申请/专利权人：广东省生物资源应用研究所

申请日：2020-04-21

公开（公告）日：2020-07-31

公开（公告）号：CN111206015B

主分类号：C12N5/076(20100101)

分类号：C12N5/076(20100101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.31#授权;2020.06.23#实质审查的生效;2020.05.29#公开

摘要：本发明提供了一种利用FACTⅢ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。该方法利用转壁氏生物反应器（RCCS）构建三维动态培养环境，选择FACTⅢ微载体为支架材料，建立了能支持小鼠睾丸SSCs体外快速增殖和维持其未分化特性的三维动态培养体系。该三维动态培养体系下，SSCs在RCCS中培养一周后，表现出极优的增殖效果，尤其在体外培养17‑22d获得SSCs得到快速增殖，增殖的SSCs细胞仍保留着其未分化状态的生物学特性和功能。本发明方法具有操作简单，培养成本低，重复性好，培养成功率高，无需传代，可避免饲养层细胞污染等明显优势，提供了一种可靠的SSC体外培养技术方案。

主权项：1.一种利用FACTⅢ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将DMEM完全培养基加至经灭菌的转壁氏细胞培养系统的高纵横比型容器中，按接种密度为10～20μgmL加入经预处理的FACTⅢ微载体；将采用反复差速贴壁法纯化后的原代精原干细胞以2～7.5×105个mL密度接种至FACTⅢ微载体上，在37℃下、5％CO2的培养箱中静态培养30～60min，然后调整转壁氏细胞培养系统的转速至10～12rpmmin，在10～12rpmmin转速下培养7天后，逐渐增加转速，以30rpmmin为调整上限，使生成的细胞聚集体处于相对静止状态，防止自由落体运动对细胞造成损伤，继续培养，获得精原干细胞；所述的FACTⅢ微载体预处理的具体步骤为：将FACTⅢ微载体用无菌PBS溶液进行洗涤，并浸泡过夜，于120℃高压灭菌30min；将灭菌后的FACTⅢ微载体转移至15mL无菌离心管中先后用其5倍体积的10-20ngmL多聚赖氨酸溶液和5-20μgmL层黏蛋白溶液进行包被处理，将包被处理后的FACTⅢ微载体在DMEM完全培养基中浸泡过夜，即得；所述的原代精原干细胞是通过以下方法获得：取出生后5～7天的雄性昆明小鼠睾丸，去掉睾丸白膜，先以1mgmLⅣ型胶原酶和20μgmL的DNAseⅠ联合消化，然后以0.25％胰酶-0.01％EDTA和20μgmL的DNAaseⅠ联合消化，用含10wt％FBS的DMEM不完全培养基终止消化，用60μm细胞筛过滤，于低温离心机1000rpm离心6min，重悬细胞，获得含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液；所述的DMEM完全培养基组成为：DMEM不完全培养基中添加1％vv的必需氨基酸溶液、1％vv的非必需氨基酸溶液、1％vv维生素溶液、55μMβ-巯基乙醇溶液、2mML-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、5wt％FCS、1％vv的双抗溶液、20ngmLrmbFGF因子、20ngmLrrGDNF因子和103UmLmLIF因子；所述的采用反复差速贴壁法纯化方法的具体步骤为：将含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液接种至0.1wt％明胶包被的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养8～10h，因体细胞贴壁速度快且牢固而将未贴壁的悬浮细胞接种至新的明胶包被培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养8～10h，如此共重复3次，收集未贴壁的细胞及悬液，1000rpmmin，离心5min，获得纯化的原代精原干细胞；所述的精原干细胞培养过程中需更换培养液，具体是培养的第3d全量换液，以后每3d半量换液。

全文数据：

权利要求：

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