申请/专利权人：河南农业大学

申请日：2017-05-12

公开（公告）日：2020-11-24

公开（公告）号：CN107058458B

主分类号：C12Q1/06(20060101)

分类号：C12Q1/06(20060101);C12N1/20(20060101);C12R1/40(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.24#授权;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开

摘要：本发明涉及一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其包括如下步骤：1）小麦转接及液体培养：将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体MS培养基中，在白天25‑28℃、光照16h，夜间15‑20℃、黑暗条件下，于水平摇床上20‑50rmp培养24‑48h，然后添加1‑3ml菌悬液，再继续培养5‑10天；2）小麦根系定殖细菌数量计数：取出小麦苗，用无菌滤纸将根部的培养基擦去，称重；然后置于组织研磨器中，添加2ml1×PBS缓冲液，研磨至浆状，采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。本发明方法在无菌环境下液体震荡培养，培养条件稳定可控，取样方法标准统一。

主权项：1.一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）小麦转接及液体培养：将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体MS培养基中，在白天25-28℃、光照16h，夜间15-20℃、黑暗条件下，于水平摇床上20-50rmp培养24-48h，然后添加1-3ml菌悬液，再继续培养5-10天；2）小麦根系定殖细菌数量计数：取出小麦苗，用无菌滤纸将根部的培养基擦去，称重；然后置于组织研磨器中，添加2ml1×PBS缓冲液，研磨至浆状，采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数；步骤1）中，菌悬液经下述步骤获得：TSB液体培养基5-10ml，110-121℃灭菌10-30min；接入恶臭假单胞菌UW4菌苔，28-37℃、200-260rmp培养12-24h，离心收集菌体，菌体用液体MS培养基洗涤，然后用液体MS培养基悬浮并调至OD600值为1即得。

全文数据：一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法技术领域[0001]本发明属于植物根系定殖测定技术领域，具体涉及一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法。背景技术[0002]植物促生根际细菌（plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR是能够在植物根际定殖，提高植物营养的可给性、抑制病原菌的生长或产生某些特殊的促生物质，促进植物种子萌发和植物生长、发育的一类细菌。大量研究表明，使用PGPR菌肥，能够减少化肥用量20%-30%，减少农药用量30%以上，农作物增产10%-80%，在发展可持续农业中的作用越来越受到重视。[0003]检测PGPR在根际定殖的方法，常用的是固态基质法。用土壤、草炭或蛭石等固态基质（灭菌或未灭菌栽培植物，接种待测菌剂，培养一段时间后，取植物根系，平板计数或显微观察细菌在根际的定殖情况。固态基质法检测PGPR在根际定殖的影响因素较多，具体包括不同实验室所用基质差异较大，基质和空气中其他微生物的影响，基质含水量难以稳定控制，浇水会造成菌体的淋失，根际土取样方法不易统一等，导致实验的可重复性差，不同实验室之间获得的数据难以比较。因此，亟待研究新的检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法。发明内容[0004]本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，该方法在无菌环境下液体震荡培养，培养条件稳定可控，取样方法标准统一。[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其包括如下步骤：1小麦转接及液体培养:将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体MS培养基中，在白天25-28°C、光照16h，夜间15-20°C、黑暗条件下，于水平摇床上20-50rmp培养24-48h，然后添加卜3ml菌悬液，再继续培养5-10天；2小麦根系定殖细菌数量计数:取出小麦苗，用无菌滤纸将根部的培养基擦去，称重；然后置于组织研磨器中，添加2mlIXPBS缓冲液，研磨至浆状，采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。[0006]具体的，步骤1中，在固体培养基中培养的小麦苗经下述步骤获得：固体MS培养基分装于100-500ml的组织培养瓶中，每瓶分装20-100ml，110-121°C高压灭菌10-30min;在超净工作台中，将催芽后的小麦种子播种于固体MS培养基表面，每瓶播种5-10粒种子;然后将播种后的组织培养瓶在白天25-28°C、光照16h，夜间15-20°C、黑暗的条件下培养至小麦株高5-8cm约需培养5-10天）。[0007]具体的，步骤1中，菌悬液经下述步骤获得:30ml规格的试管中装TSB液体培养基5-10ml，110-121°C灭菌10-30min;接入1环恶臭假单胞菌UW4菌苔，28-37°C、200-260rmp培养12-24h，离心收集菌体，菌体用液体MS培养基洗涤，然后用液体MS培养基悬浮并调至OD60Q值为1即得。[0008]和现有技术相比，本发明的有益效果：本发明方法采用液体震荡培养植物，在培养液中接种典型的PGPR菌剂，培养结束采用平板计数法检测细菌在根际的定殖量。与固态基质法相比，液体震荡培养法能够在无菌环境下培养，培养条件可稳定控制，取样方法标准统一。具体实施方式[0009]以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。实施例[0010]材料与方法。[0011]植物和菌株小麦种子是市售小麦矮抗58;细菌菌株为恶臭假单胞菌UW4PseudomonasputidaUW4:美国农业研究菌种保藏中心保藏保藏编号为NRRLB-50193，保藏日为2008年6月9日）。美国农业研究菌种保藏中心位于伊利诺伊州皮契里亚，由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心，英文全称AgrieultutalResearchServiceCultureColleetion，简称NRRLc3UM能够产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶，可在以1-氨基环丙烷-1-羧酸为唯一氮源的培养基如ADF培养基中生长。[0012]培养基1液体MS培养基（L:KN〇31900mg，NH4N031650mg，KH2P〇4170mg，MgS〇4,7H20370mg，CaCl2·2H2O440mg，KI0.83mg，H3B〇36.2mg，MnS〇4·4H2〇22.3mg，ZnS〇4·7H2O8.6mg，Na2Mo〇4*2H2〇0.25mg，CuS〇4·5H2O0.025mg，CoCl2*6H2〇0.025mg，Na2_EDTA37.25mg，FeS〇4.7H2027.85mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，盐酸硫胺素0.1mg，盐酸P比哆醇0.5mg，烟酸0.5mg，鹿糖30g;2固体MS培养基L:液体MS培养基中添加琼脂7g;3TSB液体培养基:大豆蛋白胨3g，胰蛋白胨17g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，加蒸馏水1000ml，pH7.1—7.5;4LB固体培养基:酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂20g，去离子水1000mL；5ADF培养基：A液（微量元素）：MnS〇4*H2011.19mg，H3B0310mg，CuS〇4*5H2078.22mg，ZnS〇4·7H2O124.6mg，Mo〇310mg，溶解于100mL超纯水无菌）中，_4°C保存；B液FeSCU:FeS〇4·7H2〇100mg溶于IOmL超纯水无菌）中，需现用现配；A、B溶液各取0.1mL，依次加入Na2HPO46.0g，KH2P〇44.0g，l-氨基环丙烷-1-羧酸2.0g，MgS〇4*7H2〇0.2g，葡糖酸2.0g，葡萄糖2.0g，梓檬酸2.0g，琼脂20g，超纯水定容至1000mL，调至pH7.2，121°C灭菌20min。[0013]液体震荡培养。[0014]1.3.1小麦种子预处理挑选籽粒饱满、胚芽完整的小麦种子于干净的平板中。添加95%的酒精使种子完全浸泡，处理30s后，用无菌水洗涤三次，用高压灭菌的滤纸吸取表面水分。用过滤除菌的0.1%升汞浸泡5min，然后用无菌水清洗5遍，在超净工作台中风干。在无菌的平板中平铺一张大小合适的无菌滤纸，将风干后的小麦种子平铺到滤纸上，向平板中添加10mL无菌水。静置于25°C恒温培养箱催芽24h。[0015]1.3.2固体培养基育苗固体MS培养基分装于300ml的组织培养瓶中，每瓶分装50ml。121°C高压灭菌20min。在超净工作台中，将催芽后的小麦种子播种于固体MS培养基表面，每瓶播种5粒种子。将播种后的组织培养瓶在白天25-28°C、光照16h，夜间15-20°C、黑暗条件下，培养至小麦株高5-8cm，培养时间8-10天。[0016]1.3.3菌悬液制备30ml规格的试管中装TSB液体培养基5ml，121°C灭菌30min。接入1环恶臭假单胞菌UW4菌苔，28°C、220rmp培养1211。8000rpm、离心5min收集菌体，菌体用液体MS培养基洗涤3次，用液体MS培养基悬浮并调至OD6qq值为1。[0017]1.3.4小麦转接及液体培养300ml组织培养瓶每瓶分装液体MS培养基50ml，内置一个带孔漂板，121°C高压灭菌20min。将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体MS培养基中，每瓶液体培养基中接3棵苗。组织培养瓶在白天25-28°C、光照16h，夜间15-20°C、黑暗的条件下于水平摇床上40rmp培养24h。在超净工作台中添加Iml菌悬液，再继续培养7天。同时接Iml无菌水用做对照。[0018]1.3.5小麦根系定殖细菌数量计数将小麦苗从液体MS培养基中取出，用无菌滤纸将根部的培养基轻轻擦拭去，置于分析天平中测定根的重量。每个组织培养瓶中取3棵小麦的根一起置于组织研磨器中，添加2mlIXPBS缓冲液，研磨至浆状。采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。[0019]固体培养。[0020]1.4.1种子消毒挑选籽粒饱满、胚芽完整的小麦种子于干净的平板中。添加95%的酒精使种子完全浸泡，处理30s后，用无菌水洗涤三次，用高压灭菌的滤纸吸取表面水分。用过滤除菌的0.1%升汞浸泡5min，然后用无菌水清洗5遍，在超净工作台中风干。[0021]1.4.2细菌接种取1.3.3制备的菌悬液，4°C8000rpm离心5min，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，悬浮于无菌水中，调节菌数为IO9CFUml。将小麦种子于菌悬液中浸泡3-4h，以无菌水为对照。使种子充分吸胀，而后过滤掉菌悬液，用浸润无菌水的纱布盖在种子表面，使种子保持潮湿环境，置于25-28°C恒温培养箱，直到种子露白。[0022]1.4.3蛭石盆栽蛭石与草炭土以干重质量比1:1混匀，浇足水分后，121°c灭菌3h。分装于72穴聚乙烯育苗盘中，将处理过的种子播种，每穴1粒，播深Icm。将植株置于白天22-25Γ、光照16h，夜间15_20°C。每天饶5ml无菌水。第4d、8d和12d接种菌悬液5mL。[0023]小麦根系定殖细菌数量计数盆栽15-21d，小心将植株根系全部挖出。抖落根系上附着的土粒，置于分析天平中测定根的重量。然后，置于组织研磨器中，添加2mlIXPBS缓冲液，研磨至浆状。采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数总菌数）。用ADF固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶产生菌菌数）。[0024]结果2.1液体震荡培养小麦根系定殖细菌数量从表1可见，没接菌的无菌水对照组，在小麦根际没有检测出定殖的细菌，表明整个实验过程能够很好地维持无菌条件。接种恶臭假单胞菌UW4,小麦根际可以检测出定殖的细菌，3个组织培养瓶中小麦根际定殖的细菌数之间的变异系数小于15%，实验误差比较小，表明液体震荡培养植物检测根际定殖的PGPR是可行的。[0025]表1液体震荡培养小麦根际定殖细菌数2.2固体培养小麦根系定殖细菌数量从表2和表3可以看出，尽管实验结果的变异系数比较小，但由于不能做到在无菌条件下操作，未接菌的对照植物根系污染有1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶产生菌和其他细菌，影响实验结果的真实性。[0026]表2固体培养小麦根际定殖总细菌数表3固体培养小麦根际定殖1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶产生菌菌数

权利要求：1.一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：1小麦转接及液体培养:将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体MS培养基中，在白天25-28°C、光照16h，夜间15-20°C、黑暗条件下，于水平摇床上20-50rmp培养24-48h，然后添加卜3ml菌悬液，再继续培养5-10天；2小麦根系定殖细菌数量计数:取出小麦苗，用无菌滤纸将根部的培养基擦去，称重；然后置于组织研磨器中，添加2mlIXPBS缓冲液，研磨至浆状，采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。2.如权利要求1所述检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其特征在于，步骤1中，在固体培养基中培养的小麦苗经下述步骤获得:在超净工作台中，将催芽后的小麦种子播种于固体13培养基表面;然后在白天25-28°：、光照1611，夜间15-20°：、黑暗的条件下培养至小麦株高5_8cm。3.如权利要求1所述检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其特征在于，步骤1中，菌悬液经下述步骤获得:TSB液体培养基5-10ml，110-121°C灭菌10-30min;接入恶臭假单胞菌UW4菌苔，28-37°C、200-260rmp培养12-24h，离心收集菌体，菌体用液体MS培养基洗涤，然后用液体MS培养基悬浮并调至㈤6QQ值为1即得。

百度查询： 河南农业大学 一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD