申请/专利权人：黄菁

申请日：2019-10-08

公开（公告）日：2021-04-09

公开（公告）号：CN112626116A

主分类号：C12N15/85(20060101)

分类号：C12N15/85(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.15#授权;2021.04.27#实质审查的生效;2021.04.09#公开

摘要：本申请提供了一种对基因组中高效稳定地定点整合大片段外源DNA，例如300kb以上大片段外源DNA的方法。所述方法包括目的基因片段的获得、克隆、定点整合和筛选等过程。

主权项：1.整合目的基因片段的方法，其包括以下步骤：1获得目的基因片段；2将目的基因片段克隆到载体中，在所获得的包含目的基因片段的载体中插入了抗性表达盒1，优选截断型新霉素G418抗性表达盒1，所述表达盒1在5’至3’方向上包含突变型Loxp1，优选Loxp66序列、部分HPRT内含子和抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo基因3’端部分；3将含有所述目的基因片段的载体转化到微生物细胞内，优选为酵母，尤其是酿酒酵母saccharomycescerevisiae细胞内；4将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞，其中所述受体细胞的基因组中已经定点导入了抗性表达盒2，优选截断型新霉素G418抗性表达盒2，所述表达盒2在5’至3’方向上包含部分HPRT内含子、突变型Loxp2，优选Loxp71序列、抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分、含有雌激素受体estrogenreceptor，ER的配体结合区突变体ERT2与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2，和IRES-PuroR结构；5诱导CreERT2的重组酶活性，优选通过加入Tamoxifen诱导CreERT2的重组酶活性，所述Cre重组酶介导所述目的基因片段定点整合到所述受体细胞的基因组中，同时所述表达盒1和表达盒2形成表达完整抗性基因，优选新霉素的抗性表达盒；6筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 黄菁 定点整合大片段外源DNA的方法

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