申请/专利权人：中国人民解放军总医院;山东大学

申请日：2018-12-13

公开（公告）日：2019-04-12

公开（公告）号：CN109602751A

主分类号：A61K31/58(20060101)

分类号：A61K31/58(20060101);A61K45/06(20060101);A61P31/04(20060101);A61P29/00(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2021.04.27#发明专利申请公布后的视为撤回;2019.05.07#实质审查的生效;2019.04.12#公开

摘要：本发明公开了渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用。通过对细菌感染的人的细胞进行RNA‑seq转录组分析，基于共表达通路和药物基因集富集分析方法，得到具有抗菌消炎作用的候选药物列表，发现其中包括若干具有抗菌消炎作用的上市药物，之前未被发现有抗菌消炎作用的渥曼青霉素位列其中，并在细胞水平上验证了其效果强于常见抗菌消炎药物甲硝唑及庆大霉素的作用，因此，渥曼青霉素可以应用于制备抗菌消炎药物。

主权项：1.渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用，所述的渥曼青霉素的结构式如下：

全文数据：渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用技术领域本发明涉及药物新用途，特别涉及渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用，属于生物医药领域。背景技术渥曼青霉素Wortmannin，是绳状青霉真菌Penicilliumfuniculosum的一种类固醇代谢物，是磷酸肌苷3-激酶PI3Ks的非特异性共价抑制剂。其分子量为428.43，CAS编码为19545-26-7。渥曼青霉素对PI3Ks的体外抑制浓度IC50约为5nM，使其比另一种常用的PI3K抑制剂LY294002更有效。在体外，它对I，II，III类PI3K家族成员具有相同的抑制效果，同时高浓度的渥曼青霉素也可以抑制mTOR，DNA-PKcs，一些磷脂酰肌醇4激酶,肌球蛋白轻链激酶MLCK和增殖蛋白激酶MAPK等PI3K-相关酶参见FerbyI,WagaI,KumeK,SakanakaC,ShimizuT:PAF-inducedMAPKactivationisinhibitedbywortmannininneutrophilsandmacrophages.AdvExpMedBiol1996,416:321-326.。渥曼青霉素也被报道可以抑制polo-样激酶家族成员，其抑制率IC50与PI3K的范围一样参见LiuY,JiangN,WuJ,etal.Polo-likeKinasesInhibitedbyWortmanninLabelingsiteanddownstreameffects[J].JournalofBiologicalChemistry,2007,2824:2505-11.。在组织培养中，渥曼青霉素的半衰期约为10分钟，这是因为存在高度反应性的C20碳，而C20碳也负责其共价灭活PI3K的能力。渥曼青霉素是一种常用的细胞生物学试剂，以前曾用于抑制DNA修复、受体介导的内吞作用和细胞增殖参见KimSH,JangYW,HwangP,KimHJ,HanGY,KimCW:Thereno-protectiveeffectofaphosphoinositide3-kinaseinhibitorwortmanninonstreptozotocin-inducedproteinuricrenaldiseaserats.ExpMolMed2012,44:45-51.。渥曼青霉素已在科学研究中被用于DNA修复、受体介导的胞吞作用、细胞增繁等细胞生物学实验中参见LiuY,ShrederKR,GaiW,CorralS,FerrisDK,RosenblumJS.Wortmannin,awidelyusedphosphoinositide3-kinaseinhibitor,alsopotentlyinhibitsmammalianpolo-likekinase.ChemBiol.2005；12:99–107.。