申请/专利权人：中国农业科学院作物科学研究所

申请日：2016-06-13

公开（公告）日：2019-06-21

公开（公告）号：CN106011146B

主分类号：C12N15/29(2006.01)I

分类号：C12N15/29(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;A01H6/46(2018.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.06.21#授权;2016.11.09#实质审查的生效;2016.10.12#公开

摘要：本发明涉及OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用。本发明首次发现OsMADS47基因具有直接调控水稻籽粒长度的功能，通过在水稻中过量表达OsMADS47基因，从而增加转基因水稻的籽粒长度，且OsMADS47基因的表达量与籽粒长度显著相关。为增加水稻籽粒长度及改良水稻粒型提供了重要的基因资源及思路，为OsMADS47基因直接应用于水稻籽粒长度的改良提供了理论支持。对于加快水稻育种进程，提高水稻产量方面具有重要意义。

主权项：1.OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用，其特征在于，在水稻中过表达OsMADS47基因以增加转基因水稻的籽粒长度；其中，OsMADS47基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。

全文数据：OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用技术领域本发明涉及基因工程及遗传育种领域，具体地说，涉及OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用。背景技术水稻是世界上重要的农作物之一，其产量性状是育种家关心的重要农艺性状，而水稻粒型性状是决定水稻产量的重要因素之一。近年来，大量控制水稻籽粒大小的QTL被鉴定出来，而其中一些在育种工程中被广泛选择或只存在于部分优良品种中，还有一些QTL仅在一定的品种中有所应用。因此这些QTL虽然在决定籽粒大小中具有重要功能，但其调控粒型的功能机制还不是很清楚，因此发掘新的粒型相关基因并阐述其功能机制对水稻产量的提高具有重要意义。籽粒大小及其他器官大小是由各种植物激素如生长素、细胞分裂素及油菜素内酯所控制。大量研究表明，油菜素内酯Brassinosteroid,BR在拟南芥、水稻及其他一些物种的种子发育中起重要的作用。水稻d11突变体显示出典型的BR缺失表型，表现为矮化、叶片直立及小圆粒。D11编码细胞色素P450CYP724B1，它与BR合成中的几个酶具有相当高的同源性。与此相一致，喷施BR可恢复d11突变体的表型，这表明D11在BR合成中具有重要的作用。拟南芥BR缺失突变体det2与d11突变体相似，也表现为种子减小。进一步分析发现BR可以直接参与一系列种子大小调控基因的表达。在水稻BR信号转导途径中，BR受体基因D61BRASSINOSTEROID发生突变或BR信号转导途径的负调控因子GSK2超表达后均会导致籽粒变小。SRS5SMALLANDROUNDSEED5编码一个α-tubulin蛋白，该基因发生突变后影响细胞的伸长进而导致籽粒变小，d61srs5双突变体显示出比双亲更小的籽粒表型，然而SRS5调控BR信号转导途径的机制还不是很清楚。BU1BRASSINOSTEROIDUPREGULATED1基因是受BR诱导的一个基因，编码一个helix-loop-helix转录因子，作为BR反应的正向调控因子处于D61OsBRI1的下游。水稻中超表达BU1产生典型的BR表型包括大籽粒的形成。通过对水稻籽粒大小突变体进行遗传筛选，已鉴定出几个突变体，并对它们对应的野生型等位基因进行了分析。多数被鉴定出的基因是通过BR信号转导途径介导细胞分裂及细胞扩张正向调控籽粒大小。然而DLTDWARFANDLOW-TILLERINGD62GS6基因编码一个GRAS家族的转录因子正向调控BR信号途径及GA代谢过程，但该基因却是籽粒大小的负调控因子，该表型与其他BR反应的正向调控因子缺失表型是截然相反的。DLTD62GS6由GSK2直接磷酸化，GSK2是负调控BR途径的蛋白激酶，超表达GSK2会产生与BR突变体相似的小且圆的籽粒。考虑到籽粒增大的表型对于gs6等位变异是特异的，与dlt和d62等位变异相比具有很大的边际效应，且在水稻育种过程中DLTD62GS6基因在粳稻中受到强烈选择，因此gs6等位变异控制籽粒大小可能是通过不依赖于BR信号转导途径的未知机制。值得指出的是，大多数BR突变体除籽粒大小的表型外，还显示出明显的生长缺陷，因此籽粒大小的改变可能是相关突变的二级效应。最近对于qGL3qGL3.1OsPPKL1的研究部分解释了该问题。qGL3qGL3.1OsPPKL1基因编码一个磷酸化酶蛋白，特异的影响水稻粒长。OsPPKL1与OsPPKL3处于一个小基因家族的同一个分支，OsPPKL2与拟南芥的同源基因BSU1BRI1SUPPRESSOR1处于另一个分支。BSU1与它的同源基因BSLBSU1-like直接使GSK3样激酶BIN2BR-insensitive2去磷酸化，是位于下游BIN2活性的抑制因子，而正调控BR信号转导途径。OsPPKL2可能与BSU1和BSL功能相似而正调控BR信号转导途径，而OsPPKL1和OsPPKL3可能在BR信号转导途径中起相反的作用，qGL3qGL3.1OsPPKL1可能通过调控BR信号转导途径特异的控制籽粒大小。BIN2直接磷酸化生长素信号转导途径的负调节因子ARF2，而被认为是BR和生长素信号途径的节点蛋白，然而BIN2控制拟南芥籽粒大小的具体机制尚不清楚。现有研究表明，大多数短营养期shortvegetativephaseSVP-类MADS-box基因控制分生组织的生成及开花时间，其中水稻OsMADS47便属于该类基因，是BR信号转导途径的负调控因子，但有关OsMADS47对于水稻粒型的调控并未见报道。发明内容本发明的目的是提供OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用。为了实现本发明目的，本发明从水稻日本晴中分离克隆到含有MADS-box结构域的OsMADS47基因，该基因在水稻中过量表达后，转基因阳性植株的籽粒长度极显著高于野生型，可比野生型提高23％-30％。因此，在水稻中过量表达OsMADS47对增加水稻籽粒长度增加具有重要意义，为水稻产量的提高提供了重要的基因资源。本发明提供OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用，其中OsMADS47基因的CDS序列为：iSEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或iiSEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv与i、ii或iii的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。前述的应用，在水稻中过表达OsMADS47基因以增加转基因水稻的籽粒长度。前述的应用，提取水稻总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增获得OsMADS47基因的CDS序列，并将所述CDS序列构建到植物双元表达载体中，转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。本发明优选使用植物双元表达载体pCAMBIA1305.1-APFHN。将OsMADS47基因的CDS序列插入具有潮霉素抗性的载体pCAMBIA1305.1-APFHN的酶切位点SalI和PmlI之间，构建得到携带有目的基因的重组表达载体。携带有目的基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition。本发明中采用农杆菌介导的转化方法，以水稻成熟胚愈伤组织作为受体材料，进行水稻的转化。利用潮霉素筛选转基因水稻植株。前述的应用，采用PCR法鉴定阳性转基因水稻植株，PCR扩增所用引物为：正向引物：5'-GATCCTACCCATACGATGTTCC-3'反向引物：5'-TCCAGTCCATCGATCTCATCC-3'。前述的应用，转化的水稻品种优选日本晴‘Nipponbare’。本发明还提供一种转基因水稻的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将携带OsMADS47基因CDS序列的植物双元表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。前述的方法，所述携带OsMADS47基因CDS序列的植物双元表达载体的构建方法如下：采用基因重组Infusion的方法，将OsMADS47基因的CDS序列插入具有潮霉素抗性的植物双元表达载体pCAMBIA1305.1-APFHN的酶切位点SalI和PmlI之间。本发明首次发现OsMADS47基因具有直接调控水稻籽粒长度的功能，通过在水稻中过量表达OsMADS47基因，从而增加转基因水稻的籽粒长度，且OsMADS47基因的表达量与籽粒长度显著相关。为增加水稻籽粒长度及改良水稻粒型提供了重要的基因资源及思路，为OsMADS47基因直接应用于水稻籽粒长度的改良提供了理论支持。对于加快水稻育种进程，提高水稻产量方面具有重要意义。附图说明图1为本发明实施例1中重组表达载体pCAMBIA1305.1-APFHN::OsMADS47的结构示意图。图2为本发明实施例2中pCAMBIA1305.1-APFHN::OsMADS47转化水稻日本晴后可显著增加籽粒长度。其中，AOsMADS47转基因水稻的PCR检测；B阳性转基因株系种子形态；OsMADS47转基因水稻籽粒长度C、宽度D及厚度E的统计分析。图3为本发明实施例3中pCAMBIA1305.1-APFHN::OsMADS47转基因水稻中OsMADS47基因A及蛋白B表达水平。图4为本发明实施例4中pCAMBIA1305.1-APFHN::OsMADS47转基因水稻中粒长相关基因的表达情况。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1OsMADS47基因植物表达载体的构建及遗传转化利用TRIzol提取液提取日本晴水稻叶片总RNA，具体操作步骤如下：取100mg新鲜植物组织在液氮中快速充分研磨，研磨过程中要保持研钵中始终有液氮；将研磨成粉末的样品转入预冷的1.5mlRNasefree离心管中，加入1mlTRIZOL提取液震荡摇匀；室温放置5min后，加入0.5ml的氯仿，剧烈摇动离心管5min，在4℃条件下，12000rpm离心10min，收集滤液于收集管；溶液分为两层，下层为酚-氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入0.5ml异丙醇在15～30℃条件下，沉淀10min；4℃条件下，12000rpm离心10min，RNA沉淀管壁和底部；去掉液体部分，加入1ml75％酒精洗2次；风干后，加入25μlDEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80℃冰箱备用。DNaseI消化，在RNasefree的0.5ml离心管中配制下列反应液：于37℃反应30-40min。向体系中加入2.5μl0.5molLEDTA，80℃恒温2min；加入10μl3M醋酸钠和250μl的冰乙醇，-80℃放置20min；4℃条件下，12000rpm离心10min，弃上清；干燥沉淀后，用适量的RNasefreeH2O溶解，电泳检测，确认基因组中无DNA污染。利用反转录酶将其反转成cDNA。在RNasefree离心管配制下列混合液：模板RNA1μgOligodT1850μMml2μlDEPC-treatedddH2O补至总体积10μl70℃保温5min后迅速在冰上急冷2min以上，离心数秒使混合液聚集于管底部。加入以下反转录反应试剂：于42℃孵育1h。然后，70℃孵育15min。冰上冷却，得到的cDNA溶液稀释1-100倍后用于PCR扩增。采用基因重组Infusion的方法进行载体与目的片段之间的连接。以反转录获得的日本晴叶片cDNA为模板，用引物5'-TATCGATACCGTCGACATGGCTGGCGGCGGCGGTG-3'和5'-GTCACCAATTCACACGTGTCACTTGGAGCTGAAGAGTG-3'扩增获得OsMADS47基因的CDS序列SEQIDNO:1，该基因编码区长度为747bp，编码一个含有248个氨基酸的MADS-box转录因子SEQIDNO:2。将扩增获得的OsMADS47基因CDS序列插入具有潮霉素抗性的双元表达载体pCAMBIAl305.1-APFHN的SalI和PmlI之间。构建好的重组表达载体pCAMBIA1305.1-APFHN::OsMADS47的结构如图1所示，用电击法转入农杆菌EHA105。利用水稻日本晴种子诱导愈伤作为受体材料，用农杆菌介导的转化方法进行水稻的转化。水稻转化的具体操作步骤如下：1水稻成熟胚愈伤组织的准备:水稻成熟种子脱壳后，挑选饱满无菌斑的种子放入烧杯中，用70％酒精消毒2min。倒去酒精，加入25％vvNaClO溶液消毒30min。倒去NaClO溶液，用无菌水清洗3-5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min。倒去无菌水，将种子放在无菌滤纸上吸干，胚朝上植入N6B5培养基中，28℃暗培养3-4周。在超净工作台上打开培养皿，用镊子选取胚性愈伤组织淡黄色，致密不规则，置入粳稻继代培养基中，28℃光培养5-7天，长出淡黄色、质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织即可用于侵染。2水稻愈伤组织的转化：愈伤组织的预培养及农杆菌的活化，侵染前将愈伤组织转至新鲜的N6B5培养基上培养4天。挑取农杆菌单克隆接种到5mlLB液体培养基中含50mgL利福平和50mgL卡那霉素，28℃220rpm培养至对数生长期晚期约培养18-24h。将活化的农杆菌菌液按1％接种量转接50ml新鲜的LB液体培养基中含50mgL利福平和50mgL卡那霉素，28℃220rpm培养至OD600值为0.5左右约培养6h。将菌液转入80ml离心管，4℃4000g离心5分钟，弃上清，悬浮于添加有100μM乙酰丁香酮As20ML的AMM液体培养基中。将预培养的胚性愈伤组织浸入上述AMMAS菌液，侵染20分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于N6B5培养基上培养基上铺一层无菌滤纸，26℃暗培养2-3天。共培养后的愈伤组织用N6B5液体培养基或无菌水含500mgL头孢霉素洗涤8次，用无菌吸水纸吸干后置于工作台晾30min。将愈伤组织转至N6B5S1筛选培养基含25mgL潮霉素，400mgL头孢霉素，26℃暗培养2周。将愈伤组织转至N6B5S2筛选培养基含50mgL潮霉素，300mgL头孢霉素，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。将生长旺盛的抗性愈伤组织转至铺有3层滤纸的干燥培养皿内，26℃干燥2-3天。将干燥的愈伤组织转至MS分化培养基上，26℃暗培养1周，转变培养条件28℃12d时光照25℃8小时黑暗。每2周继代一次，至产生再生苗。将再生的抗性苗转至新鲜的MS培养基生根。待再生苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至温室或大田中。实施例2OsMADS47转基因水稻籽粒长度增加为了研究OsMADS47的功能，对转基因水稻植株和野生型水稻植株的籽粒表型进行了分析。首先对所获得的两个T3代转基因纯合株系OE-1、OE-2进行PCR鉴定，所用引物为正向引物5'-GATCCTACCCATACGATGTTCC-3'和反向引物5'-TCCAGTCCATCGATCTCATCC-3'，其中一条引物位于载体上，另一条引物位于连入载体的OsMADS47基因上。结果显示，所获得的转基因纯合株系OE-1、OE-2的各个单株均具有目的大小片段，与之相比，野生型对照中无该片段图2A。这说明目的载体已插入转基因纯合株系OE-1、OE-2基因组中，为阳性株系。进一步分析了OE-1、OE-2纯合转基因株系的籽粒表型，发现OE-1、OE-2两个转基因株系的籽粒长度极显著的高于野生型图2B。进一步对籽粒的粒长、粒宽及厚度进行了测定，统计结果见图2C、2D和2E。野生型籽粒长度为4.93mm,而OsMADS47基因超表达株系OE-1和OE-2的籽粒长度则分别为6.08mm和6.44mm,分别比野生型增加了23％和30％。同时OE-1和OE-2的籽粒宽度较野生型极限著降低，而籽粒厚度与野生型相比无显著变化。这说明OsMADS47基因对水稻籽粒长度具有正向调控作用。实施例3转基因水稻中OsMADS47转录水平及蛋白水平上表达分析为了进一步确认转基因株系OE-1和OE-2籽粒长度增加的表型是由OsMADS47超表达所致，进一步对转基因水稻中OsMADS47的转录水平及蛋白水平上进行了分析。利用TRIzol提取液提取野生型日本晴及转基因株系OE-1和OE-2水稻叶片总RNA，DNAase消化DNA，反转录成cDNA作为模板。用表1中的引物进行Real-timePCR扩增，分析转基因株系中OsMADS47基因的表达量。结果如图3A所示，在转基因株系OE-1和OE-2中，OsMADS47基因相对表达量极显著的高于野生型对照，分别是野生型对照的112倍和193倍。由于植物双元表达载体pCAMBIA1305.1-APFHN所连入基因的N段融合有Flag和HA标签序列，因此可以用Flag或HA的抗体检测外源蛋白OsMADS47的表达情况。提取野生型、转基因株系OE-1和OE-2的总蛋白进行westernblot检测，结果如图3B所示。野生型中没有外源OsMADS47表达的信号，而转基因株系OE-1和OE-2的各个单株均可以检测到外源OsMADS47的表达，并且OE-2转基因株系的OsMADS47蛋白表达量高于OE-1株系，这与其OsMADS47基因的转录水平相一致。同时转基因株系OE-2的籽粒长度也高于株系OE-1，因此OsMADS47的表达水平与籽粒长度具有正相关性，即OsMADS47基因的表达水平越高，籽粒长度越长。表1Real-timePCR扩增所用引物5'→3'实施例4OsMADS47转基因水稻中籽粒长度相关基因的表达情况分析由于OsMADS47基因编码一个含有MADS-box结构域的转录因子，为了分析OsMADS47基因调控水稻籽粒长度的分子机制，进一步利用Real-timePCR技术分析了OsMADS47超表达对粒长相关基因的影响，所用引物见表2。在OE-1和OE-2转基因株系中油菜素内酯相关基因OsBRI1、D11及DLT等基因的表达量均极限著降低，这些基因位于油菜素内酯信号转导途径中并参与对籽粒大小的调控。另外，OsPPKL1和OsPPKL2在OE-1和OE-2转基因株系中的表达量也极显著的低于野生型对照。以往研究表明，qGL3qGL3.1OsPPKL1编码一种含有两个Kelch功能域的丝氨酸苏氨酸磷酸酶，是PPKL蛋白家族成员之一。细胞周期蛋白Cyclin-T1；3是其底物，OsPPKL1能够直接对Cyclin-T1；3进行去磷酸化，通过调节Cyclin-T1；3的磷酸化状态来控制颖壳细胞分裂快慢进而调控籽粒大小。OsPPKL1与OsPPKL3处于一个小基因家族的同一个分支，对油菜素内酯信号转导途径起负调控作用，超表达OsPPKL1和OsPPKL3均会导致籽粒变短。在OsMADS47基因超表达的株系中，OsPPKL1、OsPPKL3、OsBRI1、D11及DLT的表达量降低，这暗示它们可能是OsMADS47转录因子调控的下游基因，进而影响籽粒大小。图4表2Real-timePCR扩增所用引物5'→3'虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用，其特征在于，在水稻中过表达OsMADS47基因以增加转基因水稻的籽粒长度；其中，OsMADS47基因的CDS序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提取水稻总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增获得OsMADS47基因的CDS序列，并将所述CDS序列构建到植物双元表达载体中，转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物双元表达载体为pCAMBIA1305.1-APFHN。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用农杆菌介导的转化方法，以水稻成熟胚愈伤组织作为受体材料，进行水稻的转化。5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，采用PCR法鉴定阳性转基因水稻植株，PCR扩增所用引物为：正向引物：5'-GATCCTACCCATACGATGTTCC-3'反向引物：5'-TCCAGTCCATCGATCTCATCC-3'。6.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，转化的水稻品种为日本晴‘Nipponbare’。

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