧洲菟葵Eranthishyemalis引物序列1tctagaatggagtccatttctgctag26228DNA欧洲菟葵引物序列2tctagattaaaccagcttcttatccttg283949DNA欧洲菟葵编码区25...8523atgcttccttcatttgtttcaaaaatggagtccatttctgctagtgtacgctactggcta60gtagaacacccattggtgagcggattcgagtggatagaaggcgaaacatttggttcatcg120ccaaaatttcttctaaccacggtagccacctacctctccctaacctacatcctctccatc180acccttctttcaccgaaacctccagtgaaaaccccctccaagacccttaccatcctccgg240tctatctccgcaatacataacctgattctccttgccctctccttcataatggccttggga300gcgacattagcaaccaccaccaaaatgccaagcaagcaatggatctgtttcccagcaaac360aaaacccgatcacagggtccactatttttctgggcttatgtgttctacctatccaagata420cttgaatacgtagataccctcttgatcatcctccacaacgacgcaaggagactcacattt480ctccatgtctaccatcacactgttgttactatcatgtgttacctttggctacacactaca540caatctctcttacctttggggattgttaccaatgccaccgtgcatactgtcatgtatgct600tattatttcatgtgcacacttgggaaaaggccatcttggaagaggttagtgacagatttc660cagatcattcagttttggtttggtctcgggatctccacgttgatgttgtggttccatttt720actggaactggctgctctgggatttggggatggggtttttcttatgtcttcaatgcttct780cttcttgctctatttagtgcttttcatgctaacaactacgccaacaaggacaaggataag840aagctggtttaactgcctatttatggggtctattcgtgtggctatatcaccatcccacgc900gatcagaatctatttaggatatccttgtatcaataagttaagtttgttt9494275PRT欧洲菟葵4MetGluSerIleSerAlaSerValArgTyrTrpLeuValGluHisPro151015LeuValSerGlyPheGluTrpIleGluGlyGluThrPheGlySerSer202530ProLysPheLeuLeuThrThrValAlaThrTyrLeuSerLeuThrTyr354045IleLeuSerIleThrLeuLeuSerProLysProProValLysThrPro505560SerLysThrLeuThrIleLeuArgSerIleSerAlaIleHisAsnLeu65707580IleLeuLeuAlaLeuSerPheIleMetAlaLeuGlyAlaThrLeuAla859095ThrThrThrLysMetProSerLysGlnTrpIleCysPheProAlaAsn100105110LysThrArgSerGlnGlyProLeuPhePheTrpAlaTyrValPheTyr115120125LeuSerLysIleLeuGluTyrValAspThrLeuLeuIleIleLeuHis130135140AsnAspAlaArgArgLeuThrPheLeuHisValTyrHisHisThrVal145150155160ValThrIleMetCysTyrLeuTrpLeuHisThrThrGlnSerLeuLeu165170175ProLeuGlyIleValThrAsnAlaThrValHisThrValMetTyrAla180185190TyrTyrPheMetCysThrLeuGlyLysArgProSerTrpLysArgLeu195200205ValThrAspPheGlnIleIleGlnPheTrpPheGlyLeuGlyIleSer210215220ThrLeuMetLeuTrpPheHisPheThrGlyThrGlyCysSerGlyIle225230235240TrpGlyTrpGlyPheSerTyrValPheAsnAlaSerLeuLeuAlaLeu245250255PheSerAlaPheHisAlaAsnAsnTyrAlaAsnLysAspLysAspLys260265270LysLeuVal2755828DNA欧洲菟葵5atggagtccatttctgctagtgtacgctactggctagtagaacacccattggtgagcgga60ttcgagtggatagaaggcgaaacatttggttcatcgccaaaatttcttctaaccacggta120gccacctacctctccctaacctacatcctctccatcacccttctttcaccgaaacctcca180gtgaaaaccccctccaagacccttaccatcctccggtctatctccgcaatacataacctg240attctccttgccctctccttcataatggccttgggagcgacattagcaaccaccaccaaa300atgccaagcaagcaatggatctgtttcccagcaaacaaaacccgatcacagggtccacta360tttttctgggcttatgtgttctacctatccaagatacttgaatacgtagataccctcttg420atcatcctccacaacgacgcaaggagactcacatttctccatgtctaccatcacactgtt480gttactatcatgtgttacctttggctacacactacacaatctctcttacctttggggatt540gttaccaatgccaccgtgcatactgtcatgtatgcttattatttcatgtgcacacttggg600aaaaggccatcttggaagaggttagtgacagatttccagatcattcagttttggtttggt660ctcgggatctccacgttgatgttgtggttccattttactggaactggctgctctgggatt720tggggatggggtttttcttatgtcttcaatgcttctcttcttgctctatttagtgctttt780catgctaacaactacgccaacaaggacaaggataagaagctggtttaa8286829DNA人工序列密码子优化的EhEL01编码序列6atggagtccatctctgcaagcgtccgttattggcttgtagagcacccacttgtgtcagga60ttcgagtggatcgagggagagacttttggttcttctccaaaatttttgctgaccactgtg120gctacttatctatcgttaacgtatattctgtccatcactcttctctctcctaaaccgcct180gtcaaaacaccgtctaagactcttacgatcttaagatctattagcgctattcacaacttg240atcttgttggctcttagttttatcatggcacttggagcaacattggcgacaactaccaag300atgcccagcaagcaatggatctgtttcccggctaacaagaccaggagccagggtccattg360ttcttctgggcatacgttttttatctaagtaaaatcctggaatacgtcgataccctcctt420ataatcctccacaacgacgcgaggagactaacttttttgcatgtgtatcaccacactgtg480gttaccatcatgtgttatttgtggcttcatactacccaatcacttttgcccttaggaata540gttacaaacgccacagtgcataccgtaatgtacgcttactacttcatgtgtaccctggga600aaacgtccatcttggaagagactagtcacagatttccaaattatccaattctggtttggt660ctcgggatctcgacccttatgctctggtttcacttcacaggcactggttgtagcggaatc720tggggttggggattttcatacgtctttaacgcttccttgttggctctattcagtgctttc780catgcaaacaactacgccaacaaggacaaggataagaagctagtctgat8297990DNA块状耳霉Conidiobolusthromboides7atgagtttattaaatacattggatactattacttcaagcaataatgttgtatcagcatac60aacgatgccccagtagactatttaattaaagtagtagatttagctttaactgctaacaaa120gcagtcttcaatgttatagaagccaaagttaacgtatggatgccaacattgatgataaac180ttaagagaacaggtctctaatttaatctcaccaataagtaaatacttgccattgttagat240cctatcgaagtgttttctatcttgtttttatatatctttgttgtgtttttttggctcaaa300gtagcttctagcttcctcccacgtttcgaagtaagattattttcccttttccataatttc360tgtatggtcgttttatccgcctatatgtgctcttccatcctattacaagcttatgcagat420aagtatattctattcactaaccccgtcgatcactctccaaatggtattccaatggctaaa480ataatatggttattttatatttccaaaatcccagagttcgttgacactatgatcatgttg540gttaaacaaaactaccgccaaatctcctttttacatgtctaccatcatagttcgatcttt600gctatttggtggattgttaccttgatggcaccaaatggtgatgcttatttctcagctgca660ttgaactcatttattcatgttgttatgtacggatattatttactctctgcacttggattc720aaatccgtctcctttgttaagaaatatattactatgggacaaatgactcaatttgcactc780aactttgttcaagctagttataatattgtagacagaaattacttacgtccacaagtccat840gagcaaggattagcctatccttatgctctttccgttttactttggttctatatgatctct900atgttggtgttattcgctaacttttatattcaagatcgtatccgtcaatcaaagttaaag960tctcaacaaaagggaaagaaaatgaattag990

权利要求：1.一种编码延伸酶的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：i与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；iiSEQIDNO:5的密码子简并核苷酸序列；iii如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；iv编码与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽的核苷酸序列；或v编码具有SEQIDNO:4的保守取代的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。3.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。4.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。5.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。6.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽。7.一种分离的延伸酶，其包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，包含SEQIDNO:4的保守取代的氨基酸序列，或包含由权利要求1的核酸分子编码的氨基酸序列。