【发明公布】定点整合大片段外源DNA的方法_黄菁_201910951144.8 

申请/专利权人:黄菁

申请日:2019-10-08

发明/设计人:黄菁;杨波;卢娜;卢刚

公开(公告)日:2021-04-09

代理机构:北京市柳沈律师事务所

公开(公告)号:CN112626116A

代理人:张晓飞;余晓文

主分类号:C12N15/85(20060101)

地址:北京市丰台区洋桥北里小区18楼1门1201室

分类号:C12N15/85(20060101)

优先权:

专利状态码:在审-公开

法律状态:2021.04.09#公开

摘要:本申请提供了一种对基因组中高效稳定地定点整合大片段外源DNA,例如300kb以上大片段外源DNA的方法。所述方法包括目的基因片段的获得、克隆、定点整合和筛选等过程。

主权项:1.整合目的基因片段的方法,其包括以下步骤:1获得目的基因片段;2将目的基因片段克隆到载体中,在所获得的包含目的基因片段的载体中插入了抗性表达盒1,优选截断型新霉素G418抗性表达盒1,所述表达盒1在5’至3’方向上包含突变型Loxp1,优选Loxp66序列、部分HPRT内含子和抗性基因a部分,优选新霉素抗性基因Neo基因3’端部分;3将含有所述目的基因片段的载体转化到微生物细胞内,优选为酵母,尤其是酿酒酵母saccharomycescerevisiae细胞内;4将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞,其中所述受体细胞的基因组中已经定点导入了抗性表达盒2,优选截断型新霉素G418抗性表达盒2,所述表达盒2在5’至3’方向上包含部分HPRT内含子、突变型Loxp2,优选Loxp71序列、抗性基因b部分,优选Neo基因5’端部分、含有雌激素受体estrogenreceptor,ER的配体结合区突变体ERT2与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2,和IRES-PuroR结构;5诱导CreERT2的重组酶活性,优选通过加入Tamoxifen诱导CreERT2的重组酶活性,所述Cre重组酶介导所述目的基因片段定点整合到所述受体细胞的基因组中,同时所述表达盒1和表达盒2形成表达完整抗性基因,优选新霉素的抗性表达盒;6筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。

全文数据:

权利要求:

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