申请/专利权人：复旦大学附属中山医院

申请日：2017-08-24

公开（公告）日：2020-08-11

公开（公告）号：CN107475259B

主分类号：C12N15/12(20060101)

分类号：C12N15/12(20060101);C07K14/47(20060101);C12Q1/6883(20180101);A61K48/00(20060101);A61K38/17(20060101);A61P9/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.08.11#授权;2018.01.09#实质审查的生效;2017.12.15#公开

摘要：本发明涉及汉族人群家族性扩张型心肌病的筛查试剂盒。本发明运用二代测序技术，通过外显子捕获富集全基因组DNA编码序列，发现了扩张型心肌病相关的致病基因及致病突变，包括：Chmp4c基因c.488AG突变、LMNA基因c.961CT突变和MYH7基因c.2458GC突变，基于此提供了检测以上突变的扩张型心肌病筛查试剂盒。应用本发明的试剂盒能够提高扩张型心肌病患者早期检出率，有利于早期预防和治疗，提高患者生存率。

主权项：1.一种分离的编码突变体的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子与SEQIDNO:1相比，具有c.488AG突变。

全文数据：汉族人群家族性扩张型心肌病的筛查试剂盒技术领域[0001]本发明涉及生物医学的疾病诊断技术领域，具体地说，涉及汉族人群家族性扩张型心肌病致病基因及突变位点的发现，和基于该致病基因及突变位点的扩张型心肌病筛查试剂盒。背景技术[0002]随着二代测序技术Next-GenerationSequencing，NGS的出现，特别是与外显子组捕获技术相结合的NGS能快速准确的了解基因序列信息，极大地帮助我们了解遗传性疾病，通过对家族相关基因的比对分析，能够较准确地发现致病基因及突变。[0003]扩张型心肌病DilatedCardiomyopathy，DCM是以左心室或双心室扩大，心室收缩功能障碍、心室壁变薄为主要特点的一种原发性心肌病，是导致心源性猝死和心力衰竭的主要原因。通过在患者家族中进行相关致病基因的研宄发现，家族遗传所占的比例较高。家族性DCM的临床表型存在异质性，携带同一致病基因的家系不同成员之间的临床表现不尽相同，这可能与年龄，性别，基因突变的部位、类型等因素有关。根据以往研宄报道统计，由于受限于检测技术以及对DCM整体认识水平，家族性DCM相关致病基因及突变检出率不到30%。经典的Sanger测序法准确性高，但检测序列的长度有限，效率较低，仅适用于筛选已知致病基因突变位点，很大程度上阻碍了DCM的致病基因检测。由于不同人种的遗传信息可能有差异，目前遗传分析中使用的数据欧美人群占很大的比例，汉族人群的数据较少，因此需要在汉族人群中近一步筛查研究。[0004]专利文献CN1824776A，公开日2006•08.30，公开了目前已经有8个染色体定位与扩张型心肌病有关，并已确定了7个主要致病基因，包括:肌动蛋白（Actin、肌营养不良蛋白Dystrophy、tafazzin、桥粒蛋白（Desmin、5-Sarcoglycan、SCN5A和LaminAC，该发明还发现LMNA基因中G244A突变或者laminA蛋白质中E82K突变会导致患者疾病如心脏疾病特别是扩张型心肌病的发生，基于此，提供了诊断患者疾病（如心脏疾病特别是扩张型心肌病或者确定患者对疾病（如心脏疾病特别是扩张型心肌病）的遗传易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者laminA蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在。专利文献CN103509867A，公开日2014.01.15，筛选出中国汉族人群最易感的4个散发性扩张型心肌病致病基因：MYBPC3、SCN5A、MYH7和MYPN，基于此开发出对中国汉族人群散发性扩张型心肌病有效的早期诊断方法和诊断试剂盒，有效提高扩张型心肌病患者早期检出率，从而做到早期治疗，提高患者生存率。[0005]然而，发现新的致病基因及突变位点对于提高扩张型心肌病的筛查准确率来说仍然是十分必要的。发明内容[0006]本申请发明人运用二代测序技术发现了汉族人群家族性扩张型心肌病新的致病基因及突变位点，基于此完成了本发明。[0007]第一方面，本发明提供一种分离的编码突变体的核酸分子或其片段，所述的核酸分子或其片段选自下列中的任一种：[0008]d与SEQIDN0:1相比，具有c.488AG突变；[0009]6与5£〇0购:7相比，具有3.96101'突变；[0010]f与SEQIDN0:13相比，具有c.2458GC突变。[0011]第二方面，本发明提供了一种分离的多肽或其片段，所述的多肽或其片段选自下列中的任一种：[0012]d与SEQIDN0:2相比，具有p.Glu163Gly突变；[0013]e与SEQIDNO:8相比，具有p.Arg321Ter突变；[0014]f与SEQIDNO:14相比，具有p.Ala820Pro突变。[0015]第三方面，本发明提供了一种用于筛查扩张型心肌病或筛选易患扩张型心肌病生物样品的试剂盒，含有:适于检测Chmp4c基因突变体、LMNA基因突变体或MYH7基因突变体的试剂，其中与SEQIDN0:1相比，所述的Chmp4c基因突变体具有C.488AG突变，与SEQIDN0:7相比，所述的LMNA基因突变体具有c.96lCT突变，与SEQIDN0:13相比，所述的MYH7基因突变体具有c.2458GC突变。[0016]所述的扩张型心肌病为家族性扩张型心肌病。[0017]所述的扩张型心肌病其患病个体属于汉族人群。[0018]第四方面，本发明提供了一种筛查扩张型心肌病或筛选易患扩张型心肌病生物样品的系统，包括：[0019]核酸提取装置，所述的核酸提取装置用于从所述的生物样品提取核酸样本；[0020]核酸序列确定装置，所述的核酸序列确定装置与所述的核酸提取装置相连，用于对所述的核酸样本进行分析，以便确定所述的核酸样本的核酸序列；[0021]判断装置，所述的判断装置与所述的核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQIDN0:1相比，是否具有c.488AG突变，或与SEQIDN0:7相比，是否具有c.961CT突变，或与SEQID勵:13相比，是否具有〇.24580：突变，判断所述的生物样品是否属于或易患扩张型心肌病。[0022]作为一个具体例，所述的核酸提取装置进一步包括:RNA提取单元，所述的RNA提取单元用于从所述的生物样品提取RNA样本；以及反转录单元，所述的反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述的RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述的cDNA样本构成所述的核酸样本。[0023]作为一个具体例，所述的核酸序列确定装置进一步包括:文库构建单元，所述的文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及测序单元，所述的测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。[0024]第五方面，本发明提供了正常的Chmp4c基因或者正常的Chmp4c蛋白质在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗或者预防扩张型心肌病，所述的患者具有Chmp4c基因c.488AG突变或Chmp4c蛋白p.Glu163Gly突变。[0025]第六方面，本发明提供了正常的LMNA基因或者正常的LMNA蛋白质在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗或者预防扩张型心肌病，所述的患者具有LMNA基因c.961CT突变或LMNA蛋白p.Arg321Ter突变。[0026]第七方面，本发明提供了正常的MYH7基因或者正常的MYH7蛋白质在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗或者预防扩张型心肌病，所述的患者具有MYH7基因c.2458GC突变或MYH7蛋白p.Ala820Pro突变。[0027]本文中，所述的“核酸分子”的类型不受特别限制，可以是任何包含与突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。所述核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQIDN0:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。[0028]所述的“生物样品”的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患DCM的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含致病基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。[0029]所述的“适于检测基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测病基因编码基因的试剂，也可以是检测突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。[0030]本发明优点在于：[0031]本发明运用二代测序技术，通过外显子捕获富集全基因组DNA编码序列，发现了扩张型心肌病相关的致病基因及致病突变，包括:Chmp4c基因c.488AG突变、LMNA基因c.961CT突变和MYH7基因c.2458GC突变，能够提高扩张型心肌病患者早期检出率，有利于早期预防和治疗，提尚患者生存率。附图说明[0032]附图1是家系1的研宄资料。[0033]附图2是家系2的研宄资料。[0034]附图3是家系3的研究资料。具体实施方式[0035]下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第3版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。[0036]实施例1Chmp4cc.488AG，p.Glu163Gly[0037]收集在我院就诊的DCM患者及其家系成员（家系丨，图D的临床资料，采集相关家系成员外周血并抽提DNA，对该家系成员行全基因组外显子测序，寻找致病基因，用Sanger测序对家系其他成员等进行验证。[0038]1.一般临床资料收集:收集该家系所有成员详细的临床资料，包括体格检查，发病年龄，初发症状，血清肌酸激酶，纽约心功能分级，常规心电图，超声心动图，根据需要行动态心电图检查。所有研究对象签署知情同意书后，采集其外周血标本，按照试剂盒说明书步骤提取基因组DNA。本研究得到复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准2016-1册），所有研究对象都知情同意并签署知情同意书。[0039]2.全外显子组测序:对家系成员的外周血DNA进行全外显子测序实验:样品核酸提取，超声打断，TruSeqDNASamplePreparation试剂盒处理两端连接测序接头构建成文库，使用RocheNimblegenSeqCapEZv5.1试剂盒捕获全外显子区域，采用illuminaXTEN平台进行高通量测序，数据质量Q30比例大于90%，外显子目标区域测序深度中位值50X，95%目标区域测序深度30X，外显子丢失率G，p.Glu163Gly的突变，成员（IV3，V3为突变携带者，可能由于年龄原因暂时未表现出明显的扩张型心肌病临床症状，其他所有家系成员均不存在该突变。[0044]野生型Chmp4c基因的⑶S序列如SEQIDN0:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。Chmp4c基因突变体的CDS序列如SEQIDN0:3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:4所示。[0045]4_Sanger法测序验证：对该家系中患者及正常人，以及200名家系外正常人的Chmp4c基因进行检测:针对Chmp4c基因的c.488AG突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得Chmp4c基因序列，确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证Chmp4c基因的c•488AG突变与DCM之间的相关性。[0046]突变引物序列为：[0047]F：cgcccaagaaatctcagaagSEQIDNO:5；[0048]R:ctgtgctgggagagaagaggSEQIDN0:6。[0049]结果表明，该家系中患者均携带Chmp4c基因的c.488AG突变，而家系中正常人和200名家系外正常人均不携带该突变。[0050]综上所述，证明Chmp4c基因的c.488AG突变为DCM的致病突变。[0051]实施例2LMNAc.961CT，p.Arg321Ter[0052]收集在我院就诊的DCM患者及其家系成员（家系2，图2的临床资料，采集相关家系成员外周血并抽提DNA，对该家系成员行全基因组外显子测序，寻找致病基因，用Sanger测序对家系其他成员等进行验证。[0053]1.一般临床资料收集:收集该家系所有成员详细的临床资料，包括体格检查，发病年龄，初发症状，血清肌酸激酶，纽约心功能分级，常规心电图，超声心动图，根据需要行动态心电图检查。所有研宄对象签署知情同意书后，采集其外周血标本，按照试剂盒说明书步骤提取基因组DNA。本研究得到复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准2016-16B，所有研宄对象都知情同意并签署知情同意书。[0054]2.全外显子组测序:对家系成员的外周血DNA进行全外显子测序实验:样品核酸提取，超声打断，TruSeqDNASamplePreparation试剂盒处理两端连接测序接头构建成文库，使用RocheNimblegenSeqCapEZv5.1试剂盒捕获全外显子区域，米用illuminaXTEN平台进行高通量测序，数据质量Q30比例大于90%，外显子目标区域测序深度中位值50X，95%目标区域测序深度30X，外显子丢失率T，р.Arg321Ter的突变，成员（IV6，IV10为突变携带者，可能由于年龄原因暂时未表现出明显的扩张型心肌病临床症状，其他所有家系成员均不存在该突变。[0059]野生型LMNA基因的CDS序列如SEQIDN0:7所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:8所示。LMNA基因突变体的CDS序列如SEQIDN0:9所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:10所示。[0060]4•Sanger法测序验证:对该家系中患者及正常人，以及200名家系外正常人的LMNA基因进行检测:针对LMNA基因的c•961CT突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得LMNA基因序列，确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证LMNA基因的с.961CT突变与DCM之间的相关性。[0061]突变引物序列为：[0062]F：cctctctgcccagctcagSEQIDNO:11；[0063]R:gccagcttgatgtccagaagSEQIDNO:12。[0064]结果表明，该家系中患者均携带LMNA基因的c.961CT突变，而家系中正常人和200名家系外正常人均不携带该突变。[0065]综上所述，证明LMNA基因的c.961CT突变为DCM的致病突变。[0066]实施例3MYH7c.2458GC，p.Ala820Pro[0067]收集在我院就诊的DCM患者及其家系成员家系3,图3的临床资料，采集相关家系成员外周血并抽提DNA，对该家系成员行全基因组外显子测序，寻找致病基因，用Sanger测序对家系其他成员等进行验证。[0068]1•一般临床资料收集:收集该家系所有成员详细的临床资料，包括体格检查，发病年龄，初发症状，血清肌酸激酶，纽约心功能分级，常规心电图，超声心动图，根据需要行动态心电图检查。所有研究对象签署知情同意书后，采集其外周血标本，按照试剂盒说明书步骤提取基因组DNA。本研究得到复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准2016-16B，所有研究对象都知情同意并签署知情同意书。[0069]2.全外显子组测序:对家系成员的外周血DNA进行全外显子测序实验:样品核酸提取，超声打断，TruSeqDNASamplePreparation试剂盒处理两端连接测序接头构建成文库，使用RocheNimblegenSeqCapEZv5.1试剂盒捕获全外显子区域，米用illuminaXTEN平台进行高通量测序，数据质量Q30比例大于90%，外显子目标区域测序深度中位值50X，95%目标区域测序深度30X，外显子丢失率〈0.2%。[0070]3•测序数据分析:基因组测序原始数据经比对分析bwamemdiscovardenovofreebayes取SNV及SV数据；CNV数据使用EulerCNV及CNVnator综合判断；SNV数据经in11〇11863〇11〇1'1:、此3即138及10006_01^12.5注释携带率，使用3即£{『及;1_1111〇1186深度神经网络分析流程注释功能;剪切位点预测使用inhouseC++R深度神经网络模型;CNVSV数据经inhousecohort、1000G及公开CNV数据库数据过滤携带率，使用Langya注释;信号转导通路分析使用inhouseRPythonPerlpackage;OMIMMonarchExAC数据库分析使用inhousePerlRAPI;表型基因型相关神经网络分析使用LangyaMarshes。数据解读参考美国医学遗传学和基因组学学院AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics,ACMG相关指南;变异命名参照HGVS建议的规则给出（http:www.hgvs.orgmutnomen〇[0071]结果：[0072]由图1可知，该家系目前共有8个成员，DCM患者3名。其中，本家系先证者为一42岁男性患者113，反复胸闷、胸痛来我院就诊。入院检查心电图提示房室传导阻滞;超声心动图提示左心增大伴左心室收缩功能减弱，左心室射血分数LVEF=41%，诊断为扩张型心肌病，接受了相关药物治疗并植入了起搏器。先证者的哥哥（112也为扩张型心肌病，接受相关药物治疗。先证者的父亲12因心肌病去世。[0073]收集上述DCM患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本，经全外显子组测序和数据分析发现，先证者（113和先证者哥哥（113的MYH7基因均存在c.2458GC，р.Ala820Pro的突变，其他所有家系成员均不存在该突变。[0074]野生型MYH7基因的CDS序列如SEQIDN0:13所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:14所示。MYH7基因突变体的⑶S序列如SEQIDN0:15所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:16所示。[0075]4.Sanger法测序验证:对该家系中患者及正常人，以及200名家系外正常人的MYH7基因进行检测:针对MYH7基因的c.2458GC突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得MYH7基因序列，确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证MYH7基因的с.2458GC突变与DCM之间的相关性。[0076]突变引物序列为：[0077]F：gactccctgctggtaatccaSEQIDNO:17；[0078]R:cctctttgaggcgtgtgaacSEQIDNO:18〇[0079]结果表明，该家系中患者均携带MYH7基因的c•2458GC突变，而家系中正常人和200名家系外正常人均不携带该突变。[0080]综上所述，证明MYH7基因的c.2458GC突变为DCM的致病突变。[0081]实施例4筛查扩张型心肌病易患扩张型心肌病生物样品的试剂盒[0082]一种筛查扩张型心肌病易患扩张型心肌病生物样品的试剂盒，其至少包含能够检测以下任一种突变的引物:Chmp4c基因的c.488AG突变、LMNA基因的c.961CT突变、MYH7基因的c•2458GC突变，用于筛查易患扩张型心肌病的生物样品。优选地，用于检测Chmp4c基因的c.488AG突变的引物系列如SEQIDN0:5和SEQID船:6所示，用于检测1^八基因的c.961CT突变的引物系列如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示，用于检测MYH7基因的c.2458GC突变的引物系列如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示。[0083]利用上述试剂盒筛选患有或易患DCM的生物样品的具体步骤为:提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有对应突变，能够有效地检测本发明的Chmp4c、LMNA、MYH7基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患DCM，进一步，能够从待测者中筛选出易患DCM的生物样品。[0084]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种分离的编码突变体的核酸分子或其片段，其特征在于，所述的核酸分子或其片段选自下列中的任一种：a与SEQIDN0:1相比，具有c.488AG突变；b与SEQIDN0:7相比，具有c.961CT突变；c与SEQID购：13相比，具有；.24580：突变。2.—种分离的多肽或其片段，其特征在于，所述的多肽或其片段选自下列中的任一种：a与SEQIDN0:2相比，具有p.Glu163Gly突变；13与3£〇10冊:8相比，具有？.八作321了6：^突变；：与5£010购：14相比，具有口31820?1'〇突变。3.—种用于筛查扩张型心肌病或筛选易患扩张型心肌病生物样品的试剂盒，其特征在于，含有:适于检测Chmp4c基因突变体、LMNA基因突变体或MYH7基因突变体的试剂，其中与SEQIDN0:1相比，所述的Chmp4c基因突变体具有c.488AG突变，与SEQIDN0:7相比，所述的LMNA基因突变体具有C.961CT突变，与SEQID购：13相比，所述的1¥117基因突变体具有c.2458GC突变。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩张型心肌病为家族性扩张型心肌病。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩张型心肌病其患病个体属于汉族人群。6.—种筛查扩张型心肌病或筛选易患扩张型心肌病生物样品的系统，其特征在于，包括：核酸提取装置，所述的核酸提取装置用于从所述的生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述的核酸序列确定装置与所述的核酸提取装置相连，用于对所述的核酸样本进行分析，以便确定所述的核酸样本的核酸序列；判断装置，所述的判断装置与所述的核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQIDN0:1相比，是否具有c.488AG突变，或与SEQIDN0:7相比，是否具有C.961CT突变，或与SEQID屻：13相比，是否具有：.24580：突变，判断所述的生物样品是否属于或易患扩张型心肌病。7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述的核酸提取装置进一步包括:RNA提取单元，所述的RNA提取单元用于从所述的生物样品提取RNA样本；以及反转录单元，所述的反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述的RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述的cDNA样本构成所述的核酸样本。8.正常的Chmp4c基因或者正常的Chmp4c蛋白质在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗或者预防扩张型心肌病，所述的患者具有Chmp4c基因c_488AG突变或Chmp4c蛋白p.Glu163Gly突变。9.正常的LMNA基因或者正常的LMNA蛋白质在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗或者预防扩张型心肌病，所述的患者具有LMNA基因C.961CT突变或LMNA蛋白p.Arg321Ter突变。10.正常的MYH7基因或者正常的MYH7蛋白质在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗或者预防扩张型心肌病，所述的患者具有MYH7基因C.245SGX：突变或MYH7蛋白p.Ala82〇Pro突变

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