申请/专利权人：潍坊医学院

申请日：2016-06-29

公开（公告）日：2020-07-03

公开（公告）号：CN105950605B

主分类号：C12N11/14(20060101)

分类号：C12N11/14(20060101);C12N11/10(20060101);C12N11/082(20200101);C07K1/13(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.03#授权;2016.10.19#实质审查的生效;2016.09.21#公开

摘要：本发明公开了一种生物素连接酶在磁性微球表面的定向共价固定方法，该方法包括：首先，利用基因工程技术表达出N端带MLAQGS序列及多聚组氨酸序列的生物素连接酶重组蛋白；然后，利用谷氨酰胺转胺酶的催化作用，将所述生物素连接酶重组蛋白中的谷氨酰胺的‑NH2与氨基化修饰磁性微球表面的‑NH2形成共价连接，从而实现将生物素连接酶以共价结合方式定向固定在磁性微球载体表面。本发明建立的一种BirA酶的固定化新方法，可以充分保持其酶学催化活性，并重复使用，提高酶的使用效率及降低使用成本。

主权项：1.一种生物素连接酶的位点特异性的共价定向固定方法，其特征是，包括以下步骤：首先，利用基因工程技术表达出N端带甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸序列及多聚组氨酸序列的生物素连接酶重组蛋白；然后，利用谷氨酰胺转胺酶的催化作用，将所述生物素连接酶重组蛋白中的谷氨酰胺的-NH2与氨基化修饰磁性微球表面的-NH2形成共价连接，从而实现将生物素连接酶以共价结合方式定向固定在磁性微球载体表面；其中，所述多聚组氨酸序列为6聚组氨酸序列；所述利用基因工程技术表达出N端带至少含有谷氨酰胺序列的生物素连接酶重组蛋白的步骤如下：首先利用基因工程技术构建N端带甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸序列及6×His序列的生物素连接酶重组蛋白的原核表达载体，然后采用大肠杆菌表达所述生物素连接酶重组蛋白；将大肠杆菌表达所述生物素连接酶重组蛋白后，再采用固定化金属螯合亲和层析法Ni亲和层析纯化，得到纯化后的Gln-BirA重组蛋白；生物素连接酶共价、定向连接固定在磁性微球表面的具体方法为：利用微生物谷氨酰胺转氨酶的催化作用，在生物素连接酶重组蛋白N端甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸序列的谷氨酰胺的γ-羧酰胺基与氨基化修饰磁性微球表面的-NH2形成共价键，从而将BirA酶共价、定向连接固定在磁性微球表面；所述利用基因工程技术表达出N端带至少含有谷氨酰胺序列的生物素连接酶重组蛋白的具体步骤如下：首先利用基因工程技术构建表达质粒载体pMLAQGS-His-BirA，然后采用E.coliBL21DE3表达所述生物素连接酶重组蛋白；所述生物素连接酶共价、定向连接固定在磁性微球表面的具体操作步骤为：将氨基化的磁性微球、生物素连接酶重组蛋白和谷氨酰胺转胺酶混合反应，反应之后经磁分离收集反应后的微球，即得到共价连接生物素连接酶的磁性微球；所述反应温度为20～30℃，反应时间为5～7h；所述混合反应体系为：1mL反应体系中，含1mg氨基化磁性微球，0.5mg重组BirA酶，10UMTG，反应缓冲体系为20mM的PBS，24℃震荡反应6h，经磁分离收集反应后的微球，用含质量分数为0.01％Tween-20的PBS溶液洗涤数次；即得到共价连接生物素连接酶的磁性微球。

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