申请/专利权人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

申请日：2017-08-15

公开（公告）日：2020-05-12

公开（公告）号：CN107475268B

主分类号：C12N15/55(20060101)

分类号：C12N15/55(20060101);C12N9/20(20060101);C12N15/81(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.12#授权;2018.01.09#实质审查的生效;2017.12.15#公开

摘要：本发明公开了来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用。该脂肪酶基因是编码序列为序列2的第13‑1659位的TlLipA基因或编码序列为序列2的第1‑1659位的RTlLipA基因。TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质具有脂肪酶活性，该蛋白质的脂肪酶的最适pH是9.5、最适温度是50℃，该蛋白质的脂肪酶活性可被表面活性剂TritonX100、Tween20和SDS增强；该蛋白质在pH值6‑9的条件下脂肪酶活性稳定。TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质是对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶，可应用于洗涤行业。

主权项：1.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为TlLipA基因或RTlLipA基因；所述TlLipA基因是如下T1或T2所示的DNA分子：T1编码序列为SEQIDNo.2的第13-1659位的DNA分子；T2与T1限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质的DNA分子；所述RTlLipA基因是如下R1或R2所示的DNA分子：R1编码序列为SEQIDNo.2的第1-1659位的DNA分子；R2与R1限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质的DNA分子。

全文数据：来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域中来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用。背景技术[0002]脂肪酶EC3.1.1.3被认为是最重要的商业酶之一，在快速增长的生物技术领域引起了极大的关注。脂肪酶可以在油和水的界面催化三酰基甘油水解，释放二酰基甘油酯，长链脂肪酸1〇个碳和甘油。在水解过程中，脂肪酶与底物酰基结合形成脂肪酶-酰基复合物，然后将酰基转移到水分子的羟基基团上从而实现水解。在非水溶条件下，脂肪酶可以将羧酸的酰基转移到亲核试剂。根据蛋白质结构的相似性，脂肪酶属于αβ水解酶家族，其中催化三联体通常是丝氨酸，组氨酸和天冬氨酸或谷氨酸和氧阴离子孔（即活性位点中的口袋对催化至关重要，其盖子的结构决定了底物对催化位点的可接近性和可结合性。[0003]微生物来源的脂肪酶广泛用于各领域，包括工业，食品，饲料，医疗。自20世纪60年代以来，加酶洗涤剂已被引入全球市场，能够有效去除甘油酯和脂肪酸的脂肪酶成为洗涤剂的主要添加剂之一。脂肪酶在工业和环境上的应用意义包括但不限于:脂肪酶为洗涤剂提供更强的去污力，特别是在低温和轻中度碱性洗涤环境下；具有低底物特异性的脂肪酶能够非常有效地去除顽固性污渍，例如血液或脂肪;脂肪酶不仅具有很高的生物降解能力，而且对水生生态系统无有害影响。然而，几个瓶颈限制了脂肪酶在洗涤剂中的应用，例如低底物特异性的脂肪酶很难获得，严格的洗涤条件低温和碱性条件）以及脂肪酶对洗涤剂中化学物质的敏感性等等。前期研究表明来源于细菌和酵母的部分脂肪酶具有高温活性，如来自铜绿假单胞菌嗜热芽孢杆菌和酵母Kurtzmanomycessp.的脂肪酶的最适温度为60-75°C，大大高于一般洗涤的温度（20-40°C。虽然一些细菌来源的脂肪酶具有适碱性，但是在高于PH9.0的条件下酶活很低，大大降低了在洗涤剂中应用的可能。此外，脂肪酶对表面活性剂的敏感性也大大降低了其在洗涤剂中的应用。因此，获得对表面活性剂具有强耐受性的碱性中低温脂肪酶，在洗涤行业具有重大的应用价值。发明内容[0004]本发明所要解决的技术问题是如何获得对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶。[0005]为了解决以上技术问题，本发明提供了下述DNA分子，所述DNA分子为TlLipA基因或RTlLipA基因；[0006]所述TlLipA基因是如下Tl或T2所示的DNA分子：[0007]Tl编码序列为SEQIDNo.2的第13-1659位的DNA分子；[0008]T2与Tl限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质的DNA分子；[0009]所述RTlLipA基因是如下Rl或R2所示的DNA分子：[0010]Rl编码序列为SEQIDNo.2的第1-1659位的DNA分子；[0011]R2与Rl限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质的DNA分子。[0012]上述DNA分子中，所述DNA分子可来源于TrichodermaIentiforme，如来源于TrichodermalentiformeACCC30425。[0013]上述DNA分子中，编码序列为SEQIDNo.2的第13-1659位的DNA分子来源于TrichodermalentiformeACCC30425。[00M]上述DNA分子中，编码序列为SEQIDNo.2的第1-1659位的DNA分子是重组DNA分子。[0015]上述DNA分子中，具有90%以上的同一性可为具有至少91%、92%、95%、96%、98%、99%或100%的同一性。[0016]为了解决以上技术问题，本发明提供了具有脂肪酶活性的蛋白质。[0017]本发明所提供的蛋白质，为如下Pl或P2:[0018]Pl、所述蛋白质的氨基酸序列包括SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基且具有脂肪酶活性；[0019]P2、所述蛋白质的氨基酸序列与SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基具有90%以上的同一性且具有脂肪酶活性。[0020]上述蛋白质中，所述蛋白质可来源于TrichodermaIentiforme，如来源于TrichodermalentiformeACCC30425。[0021]上述蛋白质中，所述蛋白质具体可为氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质或氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质。[0022]其中，氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质名称为TILipA，来源于TrichodermalentiformeACCC30425;氨基酸序列是SEQIDΝο·3的蛋白质名称为RTILipA，是重组的蛋白质。[0023]上述蛋白质中，具有90%以上的同一性可为具有至少91%、92%、95%、96%、98%、99%或100%的同一性。[0024]本文中，术语“同一性”指与核酸序列或氨基酸的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比%表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。[0025]与上述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。所述生物材料具体可为下述BI至B15中的任一种：[0026]BI编码所述蛋白质的核酸分子；[0027]B2含有BI所述核酸分子的表达盒；[0028]B3含有BI所述核酸分子的重组载体；[0029]B4含有B2所述表达盒的重组载体；[0030]B5含有BI所述核酸分子的重组微生物；[0031]B6含有B2所述表达盒的重组微生物；[0032]B7含有B3所述重组载体的重组微生物；[0033]B8含有Μ所述重组载体的重组微生物；[0034]Β9含有BI所述核酸分子的转基因动物细胞系；[0035]B10含有B2所述表达盒的转基因动物细胞系；[0036]BI1含有B3所述重组载体的转基因动物细胞系；[0037]B12含有M所述重组载体的转基因动物细胞系；[0038]B13含有BI所述核酸分子的转基因植物细胞系；[0039]B14含有B2所述表达盒的转基因植物细胞系；[0040]B15含有B3所述重组载体的转基因植物细胞系；[0041]B16含有Μ所述重组载体的转基因植物细胞系。[0042]上述生物材料中，BI所述核酸分子可为上述Tl或Τ2所示的DNA分子。[0043]上述生物材料中，所述重组载体可为pPIC9-RTlLipA，pPIC9-RTlLipA是用核苷酸序列是SEQIDNo.1的第4-1664位的DNA替换pPIC9的EcoRI和NotI识别位点间的片段包括Ec〇RI识别位点和N〇11识别位点在内的小片段），保持pPIC9的其它序列不变，得到的RTlLipA基因重组表达载体。[0044]上述生物材料中，所述重组微生物可为El或E2:[0045]El所述重组微生物为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为Cl-C4中的任一种：[0046]Cl真核微生物；[0047]C2酵母；[0048]C3毕赤酵母属真菌；[0049]C4巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。[0050]E2所述重组微生物为将所述pPIC9-RTlLipA导入巴斯德毕赤酵母GS115得到的分泌表达氨基酸序列是SEQIDNo.3的重组蛋白质（名称为RTlLipA的重组巴斯德毕赤酵母。[0051]上述生物材料中，B9至B16可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。[0052]所述DNA分子、所述蛋白质或所述生物材料在制备脂肪酶中的应用也属于本发明的保护范围。[0053]为了解决以上技术问题，本发明提供了制备脂肪酶的方法。[0054]本发明所提供的制备脂肪酶的方法，包括:使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到脂肪酶;所述生物为微生物、植物或非人动物。[0055]上述方法中，所述微生物可为Cl-C4中的任一种：[0056]Cl真核微生物；[0057]C2酵母；[0058]C3毕赤酵母属真菌；[0059]C4巴斯德毕赤酵母。[0060]上述方法中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。[0061]上述方法中，使所述受体微生物可为Cl-C4中的任一种：[0062]Cl真核微生物；[0063]C2酵母；[0064]C3毕赤酵母属真菌；[0065]C4巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。[0066]上述方法中，所述重组微生物可为将所述pPIC9-RTlLipA导入巴斯德毕赤酵母GS115得到的分泌表达氨基酸序列是SEQIDNo.3的重组蛋白质（名称为RTlLipA的重组巴斯德毕赤酵母。[0067]上述方法中，在表达后包括收集分泌到胞外的蛋白质（分泌表达的蛋白质），得到脂肪酶。[0068]实验证明，本发明的TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质具有脂肪酶活性，该蛋白质的脂肪酶的最适PH是9.5、最适温度是50°C，该蛋白质的脂肪酶活性可被表面活性剂TritonX100、Tween20和SDS增强；该蛋白质在pH值6-9的条件下脂肪酶活性稳定。TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质是对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶，可应用于洗涤行业。附图说明[0069]图1为SDS-PAGE电泳图谱。图中，M为蛋白质分子量标准；1为0.3mgmL纯化的脂肪酶RTlLipA酶液，2为3mgmL纯化的脂肪酶RTlLipA酶液。[0070]图2为pH对RTlLipA活性的影响㈧、温度对RTlLipA活性的影响⑶、RTlLipA的热稳定性C和RTlLipA的pH稳定性⑶。[0071]图3为金属离子和化学试剂对RTlLipA活性的影响。[0072]图4为表面活性剂对RTlLipA活性的影响。[0073]图5为RTlLipA的表面活性剂SDS稳定性。图中，20%、10%、1%和0%分别表示反应体系中SDS的浓度分别为10.ΟμίϋΜ、5.ΟμπιΜ、0.5μΜ和ΟμΜ。[0074]图6为RTlLipA的表面活性剂TritonXlOO稳定性。[0075]图7为脂肪酶RTlLipA的底物特异性。具体实施方式[0076]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0077]下述实施例中的木霉（TrichodermalentiformeACCC30425于2008年6月8日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。木霉TrichodermalentiformeACCC30425在下文简称TrichodermalentiformeACCC30425〇[0078]下述实施例中，Transl-Tl抗菌体化学细胞为TransGenBiotechCo.中国北京产品，脂肪酶表达载体PPIC9和巴斯德毕赤酵母GSl15为Invitrogen美国加州产品。[0079]实施例1、制备对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶[0080]1、制备脂肪酶[0081]将TrichodermalentiformeACCC30425在I3DB马铃薯葡萄糖肉汤）培养基上生长活化，将活化的TrichodermalentiformeACCC30425加入到含有200mL脂肪酶诱导培养基（5g葡萄糖，5gNaN03,5gK2HP〇4,0.3gMgS04.7H20,0.01gFeS04.7H20，10g橄榄油，用水定容至1升）的500mL锥形培养瓶中生长，在28°C下180rpm培养5-7天。每天检测脂肪酶活性，并在活性降低时立即用滤纸收集TrichodermalentiformeACCC30425菌丝体。TrichodermalentiformeACCC30425菌丝体在液氮中快速冷冻，用研钵和研杵粉碎用以基因组DNA的提取。将按照CTAB法提取TrichodermalentiformeACCC30425的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到核苷酸序列是SEQIDNo.1的PCR产物。SEQIDNo.1的第10-1656位核苷酸（SEQIDNo.2的第13-1659位核苷酸为TlLipA基因，编码氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基的脂肪酶TILipA。[0082]将该PCR产物和pPIC9质粒由EcoRI和NotI限制性内切核酸酶切割，将TlLipA基因连接到PPIC9载体中并转化到Transl-Tl中。重组质粒被分离并测序。将测序结果表明是用核苷酸序列是SEQIDNo.1的第4-1664位的DNA替换pPIC9的EcoRI和NotI识别位点间的片段包括EcoRI识别位点和NotI识别位点在内的小片段），保持pPIC9的其它序列不变，得到的重组表达载体命名为pPICg-RTlLipAdPICg-RTlLipA中含有核苷酸序列为SEQIDΝο·2的第1-1659位的DNA分子，该DNA分子即为RTlLipA基因。将pPIC9-RTlLipA导入巴斯德毕赤氏酵母GS115可获得氨基酸序列是SEQID如.3的脂肪酶1?111^?八。[0083]将pPIC9_RTlLipA用Bgl11线性化，利用PulserXcell电转仪Bio-RacUHercules，CA，按照Invitrogen公司的方案（2，000V，200Ω，25yF和5ms的说明，将线性化质粒电转化入巴斯德毕赤氏酵母65115感受态细胞中，得到转入?？扣9-1^11^?4的重组巴斯德毕赤氏酵母，将其命名为63115^?109-1?1'11^口4。65115^?109-1?1'11^口4在]\«培养基在32°：下培养2天。将菌落转移到BMGY培养基中，并在30°C下生长2天。通过离心8000rpmmin离心收集细胞，并将其重悬于甲醇复合培养基BMMY中，在30°C下诱导2天，每天加入甲醇至其浓度为0.5%进行诱导。4°：环境1200^离心10分钟收集上清液，并通过5-1^分子量截留的Vivaflow200膜Vivascience，Germany浓缩，得到粗酶。将粗酶加载到HiPrepTm2610脱盐柱进行脱盐，再在HiTrapQHP柱；GEHealthcare上进行阴离子交换层析纯化。该阴离子交换层析纯化所用的洗脱程序为NaCl线性梯度洗脱;NaCl线性梯度洗脱采用NaCl线性梯度洗脱液进行洗脱，NaCl线性梯度洗脱液的pH值为8.0，由溶剂和溶质组成;溶质为NaCl，溶剂为pH值为8.0的20mM的Tris-HCl缓冲液;NaCl线性梯度洗脱的时间是5min;NaCl线性梯度洗脱中NaCl的浓度在5min内由OM匀速升至1M。合并含有脂肪酶活性的同一组分，并通过超滤管（5kDa分子量截留）进一步浓缩，冻干，得到纯化的脂肪酶RTILipA。将纯化的脂肪酶RTILipA进行SDS-PAGE电泳分离，在SDS-PAGE电泳胶图中显示纯化的脂肪酶RTILipA为61kDa的单条带（图1。[0084]2、脂肪酶RTlLipA的酶学特性[0085]将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液中，得到脂肪酶RTlLipA溶液酶液），使用Bradford方法测定脂肪酶RTlLipA溶液的蛋白质浓度，用牛血清白蛋白作为标准。[0086]采用对硝基苯酚p-NP法测定步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶活性。具体方法如下：配制P-NP标准溶液p-NP的浓度为SmM，用缓冲溶液配制）；将p-NP标准溶液用缓冲溶液稀释成适当的梯度，分别测定吸光度，绘制吸光度-浓度关系曲线。取2.4mL底物溶液称取适量对硝基苯酚正辛酸酯P-NPO，溶解于缓冲液，p-NPO的浓度为0.8mM，待测温度下预热5min后加入0.ImL酶液，该待测温度下反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均勾，放置5min终止反应;用0.ImLpH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。酶活定义以及计算公式:脂肪酶酶活力单位定义为:在一定条件下，每分钟释放出1μπιοί对硝基苯酸的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。计算公式:X=cVtf式中：X为脂肪酶活力，UmL;c为对硝基苯酚浓度，μπιο1L;V反应液终体积，mL;Γ为酶液的用量，mL;t为作用时间，min。根据酶液中的蛋白质浓度，得出步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶比活力Umg。[0087]2·I、pH对RTlLipA活性的影响[0088]在37°C待测温度）下，按照上述对硝基苯酚法在以下缓冲液中测定步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶活性的最适pH值：25mM柠檬酸-Na2HPO4，pH5.0-7.0和20mMTris-HCl，pH7.0-10.0。即用该缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯P-NPO。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为:在37°C下，PH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。[0089]结果表明步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶活性在酸性条件下处于较差状态，同时从ΡΗ7开始稳定增加，直到pH达到最佳pH值为9.5图2中㈧）。[0090]2·2、温度对RTlLipA活性的影响[0091]按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和P-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯p-NPO。[0092]取2.4mL底物溶液，待测温度（分别为20、30、40、45、50和60°〇预热511^11后加入0.ImL酶液，相应待测温度下反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均勾，放置5min终止反应;用0.ImLpH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为:在50°C下，pH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。结果表明最适温度为50°C，活性在最适温度的中温区保持稳定，但由于超热失活，5rC—60°C有明显降低。步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA在50°C的脂肪酶比活力为25Umg图2中⑶）。[0093]2.3、RTlLipA的热稳定性[0094]按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和P-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯p-NPO。将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液中，得到酶液，将该酶液分别在40°C和50°C温育一定时间（0分钟，2分钟，5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，30分钟，60分钟和120分钟），得到待测酶液，在最适反应条件pH9.5，50°C，15分钟）下测定残留脂肪酶活性，测定热稳定性。将在40°C温育0分钟的待测酶液的脂肪酶活力定义为100%。[0095]具体方法如下：取2.4mL底物溶液，50°C预热5min后加入0.ImL酶液，50°C反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.ImL缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50°C下，pH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。[0096]结果表明随着温育时间的增加，两者的相对活性数呈下降趋势，温育开始时确实没有显着差异，但在40°C时，活性在80分钟内从80%缓慢下降到50%。相反，50°C线从2min开始，在IOmin内逐渐从80%降至25%，持续降低至120min图2中（C。[0097]2.4、RTlLipA的pH稳定性[0098]按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和P-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯（p-NPO。分别用2.1的缓冲液pH5.0-10.0作为溶剂稀释100倍步骤1中纯化的脂肪酶RTILipA，得到酶液，将该酶液在37°C保温1小时后，得到待测酶液。将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液中，得到的脂肪酶RTlLipA溶液（酶液）直接作为测酶液，测得的酶活力定义为100%〇[0099]将待测酶液在最适反应条件pH9.5,50°C，15分钟下测定残留脂肪酶活性，测定pH稳定性。具体方法如下：取2.4mL底物溶液，50°C预热5min后加入0.ImL酶液，50°C反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.ImL缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50°C下，PH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。相对酶活在最佳条件下以酶的最大活性的百分比表示，没有任何预温浴。[0100]结果表明从ΡΗ5到ρΗ6,中性或微碱性溶液ΡΗ6-9的活性从22%逐渐上升到70%，百分比稳定在70%到80%之间。而碱性缓冲液中活性急剧下降（图2中⑶）。[0101]2.5金属离子和化学试剂对RTlLipA活性的影响[0102]为了找出添加剂对RTlLipA的影响，将添加剂Mg2+，K+，Na+，Ca2+，Ag+，Mn2+，Zn2+，Ni2+、EDTA或β-巯基乙醇加入到反应体系，它们在反应体系中的浓度均为5mM。没有任何添加剂的体系用作CKcontrol，将CK的脂肪酶酶活定义为100%。按照上述对硝基苯酸法，测定残留活性。[0103]按照上述对硝基苯酚法，用PH9.5的20mMTriS-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和P-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯p-NPO。具体方法如下：取2.4mL底物溶液，50°C预热5min后加入O.lmL酶液（将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液中，得到酶液），加入金属离子盐至金属离子的浓度为5mM，或加入EDTA至其浓度为5mM，或加入β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol至其浓度为5mM，50°C反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.ImL缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；将没有上述添加剂的体系作为control;于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。月旨肪酶酶活力单位定义为:在50°C下，pH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。其中，金属离子盐分别为MgCl2，KC1，NaCl，CaCl2,AgNO3，MnCl2，ZnS〇4，ZnCl2，NiS〇4。将control的脂肪酶酶活定义为100%。[0104]结果表明离子添加没有导致脂肪酶活性的促进。相比之下，除了Ag+之外，重金属Mn2+，Zn2+和Ni2+显著限制了活性，与对照相比，脂肪酶活性降低了约10倍。对于轻金属，它们对活性的影响不大。还检测了两种常见的化学试剂ΗΤΑ和β-巯基乙醇，其对RTlLipA具有明确的影响约50%限制）（图3。[0105]2.6表面活性剂对RTlLipA活性的影响[0106]表面活性剂是洗涤剂中的常见成分，本实验选择了吐温20TWeen20，吐温80Tween80，SDS和TritonXlOO作为添加剂加入到反应体系中形成四种浓度梯度为0.50%，0.20%，0.10%和0.05%，研究表面活性剂对脂肪酶的影响。将没有任何添加剂的反应体系设定为对照，将对照的脂肪酶酶活定义为100%。按照上述对硝基苯酚法，测定残留活性。具体方法如下：取2.4mL底物溶液（用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制0.8mM的对硝基苯酚正辛酸酯P-NPO溶液作为底物溶液），在50°C预热5min后加入0.ImL酶液（用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤1中纯化的脂肪酶RTILipA，得到酶液），加入Tween20至其在反应体系中的体积浓度分别为0.50%，0.20%，0.10%和0.05%，或加入Tween80至其在反应体系中的体积浓度分别为0.50%，0.20%，0.10%和0.05%，或加入SDS至其在反应体系中的质量百分浓度分别为0.50%，0.20%，0.10%和0.05%，或加入TritonXlOO至其在反应体系中的体积浓度分别为0.50%，0.20%，0.10%和0.05%，50°C下反应15min或60min后立即加入无水乙醇混合均勾，放置5min终止反应;将0.ImLpH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；将没有上述添加剂的体系作为对照，在50°C下反应15min的脂肪酶酶活作为100%;于41Onm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出脂肪酶的酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为:在50°C下，pH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。[0107]结果如图4所示，表明向反应体系中加入SDS0.1%，0.2%和0.5%，RTlLipA的脂肪酶活性显着增加，此外，SDS组的活性随着反应时间的增加逐渐升高。其次是TritonXlOO和Tween20和SDS，它们刺激了活性，添加的越多，它们显示的活性就越高。对于吐温80组，无论加入多少，反应时间长短，与对照相比，活性均有稳定抑制。[0108]2·7、RTlLipA的表面活性剂SDS稳定性[0109]按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA，得到酶液，向该酶液中分别加入SDS，分别得到含有10.ΟμπιΜ、5.0μmM、0.5μΜ和ΟμΜ的SDS的体系，在37°C温育不同时长Oh，Ih，3h，6h，得到待测酶液，在最适条件pH9.5,50°C，15分钟）下测定残留脂肪酶活性，测定RTlLipA的表面活性剂SDS稳定性。将酶液在〇μΜ的SDS37°C温育0分钟的待测酶液的脂肪酶活力定义为100%。[0110]具体方法如下：取2.4mL底物溶液用pH9.5的20mMTriS-HCl缓冲溶液作为溶剂配制0.8mM的对硝基苯酚正辛酸酯p-NPO溶液作为底物溶液），在50°C预热5min后加入0.ImL待测酶液，50°C下反应15min后立即加入无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应;将0.ImLpH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出脂肪酶的酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为:在50°C下，pH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。[0111]结果如图5所示，表明在相同的温育时间，添加的SDS越多，获得的脂肪酶活性越大最多为400%，但随着温育时间的延长，RTlLipA开始在1小时内逐渐失去活性。[0112]2.8、RTlLipA的表面活性剂TritonX100稳定性[0113]按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤I中纯化的脂肪酶RTlLipA，得到酶液，向该酶液中分别加入TritonXlOO，分别得到含有体积百分比浓度分别为30%，10%、1%和0%的TritonX100的体系，在37°C温育不同时长Oh，lh，3h，6h，得到待测酶液，在最适条件pH9.5,50°：，15分钟）下测定残留脂肪酶活性，测定RTlLipA的表面活性剂TritonXlOO稳定性。将酶液在0%的TritonXlOO37°C温育0分钟的待测酶液的脂肪酶活力定义为100%。[0114]具体方法如下：取2.4mL底物溶液用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制0.8mM的对硝基苯酚正辛酸酯p-NPO溶液作为底物溶液），在50°C预热5min后加入0.ImL待测酶液，50°C下反应15min后立即加入无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应;将0.ImLpH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出脂肪酶的酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为:在50°C下，pH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。[0115]结果如图6所示，表明在添加了TritonXlOO的这些实验组中，10%的添加浓度在任何时间都显示比任何其他浓度高的活性，随后是1%。此外，增加浓度的30%不能提供比对照更高的活性，尽管它增加了RTlLipA的稳定性。[0116]2.7、底物特异性和动力学参数[0117]为了确定底物特异性，通过用六种底物，S卩p-NPB对硝基苯酚正丁酸酯，C4，p-NPO对硝基苯酚正辛酸酯，C8，p-NPD对硝基苯酚正癸酸酯，C10，对p-NPDD对硝基苯酚月桂酸酯，C12，p-NPM对硝基苯酚豆蔻酸酯，C14和p-NPP对硝基苯酚棕榈酸酯，C16。在这种情况下，它们都是具有各种长度的酰基链C4-C16的对硝基苯基酯。用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液。[0118]具体方法如下：取2.4mL底物溶液，在50°C预热5min后加入0.ImL酶液（用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤1中纯化的脂肪酶RTILipA，得到酶液），50°C下反应5min后立即加入无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应;将O.lmLpH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液替换0.ImL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出脂肪酶的酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为:在50°C下，pH9.5的条件下每分钟释放出Ιμπιοί对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位U。[0119]结果确定Michaelis-Menten动力学参数KjPVmax值分别为上述各种底物浓度为0.2-1.6mM时的动力学性质。通过GraphPadPrism5GraphPadSoftware，USA计算Km和Vmax。实验组各三次重复。kcat是每秒催化底物的数量。1是反应速度最大的底物浓度。kcatKm是衡量酶在亚饱和底物浓度下将底物转化为产物的有效性的量度，即催化效率。[0120]结果表明脂肪酶RTlLipA活性和亲和力随着碳链长度（从C8到C16逐渐降低，P-NPBC4和p-NPDClO之间没有很大的差异（图7。总体而言，p-NPOC8是最佳底物kcatKm，41.0s—VM—丄）。

权利要求：1.DNA分子，其特征在于:所述DNA分子为TlLipA基因或RTlLipA基因；所述TlLipA基因是如下Tl或T2所示的DNA分子：Tl编码序列为SEQIDNo.2的第13-1659位的DNA分子；T2与Tl限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质的DNA分子；所述RTlLipA基因是如下Rl或R2所示的DNA分子：Rl编码序列为SEQIDNo.2的第1-1659位的DNA分子；R2与Rl限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质的DNA分子。2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述TlLipA基因来源于TrichodermaIentiforme，或所述TlLipA基因来源于TrichodermalentiformeACCC30425。3.蛋白质，其特征在于:所述蛋白质为如下Pl或P2:Pl、所述蛋白质的氨基酸序列包括SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基且具有脂肪酶活性；P2、所述蛋白质的氨基酸序列与SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基具有90%以上的同一性且具有脂肪酶活性。4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质来源于Trichodermalentiforme，或，所述蛋白质来源于TrichodermalentiformeACCC30425,和或，所述蛋白质的氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-552位氨基酸残基或SEQIDNo.3。5.根据权利要求3或4所述的蛋白质，其特征在于:所述蛋白质具有下述1-4中的至少一种特性：1所述蛋白质的脂肪酶活性被TritonΠ00增强；2所述蛋白质的脂肪酶活性被Tween20增强；3所述蛋白质的脂肪酶活性被SDS增强；4所述蛋白质在pH值6-9的条件下脂肪酶活性稳定。6.与权利要求1或2所述的DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述BI至B15中的任一种：BI编码权利要求3-5中任一所述蛋白质的核酸分子；B2含有BI所述核酸分子的表达盒；B3含有BI所述核酸分子的重组载体；B4含有B2所述表达盒的重组载体；B5含有BI所述核酸分子的重组微生物；B6含有B2所述表达盒的重组微生物；B7含有B3所述重组载体的重组微生物；B8含有Μ所述重组载体的重组微生物；Β9含有BI所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10含有B2所述表达盒的转基因动物细胞系；BI1含有B3所述重组载体的转基因动物细胞系；B12含有M所述重组载体的转基因动物细胞系；B13含有BI所述核酸分子的转基因植物细胞系；B14含有B2所述表达盒的转基因植物细胞系；B15含有B3所述重组载体的转基因植物细胞系；B16含有M所述重组载体的转基因植物细胞系。7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于:BI所述核酸分子为权利要求1或2所述的DNA分子。8.权利要求1或2所述的DNA分子、权利要求3-5中任一所述的蛋白质或权利要求6或7所述的生物材料在制备脂肪酶中的应用。9.一种制备脂肪酶的方法，包括:使权利要求3-5中任一所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到脂肪酶;所述生物为微生物、植物或非人动物。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述微生物为Cl-C4中的任一种：Cl真核微生物；C2酵母；C3毕赤酵母属真菌；C4巴斯德毕赤酵母。

百度查询： 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD