申请/专利权人：浙江大学

申请日：2021-12-11

公开（公告）日：2024-05-10

公开（公告）号：CN114292804B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;C12N5/0775

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.10#授权;2022.04.26#实质审查的生效;2022.04.08#公开

摘要：本发明提供了一种血管化脂肪类器官培养的方法，所述方法包括小鼠内脏脂肪干细胞分离扩增和血管化脂肪类器官培养两个部分。本发明使用促血管生长因子和血管化脂肪类器官培养基在三维培养条件下诱导小鼠内脏脂肪干细胞自发形成血管化脂肪类器官，改进了传统脂肪三维培养方法。本方法可操作性强，实验可重复性高，成本较低，为脂肪生物学和肥胖研究提供操作简便，易于定量分析，并能反映动物体内脂肪发育模式的体外新模型。

主权项：1.一种血管化脂肪类器官培养方法，其特征在于，包括小鼠内脏脂肪干细胞分离扩增和血管化脂肪类器官培养两个部分，具体步骤如下：人道处死小鼠；获取小鼠脂肪组织：无菌条件下打开小鼠腹腔获取内脏脂肪组织，并使用2-8℃的脂肪组织冲洗液冲洗小鼠内脏脂肪2~3次去除污物；消化脂肪组织：眼科剪剪碎脂肪组织，使用包括1mgml的I型胶原酶，体积比为2%青霉素链霉素双抗，体积比1%的BSA和体积比为97%HBSS缓冲液脂肪组织消化液37℃，30min，150rpm恒温摇床消化脂肪组织；得到单细胞悬液：等体积DMEMF12完全培养基终止消化，100μm和70μm细胞滤网过滤脂肪组织消化液两次后，300g，5min离心去上清，使用红细胞裂解液裂解红细胞，培养基重悬细胞得到单细胞悬液；2D培养扩增脂肪干细胞：将得到的单细胞悬液接种于组织处理细胞培养皿，补足培养基，放入37℃，5%CO2或37℃，5%CO2，5%O2培养箱中，4-6h后换液得到高纯度脂肪干细胞，2-3天后传代继续培养扩增脂肪干细胞；悬滴培养：将培养扩增后的脂肪干细胞胰酶或TrypLE消化后，完全培养基终止消化，采用悬滴法使小鼠内脏脂肪干细胞形成三维脂肪干细胞球，悬滴培养2-3天，每个细胞球含有的细胞数为8000-10000；血管化诱导：使用脂肪干细胞血管化诱导培养基在超低吸附板中悬浮培养诱导小鼠内脏脂肪干细胞2天，诱导小鼠内脏脂肪干细胞向血管内皮细胞定向，使用Paraflim封口膜和384孔PCR板构建多孔模具，将脂肪干细胞血管化诱导培养基培养两天的小鼠内脏脂肪干细胞球转移至模具内，模具中每孔放置一个脂肪干细胞球，采用8~12mgml浓度基质胶包埋细胞球，将模具置于细菌或细胞培养皿皿底，倒置放入37℃细胞培养箱30min，待基质胶固化后用脂肪干细胞血管化诱导培养基将含有小鼠内脏脂肪干细胞球的基质胶转移至超低吸附板中继续悬浮诱导4~5天，2~3天换液，使其形成分支状血管结构；成脂诱导：使用血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基对小鼠脂肪类器官进行3天的成脂诱导定向，之后使用血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基对血管化脂肪类器官继续成脂诱导10-12天，使之形成具有直径超过40μm成熟脂肪细胞的血管化脂肪类器官；维持培养：使用血管化脂肪类器官维持培养基培养血管化脂肪类器官6天，用于后续细胞活力及表型检测，培养得到的血管化脂肪类器官含有血管内皮细胞和成熟脂肪细胞；所述的2D培养扩增脂肪干细胞使用脂肪干细胞维持培养基，包括体积比为12%胎牛血清、体积比为1%青霉素链霉素双抗、10ngml碱性成纤维生长因子和体积比为87%的DMEMF12培养基；所述的悬滴培养所使用的完全培养基包括体积比为15%胎牛血清，体积比为1%青霉素链霉素双抗和体积比为84%DMEMF12；血管化诱导使用的脂肪干细胞血管化诱导培养基包括1ngml血管内皮生长因子，5ngml表皮生长因子，20ngmlR3-胰岛素样生长因子-1，1μgml抗坏血酸，0.2μgml氢化可的松，30μgml庆大霉素，15ngml两性霉素和体积比为5%胎牛血清的血管内皮细胞基础培养基EBM-2；血管化诱导三维脂肪干细胞球2天后采用基质胶包埋小鼠内脏脂肪干细胞球，包埋每个细胞球使用的基质胶用量为6-8μL；血管化脂肪类器管成脂定向诱导培养基包括体积比为15%的胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗、10μgml胰岛素、1μM地塞米松，1μM罗格列酮、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和体积比为84%的DMEMF12培养基；血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基包括体积比为12%的胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗、5μgml胰岛素和体积比为87%的DMEMF12培养基。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 浙江大学 一种血管化脂肪类器官培养方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD