申请/专利权人：深圳华大智造科技股份有限公司

申请日：2017-05-17

公开（公告）日：2020-10-27

公开（公告）号：CN108070642B

主分类号：C12Q1/6869(20180101)

分类号：C12Q1/6869(20180101)

优先权：["20161117 CN 2016110125498"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.27#授权;2018.06.26#著录事项变更;2018.06.26#专利申请权、专利权的转移;2018.06.19#实质审查的生效;2018.05.25#公开

摘要：本发明公开了一种提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒。本发明的提高DNB双末端测序质量的方法，包括：对DNA纳米球进行一链合成测序时，使用部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序；在所述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链。本发明的方法能够实现完全去除一链的目的，降低一链对二链的负面影响，从而提高DNB双末端测序的读长和质量。

主权项：1.一种提高DNB双末端测序质量的方法，其特征在于，所述方法包括：对DNA纳米球进行一链合成测序时，使用部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序；在所述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链。

全文数据：提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒技术领域[0001]本发明涉及测序技术领域，尤其涉及基于DNA纳米球DNB的基因测序技术领域，特别涉及一种提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒。背景技术[0002]滚环扩增RollingCircleAmplification，RCA是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式而建立的一种恒温核酸扩增技术，美国CompleteGenomicsInc.简称CG利用RCA技术开发了基于DNA纳米球DNAnanoball，DNB的基因测序平台，并将其商业化。2012年华大基因收购CG，开始利用CG专利技术研发新一代双末端测序技术，基于RCA原理的DNB技术再次取得重要突破，成为领域关注热点。[0003]与其他二代测序技术相比较，DNB测序技术具有以下几个优势:DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度;不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积;DNB与芯片上活化位点的大小相同，每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰;这些优势也将意味着DNB测序技术在未来测序方向有重要意义。[0004]DNB双末端测序目前主要是基于多重置换扩增法，如图1所示，主要流程包括:基因组DNA首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状DNA，随后使用滚环扩增技术可将单链环状DNA扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为DNA纳米球，最终DNA纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上，通过联合探针锚定聚合技术cPAS进行第一链ForwardStrand测序，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，形成第二链ReverseStrand，并通过DNA分子锚，进行第二链的测序，具有合成快、准确度高等优点。[0005]基于多重置换扩增法的DNB双末端测序，随着一链测序读长的增加，一链和模板链的结合能力大大增强，而且DNB本身结构等复杂因素，单纯利用高保真聚合酶很难把一链置换完成，无法直接用变性剂洗脱，对二链模板的合成有负面影响，从而影响了二链的测序读长和质量。发明内容[0006]本发明提供一种提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒，本发明的方法利用USER酶能使尿嘧啶位置产生单核苷酸缺口的特性，在一链合成过程中引入部分dUTP，通过USER酶切割使得一链片段化，有效减少一链和模板链的结合能力，然后洗脱和消化一链以减小一链对二链测序质量的影响，有效提高DNB双末端测序数据质量和读长。[0007]根据本发明的第一方面，本发明提供一种提高DNB双末端测序质量的方法，包括：对DNA纳米球进行一链合成测序时，使用部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序;在上述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链。[0008]进一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP总量的I%〜99%，优选50%〜75%。[0009]进一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP总量的50%。[0010]进一步地，上述变性剂是甲酰胺。[0011]根据本发明的第二方面，本发明提供一种DNB双末端测序方法，包括:对DNA纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dNTP混合物中引入部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dTTP位点被dUTP取代;在上述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化;然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。[0012]进一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP总量的1%〜99%，优选50%〜75%。[0013]进一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP总量的50%。[0014]进一步地，上述变性剂是甲酰胺。[0015]根据本发明的第三方面，本发明提供一种DNB双末端测序所使用的试剂盒，包括：用于制备DNA纳米球的试剂成分、一链测序引物、至少包括dUTP在内的dNTP、USER酶、聚合酶、变性剂或外切酶中的至少一种，以及说明书，其中上述说明书包括DNB双末端测序方法；上述方法包括:对DNA纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dNTP混合物中引入部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dTTP位点被dUTP取代;在上述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化;然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除;最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。[0016]进一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP总量的1%〜99%，优选50%〜75%，更优选50%〇[0017]本发明的方法在进行一链合成测序时引入dUTP，然后通过USER酶的切割，使得一链片段化，并结合变性剂或外切酶达到完全去除一链的目的，降低一链对二链的负面影响，从而提高DNB双末端测序的读长和质量。附图说明[0018]图1为现有技术中DNB双末端测序的原理示意图；[0019]图2为本发明实施例的DNB双末端测序的原理示意图。具体实施方式[0020]下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。[0021]如图1所示，现有技术中DNB双末端测序的主要流程包括:基因组DNA首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状DNA，随后使用滚环扩增技术可将单链环状DNA扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为DNA纳米球，最终DNA纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的娃芯片上，（a通过联合探针锚定聚合（cPAS进行（b第一链（ForwardStrand测序，（c在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，形成第二链（ReverseStrand，（d并通过DNA分子锚，进行第二链的测序，具有合成快、准确度高等优点。[0022]但是，现有技术中的基于多重置换扩增法的DNB双末端测序，随着一链测序读长的增加，一链和模板链的结合能力大大增强，而且DNB本身结构等复杂因素，单纯利用高保真聚合酶很难把一链置换完成，无法直接用变性剂洗脱，对二链模板的合成有负面影响，从而影响了二链的测序读长和质量。[0023]针对现有技术中的问题，本发明提供一种新的DNB双末端测序方法，如图2所示，包括:对DNA纳米球进行一链合成测序时，（a先杂交一链测序引物，（b然后在dNTP混合物中引入部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dTTP位点被dUTP取代；c在上述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化；（d然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；（e最后通过聚合和链置换的作用生成二链，（f从而进行双末端测序。[0024]在本发明的方法中，DNA纳米球可以按照CG公司的滚环扩增技术制备。本发明的DNB双末端测序方法相对于现有技术中DNB双末端测序方法，其不同点主要在于:对DNA纳米球进行一链合成测序时，使用部分dUTP脱氧尿苷三磷酸代替dTTP脱氧胸苷三磷酸），之后使用USER酶消化一链上的尿嘧啶。[0025]本发明中使用的USER酶，可以以采用例如NEB公司的USER™尿嘧啶-特异性切除试剂）酶，其在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。该USER酶是尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和DNA糖基化酶-裂解酶EndoVI的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切割，形成一个脱碱基脱嘧啶位点，但保持磷酸二酯骨架结构完整。EndoVI的裂解酶活力使脱碱基位点3’和5’端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖。[0026]在本发明的方法中，dUTP的用量可以在较大的范围内变化均有效，例如dUTP占dUTP和dTTP总量的1%〜99%，优选50%〜75%，更优选50%。[0027]使用USER酶消化一链上的尿嘧啶之后，可以使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，或者先后使用外切酶和变性剂处理，以完全去除一链，降低一链对二链的负面影响，从而提高DNB双末端测序的读长和质量。在本发明的实施例中，以甲酰胺作为变性剂。然而，本发明并不排除使用其它变性剂的情况。[0028]相应地，本发明还提供一种DNB双末端测序所使用的试剂盒，包括：用于制备DNA纳米球的试剂成分、一链测序引物、至少包括dUTP在内的dNTP、USER酶、聚合酶、变性剂或外切酶中的至少一种，以及说明书，其中说明书包括DNB双末端测序方法;该方法包括:对DNA纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dNTP混合物中引入部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dTTP位点被dUTP取代;在上述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化;然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。[0029]需要说明的是，本发明的试剂盒优选包括用于制备DNA纳米球的试剂成分、一链测序引物、至少包括dUTP在内的dNTP、USER酶、聚合酶、变性剂和外切酶所有组分，构成一个完整的试剂盒。然而，本发明也不排除那种仅包括上述成分中的一种或多种的情况。上述成分中，用于制备DNA纳米球的试剂成分可以采用CG公司的试剂成分;至少包括dUTP在内的dNTP是指单独的dUTP成分，或者含有dUTP以及其它脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物。[0030]下面通过具体案例的方式进一步说明本发明。下面的案例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。[0031]实施例[0032]以BGISEQ500平台为例，展示本发明的方法和得到的测试效果。本实施例的DNB双末端测序的方法，包括如下步骤：[0033]1参照BGISEQ500文库制备的操作说明书，构建单链环状DNA文库。[0034]2参照BGISEQ500测序仪的操作说明书，将DNA纳米球DNB装载到阵列化的硅芯片上。[0035]3对DNB进行一链合成测序，主要包括以下步骤:先杂交一链测序引物，引物序列为5’-GCTCACATCAGGCCATTAGGCTACGAGACTT-3’（SEQIDN0:l;然后在dNTP混合物中引入部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dTTP位点被dUTP取代，本实施例中采用的dUTP占dUTP和dTTP总量分别为0%、25%、50%、75%;在上述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化;然后使用变性剂（甲酰胺洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除，具体检测信号的方法参考BGISEQ500测序仪说明书，得到的信号值;最后通过聚合和链置换的作用生成二链，再加入互补链的测序引物，引物序列为5’-CCTAAGACCAAGCTAGGTCCGACTT-3’SEQIDN0:2从而进行双末端测序，并比较不同测试条件的二链信号值。[0036]测试中发现，当增加dUTP占dUTP和dTTP总量时，随着dUTP的占比增加，一链完成后残留的信号降低，即一链去除地越干净，结果如表1所示，在dUTP占dUTP和dTTP总量为50%和75%时，几乎完全去除，得到的信号值与背景值相近。而二链的合成信号随着dUTP的占比增加而有明显上升的趋势，结果如表2所示，在dUTP占dUTP和dTTP总量为50%时表现为最佳。[0037]表IBGISEQ500测序仪检测到的一链完成去除后的信号值[0038][0039]表2BGISEQ500测序仪检测到的二链信号值[0040][0041]以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

权利要求：1.一种提高DNB双末端测序质量的方法，其特征在于，所述方法包括:对DNA纳米球进行一链合成测序时，使用部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序;在所述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链。2.根据权利要求1所述的提高DNB双末端测序质量的方法，其特征在于，所述dUTP占dUTP和dTTP总量的1%〜99%，优选50%〜75%。3.根据权利要求2所述的提高DNB双末端测序质量的方法，其特征在于，所述dUTP占dUTP和dTTP总量的50%。4.根据权利要求1-3任一项所述的提高DNB双末端测序质量的方法，其特征在于，所述变性剂是甲酰胺。5.—种DNB双末端测序方法，其特征在于，所述方法包括：对DNA纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dNTP混合物中引入部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dTTP位点被dUTP取代；在所述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化；然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。6.根据权利要求5所述的DNB双末端测序方法，其特征在于，所述dUTP占dUTP和dTTP总量的1%〜99%，优选50%〜75%。7.根据权利要求6所述的DNB双末端测序方法，其特征在于，所述dUTP占dUTP和dTTP总量的50%。8.根据权利要求5-8任一项所述的DNB双末端测序方法，其特征在于，所述变性剂是甲酰胺。9.一种DNB双末端测序所使用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于制备DNA纳米球的试剂成分、一链测序引物、至少包括dUTP在内的dNTP、USER酶、聚合酶、变性剂或外切酶中的至少一种，以及说明书，其中所述说明书包括DNB双末端测序方法；所述方法包括:对DNA纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dNTP混合物中引入部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dTTP位点被dUTP取代;在所述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化;然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除;最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。10.根据权利要求9所述的DNB双末端测序所使用的试剂盒，其特征在于，所述dUTP占dUTP和dTTP总量的1%〜99%，优选50%〜75%，更优选50%。

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