通过抑制PI3K，渥曼青霉素能够增强TLR介导的诱导型的一氧化氮合成酶induciblenitric-oxidesynthase，iNOS的表达，激活NF-κB，上调细胞因子mRNA的产生参见HazekiK.etal,2006.OppositeEffectsofWortmanninand2-4-Morpholinyl-8-phenyl-14H-benzopyran-4-oneHydrochlorideonToll-LikeReceptor-MediatedNitricOxideProduction:NegativeRegulationofNuclearFactor-{kappa}BbyPhosphoinositide3-Kinase.Mol.Pharmacol.,69:1717-1724.。另外，该化合物也可以抑制自噬体的形成参见BlommaartEF.etal.,1997.Thephosphatidylinositol3-kinaseinhibitorswortmanninandLY294002inhibitautophagyinisolatedrathepatocytes.Eur.J.Biochem.243:240–246.，并有效抑制DNA-PKATM，在无细胞试验中IC50为16nM和150nM。因此，渥曼青霉素的医药用途需要进一步的开发。专利文献一种抗癌药物组合物CN1875959A公开了一种抗癌药物组合物，其特征在于该组合物的抗癌有效成分为：2-30％渥曼青霉素和2-20％尼莫司汀，或2-30％渥曼青霉素和2-20％洛莫司汀，或2-30％渥曼青霉素和2-20％司莫司汀，或2-30％渥曼青霉素和2-20％甲基洛莫司汀，以上均为重量百分比；组合物的其他组分为药用辅料。该发明公开了渥曼青霉素在制备抗癌药物中的应用。专利文献包含渥曼青霉素的组合物及其在减缓人体毛发生长中的局部应用CN101170992A公开了包含渥曼青霉素的组合物及其在减缓人体毛发生长中的局部应用。细菌感染细胞后会导致细胞产生炎症反应，进一步导致细胞凋亡，严重影响人类健康。因此，研发多种抗菌消炎药物是解决细菌感染的关键方法。具核梭杆菌Fusobacteriumnucleatum，Fn属于革兰氏阴性无芽孢梭形杆菌，专性厌氧菌，是牙周炎主要致病菌之一。具核梭杆菌是一种与牙周病及身体其他各部位疾病有密切联系的病原菌。目前，根据现有技术，渥曼青霉素主要用于DNA修复、受体介导的胞吞作用、细胞增繁等细胞生物学研究中，尚未见有关渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用的报道。发明内容本发明的目的是提供渥曼青霉素的新应用，具体为在制备抗菌消炎药物中的应用。术语说明：本发明所述的渥曼青霉素的结构式如下，市场可购买或者按现有技术化学合成制得。本发明的技术方案如下：渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用。根据本发明优选的，所述的应用中，所述的抗菌指具核梭杆菌Fn，即渥曼青霉素在制备抗具核梭杆菌Fn药物中的应用。上述的渥曼青霉素包括渥曼青霉素以及渥曼青霉素临床上可接受的盐，含有渥曼青霉素的复方药物组合物及临床上可接受的制剂。所述的制剂剂型可以是注射剂、溶液剂、乳剂、口服液、混悬剂、膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冻干粉针剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、贴剂等。本发明所述的应用中，渥曼青霉素单独使用或者与其他抗菌消炎药物联合应用。优选的，所述的抗菌消炎药物包括甲硝唑、庆大霉素、阿奇霉素、亚胺培南、美罗培南、诺氟沙星中的一种或几种。有益效果本发明基于具核梭杆菌Fn细菌感染HGF细胞产生的转录组数据，基于药物重定位分析软件cogena找到候选药物渥曼青霉素，结合通路分析结果中差异基因与大量炎症相关通路高度相关，初步认为渥曼青霉素具有抗菌消炎作用。另外，基于细胞生物学实验测定细胞内活性氧ROS的水平，进一步认为渥曼青霉素具有抗菌消炎作用。本发明中仅使用了具核梭杆菌Fn，但是该药物可以推广到其他细菌中。因此，本发明扩展了渥曼青霉素的制药用途，公开了渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用，为临床治疗炎症疾病提供了一种新的治疗选择。附图说明图1是具核梭杆菌形态学特征图。图2是人牙龈成纤维细胞形态学特征图P4,HGF,X100。图3是Fn细菌感染HGF的共表达基因簇热图分析图。基于cogena软件，使用kmeans聚类方法，选取聚类数为3，C_xh和F_xh分别代表在x小时时对照组和Fn处理组。该图可以较为宏观地看到细菌感染细胞后的基因表达变化特征。图4是Fn感染HGF的KEGG信号通路富集分析图。Y轴显示了KEGG信号通路，X轴显示了三个聚类簇和所有差异表达基因，得分代表通路在该基因簇的cogena富集得分。，发现大量免疫、细菌感染及代谢相关的信号通路。图5是Fn细菌感染HGF细胞的药物重定位分析图。Y轴显示了候选药物，X轴显示了三个聚类簇和所有差异表达基因，得分代表候选药物在该基因簇的cogena富集得分。验证了抗肿瘤抗生素格尔德霉素Geldanamycin，第五位和抗真菌抗生素曲古抑菌素trichostatinA，第十九位的抗菌作用，发现渥曼青霉素Wortmannin位列富集分析结果并列第十一位。结合共表达通路分析中大量炎症反应富集的结果，渥曼青霉素具有抗菌消炎作用。图6是候选药物在细胞内的活性氧ROS水平。NC:阴性对照PC:阳性对照庆大霉素+甲硝唑，***P0.001，与NC比较，###P0.001，与Fn组比较。Fn能显著提高细胞内活性氧的产生，渥曼青霉素能抑制Fn诱导的细胞内活性氧的产生，且其作用效果强于常见抗生素甲硝唑及庆大霉素作用。具体实施方式下述实施例用于进一步说明但不限于本发明。1.材料与方法：1.1细菌和细胞具核梭杆菌F.nucleatum，Fn，ATCC25586从山东省口腔组织再生重点实验室冻存菌种库获得。牙龈成纤维细胞HGF：从6名18-30岁阻生牙拔除术志愿者患者分离得到。1.2试剂去纤维蛋白羊血海博生物公司，青岛，山东，中国、PBS索莱宝，北京，中国、氯化血红素-维生素K1海博生物公司，青岛，山东，中国、脑心浸液血培养基索莱宝，北京，中国、BHI液体培养基索莱宝，北京，中国、I型胶原酶索莱宝，北京，中国、DispaseII分散酶Invitrogen,Carlsbad,CA,USA、细胞内活性氧检测试剂盒贝博，上海、渥曼青霉素Selleck，上海。1.3仪器厌氧培养箱英国DWSDG250-紧凑型厌氧工作站，英国、紫外分光光度计奥盛公司，杭州，浙江，中国、qPCR仪Roche,Basel,Switzerland、T25培养瓶Corning公司，美国。1.4实验设计通过构建具核梭杆菌Fn感染人牙龈成纤维细胞细胞，建立细菌感染细胞模型，按照0，2，6，12，24，48小时获取细胞，提取RNA进行基于二代测序RNA-Seq的转录组分析，得到细菌感染细胞的基因表达谱特征，基于共表达KEGG通路和CMap药物基因集联合富集分析，发现具有抗菌消炎作用的药物候选列表，基于细胞内活性氧ROS的水平评估候选药物的效果。1.5实验过程1.5.1具核梭杆菌Fn分离、培养、鉴定解冻具核梭杆菌F.nucleatum，ATCC25586菌种，接种于含10％去纤维蛋白羊血、0.5％氯化血红素-维生素K1的脑心浸液血培养基上，置于37℃厌氧培养箱中孵育48h至长出菌落，挑取单菌落置于100mLBHI液体培养基中增殖至对数生长期，6000rpm×5min离心新鲜菌液，无菌PBS洗涤菌体2次，重悬于BHI培养液，紫外分光光度计测定OD600nm吸光度值，完成OD值与细菌数目之间换算，利用特异引物行qPCR鉴定，获得具核梭杆菌见图1备用。提取该细菌DNA,，经过PCR扩增，扩增产物送华大基因有限公司进行16S测序，测序结果于HOMD数据库比对，经鉴定为FN25586菌株。1.5.2人牙龈成纤维细胞HGF分离培养招募18-30岁阻生牙拔除术志愿者患者6名，知情同意，获取牙龈组织。离体牙龈组织浸于无菌PBS中，迅速从临床转移到实验室，于无菌超净台内行PBS冲洗，剪碎成1-3mm2大小碎片，搜集碎片于无菌EP管中，I型胶原酶及DispaseII分散酶消化2h,将消化后的细胞悬液置于T25培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱孵育约7-10天，细胞生长，增殖，待细胞汇合达80％-90％，以1：3稀释比例进行传代，扩大培养。细胞生长到第4代，保存，备用见图2。1.5.3.具核梭杆菌Fn处理人牙龈成纤维细胞HGF，进行转录组测序分析同时培养5个患者的P4代HGF，胰酶消化，血球计数板计数，分别接种于6孔板中2X105cell孔，待细胞贴壁生长后，用Fn感染HGFFn:HGF＝100:1，未感染组作为对照,感染时间分别为2，6，12，24，48小时，感染结束后，用Trizol裂解细胞，将细胞裂解液分别收集于无酶EP管中，编号细胞来源编号为B、C、D、E、F，对照组为C，实验组为F，时间用数字来表示，例如：B2C代表细胞源于B患者，2代表2h，C代表未处理组，送华大基因有限公司进行基于RNA-Seq的测序，获得细菌感染细胞的时间序列的转录组特征。1.5.4基于共表达通路和药物基因集的联合分析发现细菌感染细胞的相关通路和候选药物共表达富集分析采用申请人之前开发的共表达基因集富集分析R软件包cogena，选择K-means聚类方法，聚类簇为3。通路基因集选择KEGG信号通路，药物基因集选择CMap药物集，统计学检验方法为超几何分布假设检验方法。基于热图、通路或药物富集图呈现结果。2.实验结果2.1Fn细菌感染人牙龈成纤维细胞HGF的基因表达变化特征针对不同时间点2，6，12，24，48小时，分别基于limma软件包分析得到差异表达基因，取差异基因的交集获得971个基因使用cogena呈现热图见图3，可以较为宏观地看到细菌感染细胞后的基因表达变化特征，该图中横轴是按照自然时间变化的样本，纵轴代表基因表达谱，主要分为三个共表达聚类簇cluster，其中聚类簇1和2为细菌感染细胞后上调基因簇、3为下调基因簇。2.2共表达通路分析若干免疫和代谢相关的通路基于上述热图分析结果，进行共表达基因KEGG信号通路分析图4，发现大量免疫、细菌感染及代谢相关的信号通路，如细胞因子与细胞因子受体相互作用通路cytokinecytokine-receptorinteractionpathway、幽门螺旋杆菌感染上皮细胞信号通路epithelialcellsignalinginhelicobacterpyloriinfectionpathway、利什曼原虫感染信号通路leishmaniainfectionpathway、谷胱甘肽代谢通路glutathionmetabolismpathway等。2.3共表达药物重定位分析通过热图和通路富集图，发现Fn细菌感染HGF细胞的基因表达谱特征，使用cogena软件针对共表达基因聚类簇1进行计算药物重定位分析，结果如图5所示部分其他候选药物已遮挡，验证了抗肿瘤抗生素格尔德霉素Geldanamycin，第五位和抗真菌抗生素曲古抑菌素trichostatinA，第十九位的抗菌作用，发现渥曼青霉素Wortmannin位列富集分析结果并列第十一位。结合共表达通路分析中大量炎症反应富集的结果，渥曼青霉素具有抗菌消炎作用，有望开发成具有抗菌消炎作用的药物。2.4细胞内活性氧ROS水平评估接种牙龈成纤维细胞到96孔板8000个孔,细胞贴壁后，利用渥曼青霉素预处理细胞24小时，同时阳性对照组加入甲硝唑及庆大霉素预处理24h，阴性对照及Fn组加入完全培养基进行培养24h，之后利用Fn刺激细胞24h,利用细胞内活性氧检测试剂盒检测各实验组细胞内ROS产生水平。实验结果表明Fn能显著提高细胞内活性氧的产生，渥曼青霉素能抑制Fn诱导的细胞内活性氧的产生，且其作用效果强于常见抗菌消炎药物甲硝唑及庆大霉素作用见图6。因此，渥曼青霉素能够应用于制备抗菌消炎药物中。

权利要求：1.渥曼青霉素在制备抗菌消炎药物中的应用，所述的渥曼青霉素的结构式如下：2.如权利要求1所述的应用，其特征在于是渥曼青霉素在制备抗具核梭杆菌Fn药物中的应用。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于上述的渥曼青霉素包括渥曼青霉素以及渥曼青霉素临床上可接受的盐，含有渥曼青霉素的复方药物组合物及临床上可接受的制剂。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于临床上可接受的制剂剂型为注射剂、溶液剂、乳剂、口服液、混悬剂、膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冻干粉针剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、贴剂。5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于渥曼青霉素单独使用或者与其他抗菌消炎药物联合应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的抗菌消炎药物包括甲硝唑、庆大霉素、阿奇霉素、亚胺培南、美罗培南、诺氟沙星中的一种或几种。

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