申请/专利权人：江西师范大学

申请日：2019-01-24

公开（公告）日：2019-04-09

公开（公告）号：CN109593820A

主分类号：C12Q1/02(20060101)

分类号：C12Q1/02(20060101);A61K36/45(20060101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2019.07.05#实质审查的生效;2019.04.09#公开

摘要：本发明提供了羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法及其应用。羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法包括挖掘与检测羊踯躅提取物对不同癌细胞的抑制活性、羊踯躅提取物抑制癌细胞克隆形成的检测、羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析、羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析等步骤。本发明为开发羊踯躅治疗癌症药物提供技术支持和科学依据。

主权项：1.一种羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法，包括以下步骤：1挖掘、检测羊踯躅提取物对不同癌细胞的抑制活性：将待检测的几种癌细胞接种于96孔板中，在37℃、5％CO2的培养箱中孵育24小时，用不同浓度的羊踯躅提取物分别处理每种癌细胞，继续培养48～72小时后，用四唑盐比色法MTT法检测羊踯躅提取物对不同癌细胞细胞的增殖抑制作用；2羊踯躅提取物抑制癌细胞克隆形成的检测：将对数生长的结肠癌HT-29细胞在37℃条件下继代培养24小时后，将培养液换成含不同浓度羊踯躅提取物的培养基共同培养，在37℃、5％CO2的培养箱中培养13天后，吸出培养基，用PBS冲洗，用4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，用克隆形成数和克隆形成率来评价羊踯躅提取物对HT-29细胞克隆形成的影响；3羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞继代培养24小时后，将培养基分别替换成含不同浓度羊踯躅提取物的完全培养基，对照组加入等量的含DMSO的完全培养基培养24小时；将细胞制成单个细胞悬液离心收集细胞，通过流式细胞仪检测细胞的凋亡与周期；4羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞接种于6孔板中，孵育过夜；然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时，收集细胞用Trizol提取细胞总RNA；用反转录系统试剂盒反向转录RNA，运用实时荧光定量试剂盒对Bax、Bcl-2、P21和P53等基因表达水平进行定量分析；用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2-ΔΔCT计算基因的表达水平。

全文数据：羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法及其应用技术领域本发明涉及羊踯躅提取物，尤其涉及羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法以及羊踯躅提取物的应用方法。背景技术结肠直肠癌中常见的恶性肿瘤，其全球发病率6.1％位于癌症相关疾病中第四位，死亡率9.2％为第二位。而在我国，随着国民饮食结构的改变和生活水平的而变化，结直肠癌的发病率和死亡率逐年增加，2015新发病例37.6万，死亡病例19.1万，其中，城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。据统计，超过60～70％的结直肠癌者在疾病中晚期才被确诊，这使得患者的5年生存率仅为60％。目前对于结肠癌治疗的主要手段是通过手术治疗辅助放疗和化疗，这种方式的治疗不仅副作用较大，而且也给患者带来巨大的心理和经济上的压力。此外，尽管进行了手术及放疗和化疗，但仍然有高达30％的复发可能性。因此，我们需要更有效的治疗手段来降低结直肠癌的死亡率具有重要的意义。目前有许多中草药已经被证明有抗肿瘤活性，这为开发新的结肠癌治疗剂提供一个潜在的可能。具有抗癌活性的天然产物一般可以通过对癌细胞的毒性、或诱导癌细胞凋亡、或引起癌细胞的周期阻滞、或导致癌细胞骨架的破坏等途径抑制癌细胞的增殖。例如白花蛇舌草粗提物能够通过上调细胞周期相关基因P21和P53的表达将癌细胞阻滞在S期，抑制癌细胞的增殖；红毛五加多糖能够通过上调癌细胞中的抑癌基因Bax的表达，下调Bcl-2来诱导癌细胞凋亡。天然草药的提取物已被用作治疗各种疾病，在治疗癌症中，由于副作用小和延缓癌症发展的优点，因此它们经常与抗癌药物联合用药治疗癌症。羊踯躅RhododendronmolleG.Don又名黄杜鹃、闹羊花、八厘麻等，始载于《神农本草经》，是我国杜鹃花科羊踯躅亚属中仅有的一个原生种。它既是一种重要观赏植物，也是一种被列入《中国药典》2015版的药用植物，具有祛风除湿、散癖定痛之功效，用于治疗风湿痹痛、偏正头痛、跌打肿痛、顽癣等，民间有“跌倒地上爬，离不开八厘麻”的说法。目前关于羊踯躅的研究大多集中在植物化学、组织培养、遗传多样性以及其毒性的相关研究。很多研究表明，羊踯躅的根、花和果实含有大量的二萜、三萜、黄酮和木质素等化合物；同时也发现，羊踯躅具有广泛的药理学活性，包括止痛、抗炎、抗高血压和杀虫等。然而，目前有关羊踯躅抗癌活性及其作用机制的研究尚未见报道。发明内容本发明的目的在于提供一种羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法，并且提供一种羊踯躅提取物的应用方法。为达到以上目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：1制备出羊踯躅提取物：将新鲜采摘的羊踯躅的叶片洗涤干净，冷冻干燥后粉碎、过筛；用甲醇1:10，WV室温浸泡过夜，回流提取三次，每次1.5小时；将提取液经过滤，再用旋转蒸发仪设置温度为45～50℃，真空度为-0.08MPa将提取液浓缩成膏状，膏状物质冷冻干燥后得到的干燥粉末即为羊踯躅提取物。技术指标为浸膏得率30％以上，浸膏冷冻干燥后的干燥粉末得率达10％以上。羊踯躅提取物可以用二甲亚砜DMSO溶解，在-20℃条件下保存。当然，也可以用其他方法制备羊踯躅提取物。得到羊踯躅提取物后，可以检测羊踯躅提取物的抗癌活性；2羊踯躅提取物抑制癌细胞增殖活性的检测：将5种癌细胞A549、HT-29、A2780、SGC7901和PC3细胞分别接种于96孔板中密度为2×103～5×103个细胞孔，在37℃、5％CO2的培养箱中孵育24小时，用不同浓度的羊踯躅提取物处理，再培养48～72小时，弃上清，用PBS冲洗两次；然后将10uLMTT浓度为5mgmL和90uLDMEMDulbecco'smodifiedeaglemedium，改良的杜氏伊格尔培养基加入到每个孔中，在37℃条件下孵育4小时后，除去培养基溶液，并在每个孔中加入150uLDMSO二甲亚砜，以溶解甲瓒晶体，用酶标仪在570nm处记录每个孔的吸光度；羊踯躅提取物抑制率最高的结肠癌细胞HT-29用于后续的分析和应用；3羊踯躅提取物抑制癌细胞细胞克隆形成的检测：将对数生长的HT-29细胞接种于6孔板中700细胞孔，在37℃条件下孵育24小时；然后将培养液换成不同浓度的含不同浓度400、200、100、50、25、0μgmL羊踯躅提取物的培养基共同培养，在37℃、5％CO2的培养箱中培养13天后，吸出培养基，用PBS冲洗，用4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，统计克隆形成数并计算克隆形成率；4羊踯躅提取物诱导癌细胞凋亡引起周期阻滞的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞接种于6孔板中2×105个孔，24小时后，将培养基分别替换成含不同浓度400、200、100、50、25μgmL羊踯躅提取物的完全培养基，对照组加入等量的含DMSO0.1％的完全培养基培养24小时；将细胞制成单个细胞悬液离心收集细胞，通过流式细胞仪检测细胞的凋亡与周期；5羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞接种于6孔板中，孵育过夜；然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时，收集细胞用Trizol提取细胞总RNA；用反转录系统试剂盒PROMEGA，美国反向转录RNA1μg，运用实时荧光定量试剂盒对基因表达水平进行定量；用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2-ΔΔCT计算基因的表达水平。本发明提出了羊踯躅提取物抑制癌细胞增殖活性及相关基因表达的分析方法，实现快速准确地分析羊踯躅提取物的抗癌活性，探明抗癌活性的分子机制，进而为开发治疗癌症药物提供技术支持和科学依据，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。结果发现，羊踯躅叶片甲醇提取物有较强的抗癌活性，能够明显抑制结肠癌细胞HT-29的增殖和迁移，流式细胞分析发现羊踯躅提取物能够诱发癌细胞周期的阻滞和细胞凋亡；荧光定量分析也进一步表明羊踯躅提取物能显著的上调细胞周期相关基因P21和P53的表达，诱发癌细胞周期的阻滞，抑制癌细胞的增殖；使凋亡相关基因Bax的表达上调Bcl-2的表达下调，使BaxBcl-2的比值增大，加速结肠癌细胞HT-29的凋亡。本发明所建立提取工艺简单、高效、可靠，其抗癌的分子机制及分析方法为开发羊踯躅治疗癌症药物提供技术支持和科学依据。由此，可以得出一种羊踯躅提取物的应用方法，即所述的羊踯躅提取物用于抑制结肠癌。例如，羊踯躅提取物可以用于制备抑制结肠癌的药物。本发明的技术效果是：本发明以HT-29细胞为研究对象构建了体外抗癌活性检测体系，探究羊踯躅叶甲醇提取物对HT-29细胞凋亡和周期的影响及Bax、bcl-2、P21和P53等相关基因的表达，进而揭示了羊踯躅抑制结肠癌细胞HT-29增殖的潜在分子机制，以期明确羊踯躅对结肠癌的治疗效果及其未来的临床运用奠定理论基础。附图说明图1为本发明中羊踯躅叶片甲醇提取物用量和HT-29细胞增殖抑制率的关系折线图。图2为本发明中使用不同用量的羊踯躅叶片甲醇提取物时HT-29细胞克隆形成的培养基照片。图3为本发明中羊踯躅叶片甲醇提取物对HT-29细胞凋亡的影响的示意图。图4为本发明中羊踯躅叶片甲醇提取物对HT-29细胞周期的影响的示意图。图5为本发明中羊踯躅叶片甲醇提取物对HT-29细胞凋亡及周期调控相关基因表达的影响的示意图。具体实施方式下面将结合附图实施例详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。1羊踯躅叶片甲醇提取物的制备：实验材料羊踯躅RhododendronmolleG.Don的叶在7月采集于中国湖南省。将野外采集的新鲜的羊踯躅的叶子清洗后，置于冷冻干燥机中干燥，48小时后将叶片取出，用打粉机将叶片打成粉末并过80目筛子。将10g羊踯躅叶片粉末用甲醇1:10，WV室温浸泡过夜，然后回流提取三次，每次1.5小时。再将甲醇提取液抽滤过0.45μm滤膜，再用旋转蒸发仪控制温度在45℃、真空度在-0.08MPa将提取液浓缩成膏状。然后将浸膏放置于冷冻干燥机中干燥36小时，得到干燥的羊踯躅提取物的粉末1.09g，保存在-20℃冰箱中备用。2细胞培养：本发明选用5种癌细胞系A549、HT-29、A2780、SGC7901和PC3购于江西中医学院细胞库。癌细胞在37℃、5％CO2的培养条件下，用含有10％的胎牛血清的、青霉素100UmL、链霉素100μgmL的DMEM培养基培养。3羊踯躅提取物抑制癌细胞增殖活性的检测：选取对数生长期的不同种癌细胞分别接种于96孔板中，密度为4×103个孔，将96孔板放置在37℃、5％CO2培养箱中培养。24小时后，将培养基分别替换成含羊踯躅提取物400、200、100、50、25μgmL的完全培养基200μL,对照组加入等量的DMSO0.1％的完全培养基，每组设置3个复孔。72小时后，弃去含药培养基，用PBS冲洗后，每孔加入10μL的MTT溶液浓度为5mgmL，溶解于PBS和90μL的培养基，37℃、5％CO2培养箱中孵育。4小时后，吸出96孔板中液体，每孔加入200μL的二甲基亚砜DMSO。30分钟后用酶标仪测量570nm处的吸光值A，根据以下公式计算细胞抑制率：抑制率＝1-A加药A对照结果表明，提取物浓度为200μgmL时，对五种癌细胞A549、HT-29、A2780、SGC7901和PC3均有明显的抑制作用。计算得出的对HT-29的抑制率如图1所示，可以看出，羊踯躅叶片甲醇提取物的浓度为100μgmL时，细胞增殖抑制率达50％以上，其中对HT-29细胞抑制率最高，表明羊踯躅提取物具有显著的抗癌活性。因此后续羊踯躅抗癌的分子机制及检测方法以HT-29细胞为研究试材。4羊踯躅提取物抑制HT-29细胞克隆形成的检测：将处于对数生长期的HT-29细胞接种于6孔板，调整细胞浓度为700细胞孔，在37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。24小时后去上清，加入不同浓度的羊踯躅提取物羊踯躅提取物的浓度见表1，对照组不加，在37℃、5％CO2条件下孵育13天，培养结束后，吸去上清液，加入PBS清洗三次，然后加入4％多聚甲醛固定10分钟以上，接着吸去上清加入PBS清洗三次，再加入结晶紫染色，10分钟后用PBS清洗至培养皿呈无色。低倍镜下计数克隆数并计算克隆形成率。表1本发明中不同浓度羊踯躅叶片甲醇提取物对HT-29细胞克隆形成的影响组别浓度μgmL形成克隆数形成克隆率％对照组0282100羊踯躅甲醇提取物组15011239.72羊踯躅甲醇提取物组21003412.06羊踯躅甲醇提取物组320000结果表明与空白组相比，给予羊踯躅叶甲醇提取液的实验组的HT-29细胞克隆形成率明显下降，在50μgmL的浓度下HT-29细胞克隆形成的抑制率为60.28％，即细胞克隆形成率仅为对照组的39.72％。抑制癌细胞克隆形成的作用与羊踯躅提取物的剂量成正相关。5羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析：取长至70％～80％的HT-29细胞接种于6孔板，密度为2×105个细胞孔，37℃、5％CO2培养过夜。24小时后吸去上清液，处理组加入不同浓度50、100、200μgmL的羊踯躅提取物和培养基，空白组加入相应的DMSO和培养基，37℃、5％CO2培养24小时。培养结束后去上清，将细胞制成单个细胞悬液离心收集细胞，加入4℃预冷的70％冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。检测前去乙醇，用PBS洗三次，细胞重悬于1mL的PI50μgmL；含20μgmL的RNaseA染液中，37℃孵育30分钟后进行流式分析。图3显示了羊踯躅叶甲醇提取物对HT-29细胞凋亡的影响，图4显示了羊踯躅叶片甲醇提取物对HT-29细胞周期的影响。结果表明在给予羊踯躅叶甲醇提取物的实验组细胞晚期凋亡率显著提高且细胞周期明显阻滞在S期，在200μgmL的浓度时诱导HT-29细胞发生晚期凋亡率为26.59％，而空白对照组仅为4.77％；同时在200μgmL的浓度时有39.80％细胞周期分布在S期，而空白对照组为31.83％，HT-29细胞处于G1期的细胞减少到36.19％。表明羊踯躅叶甲醇提取物能够诱导HT-29细胞发生凋亡并且引起细胞周期阻滞于S期。羊踯躅提取物浓度为200μgmL时，细胞出现明显的细胞核的变形新月状或荧光碎片，诱导HT-29细胞发生凋亡，晚期凋亡率大于22％，凋亡率与浓度成正相关。6羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析：取长至70％-80％的HT-29细胞2×105细胞孔接种于6孔板中，37℃、5％CO2培养过夜。24小时后吸去上清液，除空白组外其余各组加入含有不同浓度提取物的培养基培养细胞。37℃和5％CO2孵育12小时后，除去上清，将六孔板至于冰盒上，用4℃预冷的PBS冲洗细胞3次，加入1mL的Trizol裂解液裂解细胞，吹打混匀并转移到无RNA酶的离心管中静置5分钟，加入300μL的氯仿，剧烈震荡15秒，静置15分钟，然后4℃、12000转离心15分钟。取上清加600μL异丙醇轻轻震荡15秒，-20℃静置30分钟，然后4℃、12000转离心10分钟。弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇洗涤，然后4℃、12000转离心5分钟。去上清，吸净残余乙醇，自然干燥，后加入RNA溶解液溶解RNA，-80℃保存，备用。用反转录系统试剂盒PROMEGA，美国根据操作步骤将RNA反转录成cDNA。运用实时荧光定量试剂盒对Bcl-2、Bax、P21和P53的mRNA的表达水平进行定量。该反应体系共20μL，10μL的PremixExTaqII、0.4μL的ROX染料、0.8μL的引物、1μL的cDNA模板和6μL的H2O进行反应，PCR循环如下：95℃1分钟，95℃15秒，60℃30秒40个周期，每组测试三次。用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2-△△CT计算基因的表达水平。结果表明，与对照组相比羊踯躅提取物对HT-29细胞Bcl-2的表达呈浓度依耐性下调，当用浓度为400μgmL羊踯躅甲醇提取物处理细胞时，Bcl-2的表达量仅为对照组的0.31倍。相反，羊踯躅提取物对HT-29细胞Bax、P21和P53基因的表达呈浓度依耐性上调对Bax、P21和P53的mRNA水平上调大于1.5倍，当用浓度为400μgmL的提取物处理细胞时，Bax、P21和P53基因的表达分别上调3.41、2.46和2.15倍。表明羊踯躅叶甲醇提取物能够诱导凋亡相关基因Bax的表达上调和Bcl-2的表达下调对Bcl-2的mRNA水平下调0.5倍，促使细胞发生凋亡；同时能够引起周期相关基因P21和P53的表达上调，促使细胞周期阻滞于S期。综上所述，羊踯躅叶片甲醇提取物有较强的抗癌活性，能够明显抑制结肠癌细胞HT-29的增殖和迁移，羊踯躅提取物能够诱发癌细胞周期的阻滞和细胞凋亡；羊踯躅提取物能显著的上调细胞周期相关基因P21和P53的表达，诱发癌细胞周期的阻滞，抑制癌细胞的增殖；使凋亡相关基因Bax的表达上调Bcl-2的表达下调，使BaxBcl-2的比值增大，加速结肠癌细胞HT-29的凋亡。羊踯躅提取物用于抑制结肠癌，抑制率达75.68％。

权利要求：1.一种羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法，包括以下步骤：1挖掘、检测羊踯躅提取物对不同癌细胞的抑制活性：将待检测的几种癌细胞接种于96孔板中，在37℃、5％CO2的培养箱中孵育24小时，用不同浓度的羊踯躅提取物分别处理每种癌细胞，继续培养48～72小时后，用四唑盐比色法MTT法检测羊踯躅提取物对不同癌细胞细胞的增殖抑制作用；2羊踯躅提取物抑制癌细胞克隆形成的检测：将对数生长的结肠癌HT-29细胞在37℃条件下继代培养24小时后，将培养液换成含不同浓度羊踯躅提取物的培养基共同培养，在37℃、5％CO2的培养箱中培养13天后，吸出培养基，用PBS冲洗，用4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，用克隆形成数和克隆形成率来评价羊踯躅提取物对HT-29细胞克隆形成的影响；3羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞继代培养24小时后，将培养基分别替换成含不同浓度羊踯躅提取物的完全培养基，对照组加入等量的含DMSO的完全培养基培养24小时；将细胞制成单个细胞悬液离心收集细胞，通过流式细胞仪检测细胞的凋亡与周期；4羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞接种于6孔板中，孵育过夜；然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时，收集细胞用Trizol提取细胞总RNA；用反转录系统试剂盒反向转录RNA，运用实时荧光定量试剂盒对Bax、Bcl-2、P21和P53等基因表达水平进行定量分析；用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2-ΔΔCT计算基因的表达水平。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、50、25μgmL；四唑盐比色法的酶标仪检测波长为570nm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤2中，含不同浓度羊踯躅提取物的培养基中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、50、25、0μgmL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤3中，含不同浓度羊踯躅提取物的完全培养基中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、50、25μgmL。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤4中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、0μgmL。6.一种羊踯躅提取物的应用，其特征在于：所述的羊踯躅提取物用于抑制结肠癌。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的羊踯躅提取物用于制备抑制结肠癌的药物。

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