8.权利要求7的分离的延伸酶，其包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。9.权利要求7的分离的延伸酶，其包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。10.权利要求7的分离的延伸酶，其包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。11.权利要求7的分离的延伸酶，其由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成。12.一种表达载体、噬菌体或质粒，其包含权利要求1至6中任一项的核酸分子。13.权利要求12的表达载体、噬菌体或质粒，其还包含编码第二延伸酶的第二核酸分子，其中由所述第二核酸分子编码的所述第二延伸酶：i是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；ii由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；iii由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；iv包含与由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或v包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。14.一种转基因生物，其包含权利要求1至6中任一项的核酸分子。15.权利要求14的转基因生物，其还包含编码第二延伸酶的第二核酸分子，其中由所述第二核酸分子编码的所述第二延伸酶：i是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；ii由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；iii由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；iv包含与由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或v包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。16.权利要求14或15的转基因生物，其为植物。17.权利要求16的转基因生物，其中所述植物是油籽植物。18.权利要求16的转基因生物，其中所述植物是欧洲油菜Brassicanapus、芥菜型油菜Brassicajuncea、埃塞俄比亚芥Brassicacarinata、甘蓝Brassicaoleracea、黑芥Brassicanigra、芜菁Brassicarapa、白芥Sinapisalb、荠蓝Camelinasativa、琉璃苣苣琉璃苣属的种Boragosp.、亚麻亚麻属的种Linumsp.、大豆大豆属Glycine和Sola属的种Solasp.、向日葵向日葵属的种Helianthussp.、棉花棉属的种Gossypiumsp.、玉米玉蜀黍Zeamays、橄榄木犀榄属的种Oleasp.、红花红花属的种Carthamussp.、可可可可树Theobromacacoa或花生花生属的种Arachissp.。19.权利要求16的转基因生物，其中所述植物是荠蓝或埃塞俄比亚芥。20.权利要求14或15的转基因生物，其为微生物。21.权利要求20的转基因生物，其为酵母、真菌、细菌或藻类。22.权利要求21的转基因生物，其中所述微生物是酵母，其为解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica、产脂内孢霉Endomycesvernalis、瘦弱红酵母Rhodotorulagracilis、粘红酵母Rhodotorulaglutinis、禾本红酵母Rhodotorulagraminis、圆红冬抱酵母Rhodosporidiumtoruloides、斯达氏油脂酵母Lipomycesstarkeyi、产油油脂酵母Lipomyecslipofer、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae或油性丝孢酵母Trichosporonoleaginous。23.权利要求21的转基因生物，其中所述微生物是真菌，其为破囊腔菌属的种Thaustochytriumsp.、裂殖壶菌的种Schizochytriumsp.、日本腔菌属的种Japonochytriumsp.、网粘菌属的种Labyrinthulasp.或吾肯氏壶菌属的种Ulkeniasp.。24.权利要求21的转基因生物，其中所述微生物是藻类，其为寇氏隐甲藻Crypthecodiniumcohnii，链状膝沟藻Conyaulaxcatenella，多边膝沟藻Conyaulaxpolyedra，简单螺沟藻Gyrodiniumsimplex，寇氏裸甲藻Gyrodiniumcohnii，球等鞭金藻Isochysisgalbana、鲁兹巴夫藻Pavlovalutheri、强壮前沟藻Amphidiniumcarteri、卵形隐藻Cryptomonasovata、尼氏裸甲藻Gymnodiniumnelson、心形原甲藻Prorocentrumcordatum、假微型海链藻Thalassiosirapseudonana或三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum。25.一种遗传修饰的种子，其包含权利要求1至6中任一项的核酸分子。26.权利要求25的遗传修饰的种子，其还包含编码第二延伸酶的第二核酸分子，其中由所述第二核酸分子编码的所述第二延伸酶：i是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；ii由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；iii由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；iv包含与由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或v包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。27.权利要求25或26的遗传修饰的种子，其为欧洲油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比芥、甘蓝、黑芥、芜菁、白芥、荠蓝、琉璃苣苣琉璃苣属的种、亚麻亚麻属的种、大豆大豆属和Sola属的种、向日葵向日葵属的种、棉花棉属的种、玉米玉蜀黍、橄榄木犀榄属的种、红花红花属的种、可可可可树或花生花生属的种种子。28.权利要求27的遗传修饰的种子，其为荠蓝或埃塞俄比亚芥种子。29.一种遗传修饰的细胞，其包含权利要求1至6中任一项的核酸分子。30.权利要求29的遗传修饰的细胞，其还包含编码第二延伸酶的第二核酸分子，其中由所述第二核酸分子编码的所述第二延伸酶：i是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；ii由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；iii由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；iv包含与SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或v包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。31.权利要求29或30的遗传修饰的细胞，其为欧洲油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥、甘蓝、黑芥、芜菁、白芥、荠蓝、琉璃苣琉璃苣属的种、亚麻属的种、大豆大豆属和Sola属的种、向日葵向日葵属的种、棉花棉属的种、玉米玉蜀黍、橄榄木犀榄属的种、红花红花属的种、可可可可树或花生花生属的种的细胞。32.权利要求31的遗传修饰的细胞，其是荠蓝或埃塞俄比亚芥细胞。33.一种用于产生包含20个或更多个碳的至少一种不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：i提供包含权利要求1至6中任一项的核酸分子的转基因生物；ii在所述转基因生物中表达所述核酸分子；以及iii使所述转基因生物产生所述至少一种不饱和脂肪酸。34.权利要求33的方法，其中所述至少一种不饱和脂肪酸为C20、C22或C24不饱和脂肪酸。35.权利要求33的方法，其中所述至少一种不饱和脂肪酸是20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；26:1-19脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；24:2-15,18脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；24:3-15,18,21脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；22:3-10,13,16脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；24:4-12,15,18,21脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；24:4-9,12,15,18脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；24:5-9,12,15,18,21脂肪酸；24:6-6,9,12,15,18,21脂肪酸；或其中两种或多种的组合。36.权利要求33的方法，其中所述至少一种不饱和脂肪酸是二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或DDA和DTA的组合。37.权利要求33至36中任一项的方法，其中向所述转基因生物提供包含EhELO1底物脂肪酸或其前体的原料。38.权利要求37的方法，其中所述原料包含18:1-9脂肪酸；18:1-11脂肪酸；20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；18:2-9,12脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；18:3-9,12,15脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；18:3-6,9,12脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；18:4-6,9,12,15脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；20:4-5,8,11,14脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；20:5-5,8,11,14,17脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；22:6-4,7,10,13,16,19脂肪酸；或其中两种或多种的组合。39.权利要求38的方法，其中所述原料包含20:2-11,14脂肪酸或20:3-11,14,17脂肪酸。40.权利要求33至39中任一项的方法，其还包括从所述转基因生物或其组织或部分中纯化所述至少一种不饱和脂肪酸的一种或多种不饱和脂肪酸的步骤。41.权利要求33至40中任一项的方法，其中所述转基因生物是油籽植物。42.权利要求41所述的方法，其中所述油籽植物为欧洲油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥、甘蓝、黑芥、芜菁、白芥、荠蓝、琉璃苣苣琉璃苣属的种、亚麻亚麻属的种、大豆大豆属和Sola属的种、向日葵向日葵属的种、棉花棉属的种、玉米玉蜀黍、橄榄木犀榄属的种、红花红花属的种、可可可可树或花生花生属的种。43.权利要求42所述的方法，其中所述油籽植物是荠蓝或埃塞俄比亚芥。44.权利要求33至40中任一项的方法，其中所述转基因生物是微生物。45.权利要求44的方法，其中所述微生物是酵母、真菌、细菌或藻类。46.权利要求45的方法，其中所述微生物是酵母，其为解脂耶氏酵母、产脂内孢霉、瘦弱红酵母、粘红酵母、禾本红酵母、圆红冬抱酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母、酿酒酵母或油性丝孢酵母。47.权利要求45的方法，其中所述微生物是真菌，其是破囊腔菌属的种、裂殖壶菌的种、日本腔菌属的种、网粘菌属的种或吾肯氏壶菌属的种。48.权利要求45的方法，其中所述微生物是藻类，其为寇氏隐甲藻、链状膝沟藻、多边膝沟藻、简单螺沟藻、寇氏裸甲藻、球等鞭金藻、鲁兹巴夫藻、强壮前沟藻、卵形隐藻、尼氏裸甲藻、心形原甲藻、假微型海链藻或三角褐指藻。49.权利要求33至40中任一项的方法，其中所述转基因生物是产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸、18:2-9,12脂肪酸、18:3-9,12,15脂肪酸或其中一种或多种的组合的产油转基因生物。50.权利要求33-40中任一项的方法，其中所述转基因生物表达产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者的第二延伸酶。51.权利要求50的方法，其中所述第二延伸酶：i是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；ii由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；iii由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；iv包含与由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或v包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。52.一种用于从底物原料产生包含20个或更多个碳的至少一种不饱和脂肪酸的离体方法，该方法包括：a提供底物原料，所述底物原料包含EhELO1底物脂肪酸；b将所述底物原料暴露于权利要求7-11中任一项的延伸酶；以及c使延伸酶产生所述至少一种不饱和脂肪酸。53.权利要求52的方法，其中所述底物原料包含18:1-9脂肪酸；18:1-11脂肪酸；20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；18:2-9,12脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；18:3-9,12,15脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；18:3-6,9,12脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；18:4-6,9,12,15脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；20:4-5,8,11,14脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；20:5-5,8,11,14,17脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；22:6-4,7,10,13,16,19脂肪酸；或其中两种或多种的组合。54.权利要求53的方法，其中所述原料包含20:2-11,14脂肪酸或20:3-11,14,17脂肪酸。55.权利要求52至54中任一项的方法，其还包括纯化步骤，以纯化由所述方法产生的所述至少一种不饱和脂肪酸的一种或多种不饱和脂肪酸。56.权利要求52至55中任一项的方法，其中使用产生20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者的第二延伸酶来使所述底物原料富集20:2-11,14脂肪酸、20:3-11,14,17脂肪酸或两者。57.权利要求56的方法，其中所述第二延伸酶：i是块状耳霉延伸酶CtELO6，或其功能变体；ii由与SEQIDNO:7所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子编码；iii由具有SEQIDNO:7的密码子简并核苷酸序列的核酸分子编码；iv包含与由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或v包含由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列的保守取代的氨基酸序列。58.权利要求1至6中任一项的核酸分子在产生包含20个或更多个碳的不饱和脂肪酸中的用途。59.权利要求58的用途，用于产生包含20个、22个或24个碳的不饱和脂肪酸。60.权利要求59的用途，用于产生以下脂肪酸：20:1-11脂肪酸；20:1-13脂肪酸；22:1-13脂肪酸；22:1-15脂肪酸；24:1-17脂肪酸；26:1-19脂肪酸；20:2-11,14脂肪酸；22:2-13,16脂肪酸；24:2-15,18脂肪酸；20:3-11,14,17脂肪酸；22:3-13,16,19脂肪酸；24:3-15,18,21脂肪酸；20:3-8,11,14脂肪酸；22:3-10,13,16脂肪酸；20:4-8,11,14,17脂肪酸；22:4-10,13,16,19脂肪酸；24:4-12,15,18,21脂肪酸；22:4-7,10,13,16脂肪酸；24:4-9,12,15,18脂肪酸；22:5-7,10,13,16,19脂肪酸；24:5-9,12,15,18,21脂肪酸；24:6-6,9,12,15,18,21脂肪酸；或其中两种或多种的组合。61.权利要求59的用途，用于产生二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或DDA和DTA的组合。62.由权利要求14至24中任一项的转基因生物产生的油产品，所述油产品包含二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或其混合物。63.权利要求62的油产品，其中所述转基因生物是权利要求17至19中任一项的转基因植物。64.一种油产品，其包含二十二碳二烯酸DDA、二十二碳三烯酸DTA或其混合物，所述油产品通过权利要求33-57中任一项的方法产生。

百度查询： 加拿大国家研究委员会 菟葵脂肪酸延伸酶及其在脂肪酸生产中的用途

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