申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2017-05-05

公开（公告）日：2020-09-01

公开（公告）号：CN108796107B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.01#授权;2018.12.07#实质审查的生效;2018.11.13#公开

摘要：本发明提供了与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记及其应用。本发明提供的SNP分子标记通过KASP技术采用三条引物检测得到，所述三条引物分别为：两条末端碱基不同的等位基因正向引物SEQIDNO.4+NO.1，SEQIDNO.5+NO.2和一条反向引物SEQIDNO.3，其中SEQIDNO.4、5分别为两条正向引物的接头序列。本发明的SNP标记有助于黄瓜表皮毛硬度相关基因的克隆及黄瓜分子标记辅助选择育种体系的建立，且此标记与果刺硬度性状共分离，可以简便、快速、高通量地应用于黄瓜果刺硬度差异类型的筛选，对提高黄瓜育种选择效率具有重要的应用价值。

主权项：1.与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记，该标记位于黄瓜1号染色体6246611bp的位置处，其多态性为TC,该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQIDNO.6所示。

全文数据：与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记及其应用技术领域[0001]本发明属于植物分子遗传育种领域，具体涉及与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的的SNP分子标记及其应用。背景技术[0002]黄瓜（CucumissativusL.是萌芦科（Cucurbitaceae黄瓜属（Cucumis—年蔓生的草本植物，是我国主栽蔬菜作物之一。黄瓜作为重要的果菜类蔬菜，果实品质一直是黄瓜育种研究的重点。果实的品质分为感观品质、风味品质和营养品质，目前已鉴定的品质基因多为感观品质基因，包括瓜色、瓜长、果刺多少、果刺颜色、果瘤大小、果色均匀度、光泽度、果棱、果实表面黄色条纹等。其中外观品质对黄瓜的商品性具有重要影响。果刺是附着于果实表面的一种特化的表皮毛，果刺的软硬是影响黄瓜果实商品性状的重要指标之一。黄瓜果刺硬度是指黄瓜果刺质地软硬触感扎手与否）的程度。现在市场上多数的有刺黄瓜为硬刺品种，本实验室在田间发现一种软刺品种。研究黄瓜果刺硬度的遗传及分子标记，对于选育符合市场需求的黄瓜新品种具有重要意义。[0003]果刺的软硬是影响黄瓜果实商品性状的重要指标之一。黄瓜果刺硬度是指黄瓜果刺质地软硬的程度。据申请人调查，相对于硬刺型而言，软果刺易脱落及造成果实失水，影响果实的耐藏性。且生产管理过程中，黄瓜植株颈部易于折断，特别是遇田间吊蔓等田间生产管理不及时，易于因生长点折断等植株损伤而造成产量降低等经济缺失。因此，分离黄瓜果刺硬度调控基因，并开展其生物学功能研究对进一步探讨黄瓜果刺发育机制及分子育种具有重要理论及实践意义。然而，截至目前有关果刺硬度的基因及其分子标记开发的研究尚未见报道。[0004]BSA，即混池分组分析法Bulksegregantanalysis，是最常用的标记筛选方法，该方法在一对具有目的基因表型差异的亲本所构建的分离群体中，根据目标性状的表型，将分离群体如F2代表型极端的子代分别混合成两个样本池，形成两个相对性状的“基因池”（Genepool，然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两池间表现出多态性的分子标记与目的基因座位相连锁，再利用分离群体进一步检测所得分子标记与目的基因的连锁程度，从而确定其在已知分子图谱或染色体上的位置。由于构建基因池使用了特定的分离群体，且在分组时仅对目的基因表型进行选择，这样保证了其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上应主要在目的基因区段存在差异，排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠。[0005]单核苷酸多态性（SNPs，广泛存在于真核生物中，是指染色体基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，是继限制性酶切片断长度多态性、可变数量重复序列和微卫星多态性之后的新一代多态性遗传标记，此标记应用领域广泛，如关联分析，遗传多样性分析等等，在分子标记辅助选择育种中起着至关重要的作用。[0006]KASP技术已经成为国际上SNP分析的主流方法之一，KASP是竞争性等位基因特异性PCRKompetitiveAlleleSpecificPCR的缩写，可以对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDelsInsertionsandDeletions，插入和缺失）JASP技术可以应用于任何规模的检测SNP标记基因分型基因工程，缩短标记的验证时间，减少标记的检测成本，是当前应用于植物分子标记定位和大群体扫描的重要方式。[0007]KASP在大规模标记验证工作的应用中也具有明显优势，当通过一系列手段得到某个性状相关联的候选分子标记后SNPsIndels，将对更大的群体进行实验验证。一般验证工作会选择上千份样本进行，但对于如此之大的群体进行多个位点的验证，将会带来非常大的工作量，相当占用人力物力。基于PCR原理的KASP技术却可对此难题迎刃而解，使得几千样本，上百位点的基因分析工作快速完成。不仅如此，KASP平台还配套有DNA自动提取功能，可以实现一站式完成超大样本量的分子标记验证工作。KASP基于自己独特的ARMPCR原理，可以让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，所以在医学、农学检测方面KASP都具有非常好的应用前景。[0008]植物品种鉴定与种子质量控制在育种工作中是非常重要的，播种前通过对种子品种的鉴定可以有效避免育种工作中出现不必要的风险;通过种子质量控制可以保证种子的遗传纯度，降低种植成本。传统方式对品种进行鉴定或对种子质量进行评估的成本较高，鉴定周期较长，而KASP技术则可以有效避免这两个缺点，使得育种成本大大降低，鉴定周期也明显缩短，是品种鉴定与种子质量控制方面的一项优选技术。发明内容[0009]本发明目的在于提供一种与黄瓜表皮毛及果刺硬度基因Hard共分离的分子标记。[0010]本发明另一目的是提供一种利用本发明的SNP分子标记快速、简便鉴别黄瓜表皮毛及果刺硬度性状的方法。[0011]本发明利用BSA法，高效快速的找到与性状相关的分子标记，以便分子标记辅助育种体系的建立以及快速、高通量地应用于育种实践。[0012]本发明涉及了一个与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记，命名为CosegregatedSNP-H，该SNP分子标记位于黄瓜1号染色体62466Ilbp的位置处，其多态性为TC，该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQIDNO.6所示，该序列第25位碱基的多态性为TC。[0013]CCAGAATGGGCGTCTCTGATACTG[TC]AAGTAGCTCGAATTCGACTGATTTTTATCTTGTTTGCTGCTTGGTGTTATATTCTTGTTTTGGCTGTCCCTTSEQIDNO.6。硬刺型为T，软刺型为C。[0014]进一步地，本发明的SNP分子标记，其由以下任一特异性引物对扩增获得：[0015]正向引物1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’（SEQIDN0.4+SEQIDN0.1，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’_GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’（SEQIDN0.3;S[0016]正向引物2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’（SEQIDN0.5+SEQIDN0.2，其中第l-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3,SEQIDN0.3〇[0017]本发明提供了用于检测上述SNP分子标记的特异性引物对，其为：正向引物1:5’_GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’（SEQIDN0.4+SEQIDN0.1，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物:5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’（SEQIDN0.3;或[0018]正向引物2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’（SEQIDN0.5+SEQIDN0.2，其中第l-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3,SEQIDN0.3〇[0019]进一步地，本发明还提供了一种用于检测黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记的引物组合，含有SEQIDNO.4+N0.1和SEQIDNO.3;或SEQIDNO.5+N0.2和SEQIDΝ0·3〇[0020]含有SEQIDΝ0.4+Ν0.1和SEQIDΝ0.3;或SEQIDΝ0.5+Ν0.2和SEQIDΝ0.3的引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。[0021]本发明提供了含有SEQIDNO.1-3所示的引物组合的试剂盒，并且SEQIDNO.1-2所示的两条引物5’端分别连有SEQIDNO.4-5所示的检测接头序列。[0022]本发明提供了上述特异性引物对或引物组合在黄瓜果刺硬度鉴定中的应用。[0023]本发明提供了上述特异性引物对或引物组合在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。[0024]本发明提供了上述特异性引物对或引物组合在黄瓜种质资源改良中的应用。[0025]本发明提供了一种鉴定黄瓜果刺硬度的方法，包括以下步骤：[0026]1提取待测黄瓜的基因组DNA;[0027]2以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求4所述的引物组合进行KASP，KSAP反应程序:94°C热启动激活151^11;941€2〇863,51-551€6〇863，每个循环降0.6°：，10个循环；94°C20sec，55°C60sec，26个循环；[0028]3图表中靠近X，Y轴的是纯合基因型，分别为TT和CC，靠近对角线位置的是杂合基因型，为TC。[0029]KSAP基因分型结果辨别标准:KSAP热循环反应结束后，会产生荧光信号，荧光信号被PHAstar荧光扫描仪读取，并且在Kraken数据管理分析系统以图表的形式呈现出来；图表分为X，Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起。靠近Χ，Υ轴的是纯合基因型，靠近对角线位置的是杂合基因型。[0030]本发明的实施例中，运用KASP技术，此标记需要设计三条引物，两条末端碱基不同的等位基因正向引物（SEQIDN0.4+N0.1，SEQIDΝ0.5+Ν0.2和一条反向引物（SEQIDNO.3，其中SEQIDNO.4和SEQIDNO.5分别为两条正向引物中的接头序列。[0031]本发明以黄瓜重组自交系3541软刺和3542硬刺为亲本构建Fl和F2,通过性状调查和数据分析群体遗传规律，发现硬刺性状是单基因控制的显性性状，并且利于F2群体，结合BSA法，在硬刺表型和软刺表型中各随机选取100个单株，构建混池，测序，寻求与刺硬度相关的标记位点，最后发现一个与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记，该SNP分子标记位于黄瓜一号染色体624661Ibp处，其多态性为TC。其中，硬刺型为T，软刺为C。[0032]黄瓜果刺的硬度性状是在果实中后期才能看出差异的性状，本发明的分子标记可利用黄瓜种子或子叶长出的早期阶段就可鉴定。并且本发明是利用KASP技术，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型及检测，试验准确度高，成本低、耗时短，可用于黄瓜分子标记辅助选择育种，加速黄瓜品质育种的进程。附图说明[0033]图IA和图IB是标记CosegregatedSNP-H在F2代群体验证结果，图中所示，蓝色点区域代表纯合硬刺基因型（TT，红色点区域代表纯合软刺基因型（CC;绿色点区域代表杂合硬刺基因型TC。[0034]图2是标记CosegregatedSNP-H对不同黄瓜果刺硬度品种的筛选效果图。具体实施方式[0035]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。[0036]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0037]实施例1与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记的获得[0038]1、材料与试剂[0039]黄瓜重组自交系3541软刺和3542硬刺为一对近等基因材料，除了刺硬度差异夕卜，其它无表型差异。[0040]引物由上海捷瑞生物合成，均为PAGE级纯化。[0041]2、软硬刺性状的遗传规律统计[0042]以3542硬刺为母本，3541软刺为父本，获得其杂交Fl代，然后Fl自交得到F2代群体。[0043]黄瓜果刺硬度的鉴定方法:硬刺表型为:基座为圆球状的，与表皮接触面积大；软刺表型为:基座为圆锥状的，与表皮接触面积小，外观可以明显的看出差异。遗传规律符合孟德尔遗传，属于质量性状，单基因控制。如表1所示：[0044]表1在Fl，F2,BClandBC2群体中分析硬刺与软刺的分离比。3542是硬刺，3541是软刺。cx20.05,i=3.84[0045][0046]3、结合BSA法，构建混池，建库测序[0047]3.1构建混池建库[0048]构建4个池，两个亲本池，两个子代池。亲本池为:随机选取3个亲本单株，选取相同大小叶片组织混样。子代池为:F2群体里硬刺表型和软刺表型中各随机选取100个单株，从每个植株里选取相同大小的叶片组织混样。[0049]3·2基因组DNA的提取[0050]用CTAB法提取亲本池及F2子代池的叶片总DNA。方法为:将混样叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于2ml的离心管中；加入Iml65°C预热的CTAB提取液，在加入200ul的β巯基乙醇，在涡旋震荡仪上震荡混匀，使样品完全悬浮，65°C水浴30min，水浴期间混匀2-3次，取出冷却至室温，8000rmp离心5min，取上清800ul至新的2ml离心管中。加入等体积氯仿异戊醇（24:1，混勾后12000rmp离心20min;再取上清600ul至新的2ml离心管中，加入等体积氯仿异戊醇（24:1，混勾后12000rmp离心20min。吸取400ul上清液至新的1.5ml离心管中，加入上清液体积的23体积的异丙醇和I10体积的乙酸钠（3M，充分混匀，-20°C放置Ih。12000rmp离心lOmin，弃上清液，加入500ul75%的乙醇5000rmp离心5s，倒上清（重复一次）。空离离心管，开盖37°C烘箱干燥IOmin至DNA沉淀呈半透明状。加入50ul含lOygml的RNA酶的无菌水，溶解DNA沉淀，37°C水浴Ih，DNA存于-20°C备用。[0051]3.3混池建库测序分析[0052]提取样本中的基因组DNA，并随机打断为小片段，电泳回收所需长度DNA片段进行建库，对测序仪下机的原始数据rawdata按照质控标准进行质控，得到cIeandata。将cleandata与参考基因组作比对，对结果进行格式转化、排序、标记重复，得到待分析的比对文件。通过比对结果进行SNPINDEL分析。[0053]筛选突变亲本和野生亲本中各自特有且纯合的（ratioM.8SNP位点构建SNPlist，通过SNPlist筛选两子代的SNP频率作图，但是两子代的SNP频率没有明显的分离区段，可能是由于突变株是自交过程中产生的，且多代自交纯化，和杂交的野生型亲本差异极小，能用于定位的点较少，所以没有出现明显的分离。因此，本发明筛选出突变亲本中特有的纯合SNP位点（ratio=0.8以及突变亲本中瓜1:;[00.8而野生亲本中抑1:;[0〈0.2的共有SNP位点，并且筛选突变子代中特有的纯合SNP位点，以及突变子代中频率大于0.8而野生子代中频率〈0.5的SNP位点。[0054]实施例2KASP技术用于黄瓜果刺硬度的基因分型[0055]准备：两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的PrimerMix，两条正向引物5’端分别连有不同的检测接头序列；混有2个荧光基团（FAM，HEX的MasterMix;DNA模板。[0056]KSAP反应体系具体分为：①DryDNAmethod:DNANA，2XMastermix5μ1，primermix0·14μ1，Η205μ1,Totalreactionvolume10μ1;②WetDNAmethod:DNA5μ1，2XMastermix5μ1,primermix0·14μ1，H20NA,Totalreactionvolume10μΐ〇[0057]KSAP反应程序:94°C热启动激活15min;94°C20sec，51-55°C60sec，每个循环降0.6°C，10个循环;94°C20sec，55°C60sec，26个循环。[0058]PCR反应I:变性模板与PrimerMix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测接头序列；[0059]PCR反应II:等位基因特异性的末端序列的互补链合成；[0060]PCR反应III:信号产生特异序列对应的检测序列随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。[0061]本发明涉及的黄瓜硬度基因Hard共分离标记CosegregatedSNP-H引物分别为：[0062]正向引物1:5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT3’（其中第1-21喊基是检测接头序列）[0063]正向引物2:5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC3’（其中第1-21喊基是检测接头序列）[0064]反向引物：5’GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA3’[0065]在F2代群体验证结果如图IA和图IB所示。[0066]图表分为X，Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起呈现相同的颜色。靠近χ，γ轴的是纯合基因型（蓝点，红点表示），靠近对角线位置的是杂合基因型绿点表示）。硬刺母本）的基因型为Τ，在靠近X轴的位置蓝点），软刺父本的基因型为C，在靠近Y轴的位置红点），群体分型结果显示:硬刺型的个体都聚团在靠近X轴的位置纯合ΤΤ，蓝点），或靠近对角线的位置杂合TC，绿点），软刺型的个体都聚团在靠近Y轴的位置纯合CC，红点）。证明此标记与性状共分离。[0067]实施例3共分离SNP标记在自然群体中的验证[0068]选取田间65份果刺硬度不同的，且遗传背景较远的黄瓜材料，自然群体中硬刺是常见的，软刺突变是少有的，在这65份材料里有一份软刺材料，其余的都是硬刺材料，通过群体验证来确定实施例1的SNP标记用于分子标记辅助选择的准确性。这些材料果刺硬度不同（判别标准:形态差异，硬刺表型为:基座为圆球状的，与表皮接触面积大;软刺表型为:基座为圆锥状的，与表皮接触面积小，外观可以明显的看出差异）。对CosegregatedSNP-H进行验证，自然群体分型结果显示:硬刺型的个体都聚团在靠近X轴的位置纯合TT，蓝点），软刺型的个体都聚团在靠近Y轴的位置纯合CC，红点）。证明此标记与性状共分离。[0069]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记，该标记位于黄瓜1号染色体6246611bp的位置处，其多态性为TC，该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQIDN0.6所不。2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，其由以下任一特异性引物对扩增获得：正向引物1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物:5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’；或正向引物2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物:5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’。3.用于检测权利要求1或2所述SNP分子标记的特异性引物对，其特征在于，其为：正向引物1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物:5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’；或正向引物2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物:5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’。4.一种用于检测黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记的引物组合，其特征在于，含有三条特异性引物，分别是：正向引物1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，正向引物2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’，与反向引物:5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’。5.含有权利要求3所述特异性引物对或权利要求4所示的引物组合的试剂盒。6.权利要求1〜2任一所述的分子标记或权利要求3所述特异性引物对或权利要求4所示的引物组合在黄瓜果刺硬度鉴定中的应用。7.权利要求1〜2任一所述的分子标记或权利要求3所述特异性引物对或权利要求4所示的引物组合在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。8.权利要求1〜2任一所述的分子标记或权利要求3所述特异性引物对或权利要求4所示的引物组合在黄瓜种质资源改良中的应用。9.一种鉴定黄瓜果刺硬度的方法，其特征在于，包括以下步骤：1提取待测黄瓜的基因组DNA;⑵以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求4所述的引物组合进行KASP，KSAP反应程序:94°C热启动激活15min;94°C20sec，51-55°C60sec，每个循环降0.6°C，10个循环;94°C20sec，55°C60sec，26个循环；⑶图表中靠近X，Y轴的是纯合基因型，靠近对角线位置的是杂合基因型。

百度查询： 中国农业大学 与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记及其应用

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