申请/专利权人：浙江大学

申请日：2019-06-10

公开（公告）日：2020-11-24

公开（公告）号：CN110220875B

主分类号：G01N21/64(20060101)

分类号：G01N21/64(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.24#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.10#公开

摘要：本发明公开一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备及方法，包括照明系统，承载样品的样品台，检测样品发出的荧光的检测系统以及处理器；照明系统包括沿光路依次布置的激光器，用于改变光束横截面的柱面镜组，用于光束相位调制的空间光调制器，用于透过环形光束的光阑，用于扫描的第一振镜，用于改变光片干涉的轴向位置的第二振镜；检测系统包括探测物镜和相机，收集荧光得到晶格光片照明的图像；处理器用于控制空间光调制器、第二振镜和探测物镜，并重构出三维的荧光样品的成像结果。本发明提高了晶格光片照明显微镜的轴向分辨率，并且可以在原有晶格光片显微镜的结构基础上直接进行数据采集，提高获得三维图像数据集的轴向分辨率。

主权项：1.一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，包括产生照明光切片的照明系统，承载样品的样品台，检测样品发出的荧光的检测系统以及处理器；其特征在于：所述的照明系统包括沿光路依次布置的激光器，用于改变光束横截面的柱面镜组，用于光束相位调制的空间光调制器，用于透过环形光束的光阑，用于扫描的第一振镜，用于改变光片干涉的轴向位置的第二振镜；所述的检测系统包括探测物镜和相机，收集荧光得到晶格光片照明的图像；所述的处理器用于控制空间光调制器、第二振镜和探测物镜，并重构出三维的荧光样品的成像结果。

全文数据：一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备及方法技术领域本发明涉及光学成像技术领域，尤其是涉及一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备及方法。背景技术十六世纪末期，世界上首个光学显微镜诞生，它极大地拓展了人们对微观世界的认识，在之后的几个世纪里，光学显微镜被不断地改进，成像速度、分辨率、灵敏度等方面都得到了长足的发展，在生物成像领域发挥着越来越重要的作用。而随着生物技术的高速发展，需要对生理过程具有更加深刻的理解，这也对3D实时成像技术提出了更高的要求。但是，3D实时成像技术的发展，也面临着许多挑战——成功的3D实时成像技术，需要同时达到高空间分辨率、高成像速度、良好的光切片能力、低光损伤和光漂白能力。目前已经有了许多3D实时成像的技术，比如宽场显微技术、共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、以及光切片荧光显微技术。其中，光切片荧光显微技术，由于其高速、低光漂白性和成像的无创性等优势，在这几年里得到了极其迅速的发展。由于光切片荧光显微技术的光低损伤性，它在生物成像领域具有十分重要的地位。但是实际生物成像中，光损伤不仅受激光照射的峰值功率影响，也会收到平均功率的影响。晶格光片显微镜的提出为进一步降低光损伤提供了可能，在晶格光片显微镜中，通过空间光调制器和环形掩模板在空间中干涉出晶格状的光场，之后通过振镜的扫描产生强度均匀的光片，对样品进行照明，极大地降低了光损伤。但是，晶格光片显微镜的轴向分辨率只能达到370纳米左右，进一步的提高非常困难。本发明解决了传统晶格光片照明显微镜的轴向分辨率只能达到370纳米的问题，通过在空间光调制器上加载不同的图案，改变光片的空间强度分布，之后使用荧光差分的方法，得到轴向分辨率高于传统晶格光片显微镜的成像效果。发明内容为实现上述的发明目的，本发明提供一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备及方法，该装置将激光平行入射四片柱面镜，通过柱面镜将本来的圆形光斑变成椭圆形，椭圆形光斑经过二分之一波片之后入射到空间光调制器上，之后经过空间光调制器调制的光通过一个透镜会聚到环形光阑，经过环形光阑的光经过一组透镜后入射到振镜表面，之后经过另外一组透镜后入射到摆动方向与之前振镜垂直的另一振镜上，然后通过一组透镜后会聚到激发物镜的后焦面，经过激发物镜后在空间中干涉得到晶格状的激光空间分布。通过振镜的摆动，形成强度均匀的光片，光片激发样品得到荧光，经过探测物镜，滤光片，场镜进入SCMOS，得到一般晶格光片照明下的一张图片。然后改变空间光调制器上的图案，得到中心强度凹陷的晶格光片，用与之前相同的采集方法得到一张中心强度凹陷的晶格光片照明的图片。之后使用另外一个方向的振镜进行扫描，结合探测物镜压电的移动对三维物镜进行成像，分别得到一般晶格光片照明和中心强度凹陷的晶格光片照明下的三维光片照明图像。最后使用荧光差分的方法，得到一组轴向分辨率提升的三维光片照明图像。本发明具体的装置结构如下：一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，包括产生照明光切片的照明系统，承载样品的样品台，检测样品发出的荧光的检测系统以及处理器；所述的照明系统包括沿光路依次布置的激光器，用于改变光束横截面的柱面镜组，用于光束相位调制的空间光调制器，用于透过环形光束的光阑，用于扫描的第一振镜，用于改变光片干涉的轴向位置的第二振镜；所述的检测系统包括探测物镜和相机，收集荧光得到晶格光片照明的图像；所述的处理器用于控制空间光调制器、第二振镜和探测物镜，并重构出三维的荧光样品的成像结果。所述的柱面镜组包括将圆形横截面的平行光束一个方向拉长的第一柱面透镜组，圆形横截面的平行光束另一个方向缩小的第二柱面透镜组。优选的，所述的柱面镜组与空间光调制器间设有调整光束偏振的半波片。优选的，所述的光阑的形状为椭圆环形。光阑是固定形状的，光阑的作用是滤去空间光调制器所产生的杂散光，把进入物镜后焦面的光限制在一个窄的环形上，使得产生光片的照明视场尽可能的大。光束经所述空间光调制器作用后，在光阑面上分别产生相位相同和相位不同的六个长条形光斑。处理器控制探测物镜沿光轴向移动，并控制第二振镜改变光片干涉的轴向位置，两个光轴向的位移相等，用于对样品进行三维扫描。本发明中装置的具体实施步骤如下：1将激光准直后入射到两组，每组两片柱面镜上，出射得到一个横截面为椭圆形的平行光；2平行光经过二分之一波片后入射到空间光调制器上，经过相位调制的光通过一个透镜会聚；3经过透镜会聚的光，入射到经过设计的环形光阑面上，光阑将入射的光斑超出环形范围的光挡住，只有环形部分的光能继续传播；4经过光阑的光继续传播，分别经过与物镜后焦面共轭的不同方向的两组振镜后会聚在物镜的后焦面；5会聚在物镜后焦面的光斑经过物镜后在探测物镜焦平面处进行干涉，得到空间中晶格状分布的光场；6通过振镜的扫描，在SCMOS的一个曝光时间内得到强度均匀的光片，对样品进行激发，产生荧光，荧光经过探测物镜，滤光片和场镜之后，进入SCMOS，得到一张普通晶格光片照明的图像；7之后改变空间光调制器上的图案，通过振镜扫描，得到中心强度凹陷的光片，重复6中过程，得到一张中心强度凹陷晶格光片照明的图像。8之后转动探测物镜轴向方向的振镜，与探测物镜的压电相配合，分别对两种空间光调制器加载图案下产生光片照明样品的不同二维平面进行拍摄，得到两组物体的三维图像。9使用荧光差分方法，调整相减系数，对两组三维图像进行差分操作，得到轴向分辨率提高的三维图像集。上述技术方案中，步骤2在每个曝光时间内，空间光调制器上调制的图案是相同的，步骤6中，会得到一张普通晶格光片照明下样品的二维图像，步骤7中，改变空间光调制器上的图案，与2中所加载的图案不同，在整个拍照过程中，空间光调制器上的图案在步骤2和步骤7中的图案反复切换，但每个曝光时间内的空间光调制器上的图案保持不变，步骤8中，通过扫描，得到两组样品在不同晶格光场照明下的三维图像，步骤9中，得到一组最终的结果三维图像集。一个具体的方案是，在步骤3中的光阑是固定形状的，光阑的作用是滤去空间光调制器所产生的杂散光，把进入物镜后焦面的光限制在一个窄的环形上，使得产生光片的照明视场尽可能的大。另一个具体的方案是，在步骤6和步骤8中所使用的两个单轴方向垂直的振镜，都是与激发物镜的后焦面共轭的；除此之外，方案中所使用的空间光调制器是与激发物镜的前焦面所共轭的，光阑是与激发物镜的后焦面共轭的。另一个具体的方案为，检测系统包括依次布置的检测物镜、滤光片、管透镜和CCD相机。其中，检测物镜用于收集荧光样品被激发出的荧光，滤光片用于滤除杂散光，管透镜用于将荧光聚焦到SCMOS上，SCMOS用于记录感光面上的荧光信号，并将荧光信号传递给处理器。另一个具体的方案是空间光调制器上加载相位图的计算。首先，根据晶格干涉理论得到所需的晶格光场E1。如图8所示，则普通晶格光场下所需加载的图案为P1＝HrealE1*gx,1其中realx表示取复数x的实部，gx为一维高斯函数，Hx为海维赛德函数。如图9所示，中心强度凹陷的晶格光场下空间光调制器所加的图案为HrealFFTFFTP1*phasemask,2其中FFTx表示二维傅里叶变换，phasemask为图7中所示图案，其中黑色部分相位为π，灰色部分相位为0。本发明还提供一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像方法，包括步骤：1将激光准直后调整为椭圆形的平行光，并入射到空间光调制器上；2经空间光调制器调制后的光束经过环形光阑面，得到圆环形的光束，并会聚激发样品产生荧光；3收集样品发出的荧光，在探测物镜焦平面处进行干涉，得到空间中晶格状分布的光场，通过相机得到一张晶格光片照明的图像；4改变空间光调制器上的图案，通过振镜扫描，得到中心强度凹陷的光片，重复步骤3中过程，得到一张中心强度凹陷晶格光片照明的图像；5转动探测物镜轴向方向的振镜，与探测物镜的压电相配合，分别对两种空间光调制器加载图案下产生光片照明样品的不同二维平面进行拍摄，得到两组物体的三维图像；6使用荧光差分方法，调整相减系数，对两组三维图像进行差分操作，得到轴向分辨率提高的三维图像集。荧光差分方法所采用的公式为Ix,y,z＝I1x,y,z-γI2x,y,z，计算有效信号的强度Ix,y,z，进而得到具有较高轴向分辨率的3D图像，其中γ是一个常数；当所得到的有效信号的强度值Ix,y,z为负时，设置Ix,y,z＝0。本发明的原理如下：传统的晶格光切片荧光显微技术中，通过空间光调制器和光阑产生空间晶格光场，使得光损伤大大降低，但是得到图像的轴向分辨率很难达到300纳米以下。在本发明中，通过拍摄两组不同空间光调制器下相位调制的三维图像集，利用荧光差分技术，对两组三维图像集进行处理，得到轴向分辨率更高的晶格光片三维图像集。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明大大地提高了晶格光片照明显微镜的轴向分辨率，并且可以在原有晶格光片显微镜的结构基础上直接进行数据采集，在没有额外成本的情形下大大提高了获得三维图像数据集的轴向分辨率。附图说明图1为本发明晶格光切片荧光显微镜的结构图；图2为光阑形状的示意图，其中白色为通光部分，黑色为拦光部分,图3为一般晶格光切片显微镜空间光调制器作用下光阑上光的强度，相位示意图，其中水平方向为y方向，竖直方向为z方向，其中白色部分强度为1，黑色部分强度为0；图4为中心强度凹陷晶格光切片显微镜空间光调制器作用下光阑上光的强度，相位示意图，其中水平方向为y方向，竖直方向为z方向，其中白色部分与灰色部分强度相同，为1，相位分别为0，π，黑色部分强度为0；图5为图3情形下晶格光场yz平面强度示意图，其中水平方向为y方向，竖直方向为z方向；图6为图4情形下晶格光场yz平面强度示意图，其中水平方向为y方向，竖直方向为z方向。图7中所示图案为公式2中phasemask，其中黑色部分相位为π，灰色部分相位为0。图8中所示图案分别为普通晶格光场下一种调制器图案的示例，其中黑色部分相位为π，白色部分相位为0；图9中所示图案分别为中心强度凹陷晶格光场下一种调制器图案的示例，其中黑色部分相位为π，白色部分相位为0。具体实施方式下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。参见图1，本实施例的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装置包括，激光器1，准直透镜2，第一柱面透镜组柱面透镜3、柱面透镜4，第二柱面透镜组柱面透镜5、柱面透镜6，半波片7，空间光调制器8，凸透镜9，光阑10，凸透镜11，凸透镜12，单轴振镜13，凸透镜14，凸透镜15，单轴振镜16，凸透镜组包括凸透镜17和凸透镜18，照明物镜19，检测物镜20，滤光片21，管透镜22，SCMOS相机23和计算机24。本发明的装置实施例可以分为四个部分：产生照明光切片的照明系统、承载样品的样品台、检测样品发出的荧光的检测系统以及处理器，本实施例的处理器为计算机24。其中，照明系统包括沿光路依次布置的：激光器1，准直透镜2，第一柱面透镜组柱面透镜3、柱面透镜4，第二柱面透镜组柱面透镜5、柱面透镜6，半波片7，空间光调制器8，凸透镜9，光阑10，凸透镜11，凸透镜12，单轴振镜13，凸透镜14，凸透镜15，单轴振镜16，凸透镜17，凸透镜18和照明物镜19。激光器1发出激光；准直透镜2对激光进行扩束准直；第一柱面镜组和第二柱面镜组的作用使得圆形横截面的平行光束一个方向拉长，一个方向缩小，具体的大小需要与空间光调制器的尺寸相匹配，通过半波片7将光束的偏振调整为空间光调制器8调制效率最高的方向。空间光调制器上施加不同相位图案，经过调制的光经过透镜9会聚到光阑10上。光阑10具体形状如图2所示，空间光调制器作用下会聚在光阑上光的强度，相位如图3所示。在空间光调制器的作用下，在光阑面上分别产生相位相同和相位不同的六个长条形光斑。经过光阑的光经过凸透镜11和凸透镜12会聚到单轴振镜13上，经过单轴振镜13的反射，光束经过凸透镜14和凸透镜15的会聚，入射到单轴振镜16上，之后经过凸透镜组包括凸透镜17和凸透镜18后入射进入照明物镜19。照明物镜19将激发光束投射到荧光样品上。检测系统包括沿Z轴方向依次布置的：检测物镜20，滤光片21，管透镜22和SCMOS23。检测物镜20用于收集荧光样品被激光激发发出的荧光；滤光片21用于滤除收集得到的杂散光；管透镜22用于将收集到的荧光聚集到SCMOS23上；SCMOS23用于记录荧光信号，并将信号传递到计算机24上。计算机24一方面对SCMOS31记录的多幅二维荧光信号进行重构，重构出三维的荧光样品的成像结果；另一方面控制压电改变检测物镜20的轴向位置，使其以固定的步长沿着Z轴移动，再一方面控制单轴振镜16使得光片干涉的轴向位置改变，光片的位置与压电的伸缩量保持一致，使得探测物镜对光片位置始终聚焦；除此之外，计算机还对空间光调制器8和单轴振镜13进行控制，最后还需要对图3中不同空间光调制器图案作用下的光场分布激发得到的三维图像进行荧光差分法的处理，最终得到分辨率提升的晶格光片三维数据集。采用上述装置对荧光样品进行三维成像的过程如下：激光器1中发出的激光光束，经过准直透镜2被扩束准直之后，第一柱面镜组和第二柱面镜组的作用使得圆形横截面的平行光束一个方向拉长，一个方向缩小，具体的大小需要与空间光调制器的尺寸相匹配，通过半波片7将光束的偏振调整为空间光调制器8调制效率最高的方向。空间光调制器上加载相位对光进行相位调制。调制光经过透镜9会聚到光阑10上。光阑10具体形状如图2所示，在光阑上空间光调制器作用下的光的强度和相位如图3所示。经过光阑的光经过凸透镜11和凸透镜12会聚到单轴振镜13上，经过单轴振镜13的反射，光束经过凸透镜14和凸透镜15的会聚，入射到单轴振镜16上，之后经过凸透镜组包括凸透镜17和凸透镜18后入射进入照明物镜19。在SCMOS的一个曝光时间内空间光调制器上的图案保持不变，振镜摆动产生光片，对样品进行激发；之后对样品的同一个二维平面，改变空间光调制器上的图案，同样的振镜摆动产生中心强度凹陷的光片，对样品进行激发，如图4所示。荧光样品被上述光切片激发，发出荧光，被检测物镜20收集，再经过滤光片21滤光，然后被管透镜22聚焦到SCMOS23上，SCMOS23将记录的二维荧光信号传递到计算机24上。图5为图3情形下晶格光场yz平面强度示意图，其中水平方向为y方向，竖直方向为z方向；图6为图4情形下晶格光场yz平面强度示意图，其中水平方向为y方向，竖直方向为z方向。计算机24一方面控制压电改变检测物镜20的轴向位置，使其以固定的步长沿着Z轴移动，再一方面控制振镜16，使得光片干涉的轴向位置改变，光片的位置与压电的伸缩量保持一致，使得探测物镜对光片位置始终聚焦，在每个轴向位置都得到一幅具有荧光样品二维信号的图像。如此，得到不同晶格光场激发下的三维图像。之后利用荧光差分法公式Ix,y,z＝I1x,y,z-γI2x,y,z，进而得到具有较高轴向分辨率的3D图像。以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，包括产生照明光切片的照明系统，承载样品的样品台，检测样品发出的荧光的检测系统以及处理器；其特征在于：所述的照明系统包括沿光路依次布置的激光器，用于改变光束横截面的柱面镜组，用于光束相位调制的空间光调制器，用于透过环形光束的光阑，用于扫描的第一振镜，用于改变光片干涉的轴向位置的第二振镜；所述的检测系统包括探测物镜和相机，收集荧光得到晶格光片照明的图像；所述的处理器用于控制空间光调制器、第二振镜和探测物镜，并重构出三维的荧光样品的成像结果。2.如权利要求1所述的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，其特征在于，所述的柱面镜组包括将圆形横截面的平行光束一个方向拉长的第一柱面透镜组，圆形横截面的平行光束另一个方向缩小的第二柱面透镜组。3.如权利要求1所述的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，其特征在于，所述的柱面镜组与空间光调制器间设有调整光束偏振的半波片。4.如权利要求1所述的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，其特征在于，所述的光阑的形状为椭圆环形。5.如权利要求1所述的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，其特征在于，光束经所述空间光调制器作用后，在光阑面上分别产生相位相同和相位不同的六个长条形光斑。6.如权利要求5所述的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备，其特征在于，处理器控制探测物镜沿光轴向移动，并控制第二振镜改变光片干涉的轴向位置，两个光轴向的位移相等，用于对样品进行三维扫描。7.一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像方法，其特征在于，包括步骤：1将激光准直后调整为椭圆形的平行光，并入射到空间光调制器上；2经空间光调制器调制后的光束经过环形光阑面，得到圆环形的光束，并会聚激发样品产生荧光；3收集样品发出的荧光，在探测物镜焦平面处进行干涉，得到空间中晶格状分布的光场，通过相机得到一张晶格光片照明的图像；4改变空间光调制器上的图案，通过振镜扫描，得到中心强度凹陷的光片，重复步骤3中过程，得到一张中心强度凹陷晶格光片照明的图像；5转动探测物镜轴向方向的振镜，与探测物镜的压电相配合，分别对两种空间光调制器加载图案下产生光片照明样品的不同二维平面进行拍摄，得到两组物体的三维图像；6使用荧光差分方法，调整相减系数，对两组三维图像进行差分操作，得到轴向分辨率提高的三维图像集。8.如权利要求7所述的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像方法，其特征在于，中荧光差分方法所采用的公式为Ix,y,z＝I1x,y,z-γI2x,y,z，计算有效信号的强度Ix,y,z，进而得到具有较高轴向分辨率的3D图像，其中γ是一个常数；当所得到的有效信号的强度值Ix,y,z为负时，设置Ix,y,z＝0。9.如权利要求7所述的基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像方法，其特征在于，利用柱面镜组将激光准直后调整为椭圆形的平行光，所述的柱面镜组包括将圆形横截面的平行光束一个方向拉长的第一柱面透镜组，圆形横截面的平行光束另一个方向缩小的第二柱面透镜组。

百度查询： 浙江大学 一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备及方法

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