申请/专利权人：河南中医药大学

申请日：2019-08-14

公开（公告）日：2019-11-01

公开（公告）号：CN110393732A

主分类号：A61K36/185(20060101)

分类号：A61K36/185(20060101);A61P1/00(20060101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2024.02.27#发明专利申请公布后的驳回;2019.11.26#实质审查的生效;2019.11.01#公开

摘要：本发明涉及金匮要略方诃梨勒散水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用，可有效解决制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC‑1、TE‑1细胞的药物问题，诃梨勒散药物为诃子10g，加药物重量15‑20的水浸泡1小时，电炉武火煮沸，文火煎煮1h，过滤，滤液浓缩，该浓缩液具有显著抑制食管癌EC9706、Eca109、EC‑1、TE‑1细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC‑1、TE‑1细胞的药物。本发明原料丰富，制备方法简单，易生产制备，为研究抑制食管癌细胞迁移、增殖、浸润的方剂提供了理论和技术支持，治疗食管癌有实际的临床意义。

主权项：1.一种金匮要略方诃梨勒散水提物在制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞药物中的应用，诃梨勒散药物为诃子10g，加药物重量15-20的水浸泡1小时，根据金匮要略原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，纱布滤去残渣，过滤，滤液浓缩至含生药量为0.5gmL的浓缩液。

全文数据：金匮要略方诃梨勒散水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用技术领域本发明涉及医药，特别是一种金匮要略方诃梨勒散水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用。背景技术食管癌主要有食管鳞癌和腺癌两种病理类型，据2018年全世界癌症报告显示，亚洲仍然是食管鳞癌的高危地区，在我国主要以食管鳞癌为主，长期吸烟，过度饮酒，饮食过快、过热，喜爱食用腌菜，爱咀嚼槟郎，心理因素，家族史，饮食习惯，健康意识等与食管癌的发生关系密切。引起食管癌的主要原因总结为吸烟、肥胖和胃酸反流等。食管癌早期症状大多不甚明显，部分患者会出现进食吞咽时梗塞感，剑突或胸骨后不舒服或疼痛感，食物通过缓慢及滞留感，咽喉干燥和紧缩感等表现；临床诊治大多数食管癌患者发现吞咽困难时已经发生转移，处于中晚期，这时会出现进行性吞咽困难、体重下降、烧心、消化道出血等表现，用药效果不甚明显，预后效果很差，失去了根治机会，5生存率只有10％左右，但早期食管癌上皮内癌和黏膜内癌的5年生存率可达90％以上。目前虽然关于食管癌早期诊断、早期治疗的技术有所提高，但大部分食管癌患者依然是出现了转移才明确诊断的。目前西医治疗食管癌早期及中期以手术切除为主，配合放、化疗及靶向治疗为辅。但食管癌起病多隐匿，早期症状不明显，很多患者确诊时已发展至晚期，有手术机会的患者仅占20％～30％。90％以上的食管癌患者需要接受化疗，但由于食管癌常发生淋巴结复发转移，因此难以根治，且以化疗为主结合放疗的综合治疗手段，多以铂类药物为主，多年来的临床实践证明，此疗效并不十分理想，存在无效、复发、耐药、转移等问题，不良反应明显，治疗后5年存活率仅为14％，且放疗、化疗等手段主要的作用机制在于直接杀伤肿瘤细胞，但同时正常细胞也被大量杀伤，进而使人体的免疫系统收到破坏。这种治疗方式多数情况下不能从根本上治疗癌症，甚至会加重免疫系统的破坏并导致基因突变，因此食管癌的治疗亟需除手术以外的其他方法治疗。食管癌患者特别是中晚期错过手术时机的病人，疗效更差。而中医药在扶助人体正气，调整人体气血阴阳平衡方面有不可替代的优势，，有广阔的应用空间，对中晚期病人可以单独使用，也可以联合用药，对于年老且不能耐受手术的病人的应用，对于复发转移病人的运用，对于手术后病人的运用。因此运用中医药治疗食管癌成为越来越重要的手段。现代科技突飞猛进，在医学上运用现代分子生物学技术对食管癌已经进行了许多方面的研究，指出食管癌的恶性特征之一是其细胞的无限增值能力，与其他多数癌症一样，导致食管癌患者死亡的重要原因是转移和浸润，同时也是临床面临的最大治疗障碍。增殖、迁移、浸润是肿瘤细胞重要的生物学特性，所以，找到可以抑制食管癌细胞迁移、增殖、浸润的方剂，那么在食管癌的临床治疗中肯定会有深远意义。但至今未见有公开报导。发明内容针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种金匮要略方诃梨勒散水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用，可有效解决制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的药物问题。本发明解决的技术方案是，从《金匮要略》157方中除去与《伤寒论》重复方剂筛选出诃梨勒散，诃梨勒散药物为诃子10g，加药物重量15-20的水浸泡1小时，根据金匮要略原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，纱布滤去残渣，过滤，滤液浓缩至含生药量为0.5gmL的浓缩液，该浓缩液具有显著抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的药物。本发明原料丰富，制备方法简单，易生产制备，开拓了诃梨勒散的药用价值和商业价值，特别是为研究抑制食管癌细胞迁移、增殖、浸润的方剂提供了理论和技术支持，治疗食管癌有实际的临床意义，经济和社会效益显著。附图说明图1为本发明诃梨勒散对食管癌TE-1细胞增殖的影响曲线图。图2为本发明诃梨勒散对食管癌TE-1细胞迁移的影响曲线图。图3为本发明诃梨勒散对食管癌TE-1细胞浸润的影响曲线图。图4为本发明诃梨勒散对食管癌EC-1细胞增殖的影响曲线图。图5为本发明诃梨勒散对食管癌EC-1细胞迁移的影响曲线图。图6为本发明诃梨勒散对食管癌EC-1细胞浸润的影响曲线图。图7为本发明诃梨勒散对食管癌Eca109细胞增殖的影响曲线图。图8为本发明诃梨勒散对食管癌Eca109细胞迁移的影响曲线图。图9为本发明诃梨勒散对食管癌Eca109细胞浸润的影响曲线图。图10为本发明诃梨勒散对食管癌EC9706细胞增殖的影响曲线图。图11为本发明诃梨勒散对食管癌EC9706细胞迁移的影响曲线图。图12为本发明诃梨勒散对食管癌EC9706细胞浸润的影响曲线图。具体实施方式以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。运用MTT法，从《金匮要略》157首方中筛选出可以显著抑制食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1活性的有效方剂；倒置显微镜观察筛选出的有效方剂对食管癌四种细胞形态的改变，并拍照记录；流式细胞术检测并分析筛选出的方剂对食管癌四种细胞生长周期的影响；应用RTCA实时无标记细胞分析仪，实时监测、研究并分析筛选出的方剂对食管癌四种细胞增殖、迁移、浸润的影响；用软琼脂克隆形成实验，观察并分析筛选出的方对食管癌四种细胞克隆形成的影响，是诃梨勒散，诃梨勒散药物为诃子10g，加药物重量15-20的水浸泡1小时，根据金匮要略原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，纱布滤去残渣，过滤，滤液浓缩至含生药量为0.5gmL的浓缩液，该浓缩液具有显著抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的药物。经实验取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：1材料与方法1.1材料1.1.1细胞人食管癌细胞株EC9706、Eca109由北京协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，人食管癌细胞株EC-1、TE-1购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。1.1.2方药来源本实验所选方为《金匮要略》全部方共计157首原书共205首方，其中4首只列方名未载药物，除去与《伤寒论》重复方剂，共157首，所用中药购于河南中医药大学第三附属医院。1.1.3细胞培养的主要试剂及设备RPMI1640培养基、DMEM培养基GIBCO公司、胎牛血清FBSAusGeneX公司、胰蛋白酶Sigma公司、DMSO二甲基亚砜Amresco公司、MTTSigma公司、ELx800型酶标仪BIO-TEK公司、FACSCalibur流式细胞仪BD公司、Matrigel胶Corning公司、RTCAxCELLigenceDPsystem、E-Plate16VIEW检测板、CIM-Plate16夹具、CIM-Plate16检测板艾森生物科技有限公司、细胞周期试剂盒KeyGENBioTECH公司、琼脂糖BioWest公司1.2方法1.2.1药物配制按《金匮要略》原方剂药物组成和用量配方，就原方总量的一定比例取药，让每付方剂总重量在10g以上，单味中药用量保持在3g以上，根据方剂总重量，超纯水用量是每付方剂总重量的15-20倍，选择合适大小的烧杯，清洗干净后烘干，打开精密电子称，准确称取每首方剂中的药物，称量后放入清洗干净烘干的烧杯中，并在烧杯瓶身做好标记，先用超纯水洗去杂质，再加15-20倍超纯水，用干净的保鲜膜盖好烧杯口，浸泡1小时，根据《金匮要略》原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，六层纱布滤去残渣，过滤至干净的50mL离心管中，其滤液浓缩至含生药量为0.5gmL。将滤液3000rmin离心30min，取上清，双层滤纸过滤。然后在超净台里用0.22μm微孔滤器过滤至消毒过的15mL离心管中，测其药液浓度，用封口条带封好离心管口，做好标记和日期，-20℃避光保存、备用。取一定量的药液，用含10％的胎牛血清的培养基，采用倍比稀释法，配制成浓度为12.5μgmL、25μgmL、50μgmL、100μgmL、200μgmL、400μgmL、800μgmL、1600μgmL的8个浓度梯度药液，-20℃冰箱避光保存、备用。1.2.2细胞培养从液氮中迅速取出冻存的细胞株EC9706、ECa109、EC-1、TE-1，1min内水浴快速解冻细胞。吸出细胞悬液转移到15mL离心管中，分别补加10mLDMEM或RPMI1640培养基，吹打混匀，1000rpm×10min离心，弃上清，加入不含血清的培养基5mL，吹打混匀，细胞计数，EC9706、细胞用含10％胎牛血清的MEM培养基以1×106个细胞皿10mL细胞悬液接种于培养皿中，ECa109、EC-1、TE-1细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基以1×106个细胞皿10mL细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，2～3天传代1次。1.2.3MTT法检测《金匮要略》方剂抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的量效关系细胞接种：取对数生长期的食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞，胰蛋白酶消化、离心，计数后以1×106个板的细胞密度接种于96孔平面培养板，200μl孔，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱培养中培养。药液配制：选取一定量的药液，用含10％胎牛血清FBS的培养基，采用倍比稀释法配制成浓度为12.5μgmL、25μgmL、50μgmL、100μgmL、200μgmL、400μgmL、800μgmL、1600μgmL的8个浓度梯度药液。细胞贴壁24h后，弃上清，分别加入各备选药物，200μl孔，前3列作为对照组，用200μL移液枪加入含10％胎牛血清FBS培养基200μL孔，后九列分别加入已经配好的待测药液加之前每个EP管内液体都要振荡均匀，依次对应，加完药液后置于37℃、饱和湿度的、5％CO2细胞培养箱中继续培养，药物作用48h后，弃上清，每孔加入100μl含10％MTT的培养基，放置培养箱4个小时后，弃孔内上清液，每孔加入150μlDMSO，放置于摇床上晃动15分钟待孔内台盼蓝充分溶解混匀后用酶标仪波长设置为570nm630nm测光吸收值即OD值，将结果输入excel表格，按照公式计算：抑制率％＝1-加药组OD值对照组OD值×100％，计算出所测方剂的不同药物浓度对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的抑制率。初筛筛选结果标准：考虑到药物、试剂、设备、操作因素等，最高浓度的抑制率必须在30％以上，IC50﹤1600μgmL，且只要有一种细胞符合即可。将初筛出抑制率较高的方剂再次进行复筛，直至结果稳定，复筛筛选结果标准：浓度在200μgmL时抑制率必须在30％以上，符合四种细胞，有浓度梯度趋势，IC50﹤600μgmL，选出对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞抑制率均高且稳定的方剂，进行时效检测，并绘制量效、时效关系曲线。1.2.4用倒置显微镜仔细观察四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1形态变化将食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1以1×106cells皿的形式接种于培养皿中。设对照组、诃梨勒散组，细胞培养时间达到24h后，吸走上清液，往相应的细胞培养皿中加入半数抑制率IC50为最终浓度的含10％胎牛血清FBS的培养基，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱继续培养。药物作用48h后，取出细胞培养皿，置于倒置显微镜下，仔细观察每组细胞形态学变化，每组细胞在倒置显微镜下同时放大100倍、200倍、400倍拍照，做好记录。1.2.5细胞周期分析分别以1×106个细胞皿接种四种细胞到Φ10cm培养皿中，每种细胞分别设置空白对照组、诃梨勒散组，置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24小时后，吸走上清液，在相应的细胞培养皿中加入半数抑制率IC50为最终浓度的含％10胎牛血清FBS的培养基。继续培养48小时后，弃各皿上清，PBS清洗细胞两次，每皿加3mL0.25％胰蛋白酶消化，3～5分钟后倒置显微镜下观察细胞开始脱壁，加3mL含血清培养基终止消化，将细胞悬液转至15mL离心管内进行离心，2000rpmmin，5min，弃上清。之后四种细胞分别按细胞周期试剂盒步骤要求处理细胞，最后300目尼龙滤膜直接过滤到流式检测管中，每样本获取2×104个细胞荧光信号，激发波长488nm，用CellQuestPro获取、MODFIT软件检测食管癌四种细胞EC-1，Eca109，TE-1，EC9706周期分布。周期分布用G0G1％，S％，G2M％表示。1.2.6细胞增殖、迁移、浸润检测先将matrigel基质胶4℃融化，使用预冷的无血清培养基按1:40比例稀释matrigel胶，冰上操作，防止matrigel胶凝固，超净台内将做浸润实验的CIM-Plate板上室和下室从包装袋中取出，将CIM夹具放在超净台上，使蓝色标志点位于夹具的左上方，将上室平稳地放到夹具对应的凹槽中，采用反向加样法，每孔先加入50μl稀释好的matrigel胶，再吸出30μl，整个过程避免产生气泡，孔中最终保留20μlmatrigel胶包被CIM-Plate上室。将CIM-Plate上室连同夹具放入37℃培养箱中使其凝固约4小时，凝固时上室置于CIM夹具上，保证悬空不触碰电极。待matrigel胶凝固后，开始细胞浸润、迁移、增殖实验：1待matrigel胶凝固后，将CIM夹具放在超净台上，使蓝色标志点位于夹具的左上方，将做浸润和迁移实验的CIM-Plate板下室平稳放到CIM夹具对应凹槽中，在下室对照组每孔中加入165μl含血清培养基，加药组每孔加入含有IC50浓度药液的含血清培养基165μl，各组三个复孔，注意加液时避免产生气泡，使加入的培养基在下室的孔内形成凸出的弯月面。2将夹具连同下室沿逆时针旋转90度，然后分别将迁移板上室和铺有matrigel胶的浸润板上室中传感器一面置于各自下室上并按压扣上，放置时注意上、下室贴有蓝点的孔相对应，要避免气泡的产生。将上室放到下室上之后，立即用手向下按压，可听到两次卡扣卡入的声音。3在迁移和浸润板上室中均加入30μl无血清培养基，将CIM装置置于培养箱中平衡1小时，平衡后放到实时无标记细胞功能分析仪上，系统自动进行扫描“ScanPlate”→检查是否接触良好在“Message”页面显示ConnectionOK→开始检测基线Background确定所选择的孔接触正常，所有孔的CellIndex低于0.063。4在板子平衡期间制备细胞悬液：将细胞培养皿从培养箱中取出，弃去原培养基，加入5mL不含血清培养基，十字摇晃洗细胞，吸去培养基，重复再洗一遍，吸去培养基，加入3mL含0.25％EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆脱壁后加入0.5mL血清中止消化，将细胞液转移到15mL离心管中，1000转分离心10分钟，加入10mL无血清培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度为5×104cellsmL。5将测好基线的CIM迁移板和浸润板从仪器上取出，上室每孔加入100μl含5×103cells无血清细胞悬液，加药组另加入IC50浓度的药液5μl。6细胞接种后将CIM迁移和浸润板在超净台上静置30分钟，待细胞沉降后将迁移和浸润板放回实时无标记细胞功能分析仪上，系统自动扫描“ScanPlate”后，开始细胞迁移和浸润实时动态检测，每隔10分钟测量一次，各检测48小时。7细胞增殖：在超净台内取出E-Plate16板，每孔加入50μl培养基，放到实时无标记细胞功能分析仪上进行自动扫描和基线检测，将做迁移和浸润实验后余下的细胞用含血清培养基制备1×105cellsmL细胞悬液，将测好基线的E-Plate板从仪器上取出，每孔中加入100μl含1×104cells含血清细胞悬液，静置30分钟，放到培养箱中的实时无标记细胞功能分析仪上开始检测。待第二天20-24小时加药组加入IC50浓度的药液5μl，继续检测。1.2.7细胞克隆形成实验先将1.2％琼脂糖放在水浴锅中溶化，然后与2×RPMI1640和2×DMEM含血清培养基含20％FBS，按1:1的比例配置成0.6％的底层琼脂液，打开6孔板，每孔加入3mL0.6％的底层琼脂液，放置超净台内静置凝固。正常处理细胞，消化细胞，细胞计数，调细胞浓度为1×104cellsmL，然后将0.6％的低熔点琼脂糖2×1640和2×DMEM培养基按1:1的比例配置成0.3％的上层琼脂液，每孔加入2mL0.3％的上层琼脂液和100μl细胞悬液500个皿，加药组每孔加入10μl含IC50浓度的药液，接着置于37℃、饱和湿度的、5％CO2细胞培养箱中培养；培养时间为2周然后在倒置荧光显微镜下观察细胞克隆形成情况，最后拍照，计算细胞克隆形成率。细胞克隆形成率＝平均细胞集落数每孔接种细胞数×100％。1.2.8统计分析使用IBMSPSS21.0回归分析对实验结果进行分析。2结果2.1方剂筛选结果运用MTT法，从《金匮要略》157首方中原书共205首方，其中4首只列方名未载药物，除去与《伤寒论》重复方剂，共157首，其中以IC50﹤1600μgmL作为筛选有效方剂的标准，共选出有效方剂36首。然后对这36首方剂进行复筛，复筛3遍，得出11首有效方剂，且这11首对四种细胞增殖均有抑制作用，IC50﹤1600μgmL。对复筛得出的11首有效方剂，再次筛选3遍，最终筛选出诃梨勒散方药组成：诃子10g，水煎剂浓度在200μgmL时抑制率在30％以上，有浓度梯度趋势，IC50﹤600μgmL，对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞抑制率均高且稳定。2.2《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖作用的量效关系方剂8个不同浓度梯度对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的抑制率，随着药物浓度的升高而呈现出增强趋势，表现出明显的剂量-效应依赖关系表1～2。以各方剂的浓度为横坐标，以8个不同浓度梯度的该方对食管癌4种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1增殖的抑制率为纵坐标，运用IBMSPSS21.0软件回归分析进行绘图。表1诃梨勒散抑制食管癌4种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1增殖的量效关系表2水煎剂抑制食管癌4种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1增殖的IC50浓度细胞诃黎勒散水煎剂IC50抑制浓度μgmLEC9706351.162Eca109215.056EC-1223.781TE-149.9312.3《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖作用的时效关系方剂5个不同时间点对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的抑制率，随着药物作用于细胞时间的逐次延长而抑制率呈现上升趋势，表现出明显的时间-效应依赖关系见表3。以各方剂的浓度为纵坐标，以五个不同时间点为横坐标，进行绘图。表3诃梨勒散抑制食管癌4种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1增殖的时效关系2.4《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1形态学影响以《金匮要略》方药物浓度的半数抑制率即IC50值分别作用于人食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞，药物作用48小时后，把细胞置于倒置显微镜下观察其形态变化，分别在放大100倍、200倍、400倍的时候拍照记录。TE-1细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧贴皿壁，形状规则圆润，作三角拖尾状，细胞边界清晰，细胞核表现出明显的分裂相；诃梨勒散组在细胞数量明显下降，细胞形态皱缩，透光度下降。EC-1细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧贴皿壁，贴壁生长，以多边形或梭型的形状存在，细胞核表现出明显的分裂相；诃梨勒散组在细胞数量明显下降，有细胞碎片，透光度下降，细胞之间有宽松间隙。Eca109细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧密排列呈条梭形，紧贴皿壁，贴壁生长诃梨勒散组在细胞数量明显下降，透光度下降，细胞外缘发生形态改变如附图1-2。EC9706细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧密排列呈梭型或者多边形，紧贴皿壁，贴壁生长，细胞边界清晰明了，形态规整，贴壁生长，细胞核表现出明显的分裂相如附图9-11；诃梨勒散组细胞在细胞数量明显下降，透光度下降，细胞外缘发生形态改变，细胞之间有较为宽的间隙如附图12。要说明的是，图1-图12因在做金匮要略方选择试验时，是将诃梨勒散与白头翁加甘草阿胶汤、葶苈大枣泻肺汤同时进行的试验，因此，将诃梨勒散与白头翁加甘草阿胶汤、葶苈大枣泻肺汤的试验结果绘制在一起，以节约资源，提高试验效率，甘草阿胶汤、葶苈大枣泻肺汤另行提出专利申请，特此说明。2.5《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞周期的影响。2.5.1《金匮要略》方应用于人食管癌TE-1对细胞周期的影响与对照组相比，诃梨勒散组在S期增加，诃梨勒散组G2M期的细胞百分比减少。见表4。表4食管癌TE-1细胞周期测定结果2.5.2《金匮要略》方应用于人食管癌EC-1对细胞周期的影响与对照组相比，诃梨勒散组S期细胞百分比增加，G0G1期和G2M期细胞百分比降低。见表5。表5食管癌EC-1细胞周期测定结果2.5.3《金匮要略》方诃梨勒散应用于人食管癌Eca109对细胞周期的影响与对照组相比，《金匮要略》方诃梨勒散组S期增加，G0G1期和的G2M期细胞百分比减少。见表6表6食管癌Eca109细胞周期测定结果2.5.4《金匮要略》方诃梨勒散应用于人食管癌EC9706对细胞周期的影响与对照组相比，诃梨勒散组S期的细胞百分比增加明显，诃梨勒散组G2M期的细胞百分比明显减少，诃梨勒散组G0G1期有所增加。见表7。表7食管癌EC9706细胞周期测定结果2.6《金匮要略》方诃梨勒散对人食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞浸润、迁移、增殖的影响2.6.1《金匮要略》方诃梨勒散对人食管癌TE-1细胞增殖的影响见图1诃梨勒散能抑制食管癌TE-1细胞的增殖。2.6.2《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌TE-1细胞迁移的影响见图2诃梨勒散能抑制食管癌TE-1细胞的迁移。2.6.3《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌TE-1细胞浸润的影响诃梨勒散能抑制食管癌TE-1细胞的浸润。2.6.4《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC-1细胞增殖的影响诃梨勒散能抑制食管癌EC-1细胞的增殖。2.6.5《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC-1细胞迁移的影响见图5诃梨勒散能抑制食管癌EC-1细胞的迁移。2.6.6《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC-1细胞浸润的影响见图6诃梨勒散能抑制食管癌EC-1细胞的浸润。2.6.7《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌Eca109细胞增殖的影响见图7诃梨勒散能抑制食管癌Eca109细胞的增殖。图7诃梨勒散对食管癌Eca109细胞增殖的影响2.6.8《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌Eca109细胞迁移的影响见图8诃梨勒散能抑制食管癌Eca109细胞的迁移。2.6.9《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌Eca109细胞浸润的影响见图9诃梨勒散能抑制食管癌EC-1细胞的浸润。2.6.10《金匮要略》方诃梨勒散对人食管癌EC9706细胞增殖的影响见图10诃梨勒散能抑制人食管癌EC9706细胞的增殖。2.6.11《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC9706细胞迁移的影响见图11诃梨勒散能抑制食管癌EC9706细胞的迁移。2.6.12《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC9706细胞浸润的影响见图12诃梨勒散能抑制食管癌EC9706细胞的浸润。2.7《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1克隆形成的影响见表8诃梨勒散可以影响食管癌细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1克隆的形成，在食管癌细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1克隆球大小和形态方面，均有明显改变，与对照组相比，加药组细胞形态不规则，克隆球变小。表8《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌四种细胞克隆形成的影响3讨论3.1《金匮要略》与食管癌诊疗之间的关系《金匮要略》为医圣张仲景所著的一部百科式的临床著作，是我国第一部理法方药具备的医学典籍，也是我国现存最早的一部论述诊治杂病的专书，奠定了中医辨证论治的基础。《金匮要略》一方面有中医基础理论的基本内容，另一方面也有临床学科的相关属性。《金匮要略》以脏腑经络论杂病，保持着脏腑辨证的精神，脏腑病证的证候特征，是以其脏腑、经络病变为病理基础的，所以脏腑经络辨证方法，对临床各科皆有普遍指导意义。《金匮要略》运用脏腑经络辨证，一方面对于临床实践上有着很好的指导意义和实用价值，另一方面对于后世临床医学的发展有着重大的意义和深厚的影响，所以，被古今医家赞誉为方书之祖、医方之经，治疗杂病的典范。《金匮要略》中脏腑经络的传变规律与癌症病原发病灶侵犯其他脏器、组织或是癌症转移引起相应的临床表现有许多雷同之处，所以学习《金匮要略》，对于扩宽临床思路，提高综合辨析和诊治疑难病证的能力有着奇特的作用，所以，是学习中医必看的古典医籍，且在癌症的诊疗中具有深远影响。《金匮要略》这一书中并没有叙述食管癌，但其学术思想、诊断治疗对现代食管癌病变的治疗有着重要的影响。在临床实践和理论上对食管癌病变的治疗具有较高的实用价值和指导意义，其中书中所记述的多数方剂目前仍然用于食管癌的治疗。在当前中医临床实践研究中，食管癌的治疗用到鳖甲煎丸、下瘀血汤、大黄蛰虫丸、大柴胡汤皂荚丸、调味承气瓜蒌薤白半夏汤、薏苡附子败酱散等。3.2中医对《金匮要略》方诃梨勒散与食管癌的病机分析3.2.1诃梨勒散与食管癌的病机分析诃梨勒散出自《金匮要略·呕吐哕下利病脉证治第十七》篇，有一条论述，“气利，诃梨勒散主之。”该方剂在《金匮要略》原文中组成简单，就1味中药组成，即诃子。本条论述虚寒性肠滑气利的治法。气利有虚实不同，此处下利泄泻，滑脱不禁，大便随矢气而出，是中气下陷，气虚不顾所致。治宜诃梨勒散敛肺涩肠，止利固脱。方中诃梨勒即诃子，性温味苦酸涩，生用理肺止咳，煨用则专以涩肠固脱，并用粥饮和服，取其益肠胃而建中气。《本草纲目》曰：诃子，苦温无毒，又苦酸平苦重酸轻味浓，阴也降也。主治冷气心腹胀满，下食，破胸膈结气，通利津液，止水道，黑髭发，下宿物，止肠久泄，赤白，消痰下气，化食开胃除烦，治水调中，止呕吐霍乱，心腹虚痛，奔豚肾气，肺气喘急，五膈气，肠风泻血，崩中带下，怀孕漏胎，及胎动欲生，胀闷气喘，并患痢人肛门急痛，产妇阴痛，治痰嗽咽喉不利，含三数枚殊胜，实大肠，敛肺降火。本方为固涩之剂，不仅可以用于本证肠滑气利，也可以用于虚脱不禁之久咳、久泻、久利等病症。若有实邪则不宜使用，以防固涩敛邪，闭门留寇。该条文论述的病机为中气虚陷，日久可导致阳虚，中气虚推动无力可导致在体内形成水湿痰饮，痰饮停滞食管附近，进一步影响气机的运行，气滞痰浊留滞脏腑、经络日久，形成瘀血，结聚在局部形成肿块，导致吞咽困难、疼痛等表现。因此诃子不仅可以治疗虚寒型气利，还可以治疗中气虚陷造成的痰饮阻滞食管造成的食管癌。在临床研究中有出现食管癌术后功能性腹泻的症状，施义教授认为其病机为中气虚陷，因为病人进食不畅，损伤中焦脾胃，再加上手术耗伤人体正气，造成脾胃衰弱，中气虚陷，清浊不分，造成腹泻。因此可以推知，食管癌病人有腹泻的症状，且中医病机为中气虚陷，而诃梨勒散可以治疗中气虚陷造成泄泻痢疾，进一步得知食管癌病机与中气虚陷有关。综上所述，诃梨勒散可以治疗因中气虚陷推动气血运行不畅形成的痰浊瘀血造成的食管癌；热毒伤阴，热毒内蕴，伤阴耗液，炼液成痰，热毒痰浊留滞脏腑、经络日久，形成瘀血，结聚在局部形成肿块造成的食管癌；痰水壅盛，痰性属阴，其性粘滞缠绵，易遏阻于食管，痰浊为有形之邪，易阻碍气机的运行，痰浊阻滞气机，痰气胶阻于咽喉而形成的食管癌。3.3《金匮要略》方诃梨勒散的抗肿瘤研究诃梨勒散，药物组成为诃梨勒诃子。诃子主要包含有三萜酸类成分，体外实验研究表明，诃子水提取剂具有抗菌作用，对淋球菌作用效果很明显，其中对革兰氏阳性球菌抗菌作用效果最好，对大肠杆菌、绿脓杆菌等抗菌作用效果较弱。诃子果实中的诃子酸、没食子酸及丹宁类成分是其抑瘤的主要活性成分，可以明显抑制前列腺癌细胞、乳腺癌、肝癌细胞的生长与活力。赵晓霞等采用低温水提法获取金诃子提取物,发现金诃子低温提取物可以明显抑制神经胶质瘤C6细胞生长，促进C6细胞的凋亡；田云鹏等发现诃子水提物可明显抑制人肺癌A549细胞增殖，诱导A549细胞凋亡，且诱导凋亡与p53基因被激活有关；包志强等研究发现诃子不同水提取物均可抑制肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞增殖。诃子提取物具有抑制阿米巴原虫、增强止泻作用、保肝利胆作用、抗消化道溃疡作用。目前尚无关于诃子治疗食管癌得临床和实验研究报道。3.4《金匮要略》方诃梨勒散对人食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1四种细胞活性的抑制作用《金匮要略》方诃梨勒散分别作用于人食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1四种细胞，结果表明对四种细胞增殖活性的抑制作用呈现出时间依赖和剂量依赖关系。分别作用于四种细胞后，细胞形态变化有较大差异，对不同细胞的作用也有明显差异。EC9706细胞镜下形状多饱满，呈圆形，细胞内可以看到分裂细胞核；Eca109细胞镜下形状多饱满且呈多边形，形态小，分裂细胞核较多；EC-1细胞镜下形状多为梭型且形状多不规则，边界清晰，分裂细胞核明显；TE-1细胞镜下形状多三角形，形态较大，棱角模糊，这说明对分裂能力不同的食管癌细胞的生长均有抑制作用，也说明不同的方作用于食管癌细胞的发病机制可能会有差异，这对于研究经方治疗癌证机制的多重性，有深远作用。另从对食管癌四种细胞周期的影响看，诃梨勒散将食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞周期均阻滞于S期，说明诃梨勒散组将细胞阻断于S期而抑制食管癌细胞生长。3.5《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖、迁移、浸润、克隆的影响诃梨勒散对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的增殖、迁移、浸润、克隆形成率在一定程度上有抑制作用。其中分化程度较高的细胞TE-1和中分化程度的细胞EC9706,迁移、浸润能力较强，效果明显；而分化程度较低的细胞EC-1和细胞Eca109迁移、浸润能力不是很强，效果不太明显，可能与细胞本身特点有关，也有可能是药物对其的影响。作用于细胞增殖时，与对照组相比，刚加药时，细胞出现了短时的增殖高凸，然后出现对增殖的抑制趋势，表明药物作用于肿瘤细胞时做了一个及时反应。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变，贴壁的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞，克隆形成率反映了细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大。从实验结果可以看出，与对照组相比，大小改变，数量减少，表明药物抑制细胞克隆形成。3.6研究《金匮要略》方剂抗食管癌作用的重要意义目前，我国食管癌的发病率和死亡率每年都在呈递增趋势，已经成为威胁人类生命健康的死亡杀手，不仅给家庭带来了沉重的经济负担，给病人带来痛苦，而且也给社会带来巨大的压力。《金匮要略》涉及到多种肿瘤的病因病机、临床表现、治疗方药及预后，药物配方精炼有效，而且药价病人家庭也能相应的负担得起，所以从《金匮要略》中能够找到防治食管癌的有效方剂，对于临床和科研有着深远影响。本发明筛选出得诃梨勒散诃子对食管癌四种细胞均有显著抑制作用，查阅国内外文献资料目前尚无关于诃梨勒散治疗食管癌得临床和实验研究报道，可为临床治疗食管癌提供有效方药，为实验研究提供依据。4.结论1《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1在细胞增殖活性方面有着明显的抑制作用，且对食管癌四种细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖和时间依赖关系。2诃梨勒散将食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞周期均阻滞于S期。3《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1的增殖、迁移、浸润均有抑制作用。4《金匮要略》方诃梨勒散对食管癌四种细胞EC9706、Eca109、EC-1、TE-1的克隆形成均有抑制作用。5食管癌恶性表型与中气虚陷、湿热毒伤阴、痰水壅堵病机相关。以上表明，本发明原料丰富，制备方法简单，易生产制备，具有显著的抑制食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞的药物，开拓了治疗食管癌药物的新途径和诃梨勒散的药物价值和市场价值，是治疗食管癌上的创新，并为实验研究和治疗食管癌提供了理论和技术支持，有显著的经济和社会效益。

权利要求：1.一种金匮要略方诃梨勒散水提物在制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞药物中的应用，诃梨勒散药物为诃子10g，加药物重量15-20的水浸泡1小时，根据金匮要略原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，纱布滤去残渣，过滤，滤液浓缩至含生药量为0.5gmL的浓缩液。

百度查询： 河南中医药大学 金匮要略方诃梨勒散水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用

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