申请/专利权人：山东大学

申请日：2018-03-06

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN108444897B

主分类号：G01N15/14(20060101)

分类号：G01N15/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2018.09.18#实质审查的生效;2018.08.24#公开

摘要：本发明公开了一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪及方法，包括：激光光束整形模块产生激光光片入射到鞘流发生控制模块，鞘流发生控制模块通过水动力聚焦作用形成鞘流效果，从激光光束整形模块入射的激光光片与鞘流作用下的聚焦样品流耦合，并激发样品流中快速流动的待测颗粒或者细胞发生光散射，通过成像采集模块捕获待测颗粒或者细胞的二维光散射图像，并输送至图像处理系统进行数据分析和结果输出。本发明中的新型鞘流技术无需复杂微加工操作，可快速形成鞘流器；通过光片照明技术与该鞘流技术的耦合，可提高光散射检测信噪比，实现对流动颗粒或细胞的免标记、快速成像；本发明基于欧式距离的匹配度查询颗粒尺寸识别方法可实现流式状态下高精度颗粒尺寸识别。

主权项：1.一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪的工作方法，其特征在于，包括光片照明及其厚度测量、水动力聚焦及其鞘流效果测量、鞘流作用下的样本流速测量、流动样品的二维光散射成像检测与测量步骤：1光片照明及其厚度测量：取方形毛细玻璃管，吸取设定量配置好的荧光溶液，并将承载溶液的玻璃管固定在载物台上；启动激光光束整形模块产生激光光片，光片入射到承载荧光溶液的玻璃管上，并且束腰位置处于探测物镜中心，调整物镜，直到光片轮廓清晰；在CMOS传感器前增加波长滤光片，滤除激发光波长，检测荧光溶液的发射波长，启动CMOS传感器，记录光片在玻璃管中的传播轮廓；通过垂直扫描图像中光片的束腰，测量光片厚度；2水动力聚焦及其鞘流效果测量：选择不同管径的玻璃管作为微流通道，构建鞘流流动室；配置荧光溶液作为样本液，纯水作为鞘液，启动鞘流发生控制模块；启动激光光束整形模块，调整照明光片位置，使光片能够与鞘流中聚焦的样本流耦合并激发荧光溶液发射荧光；启动成像采集模块，调整成像物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的样本流轮廓，触发CMOS传感器，记录微流通道中形成鞘流的情况；测量鞘流聚焦作用下样本溶液的宽度，分析样本溶液的宽度随鞘液和样本液的驱动流速变化；3鞘流作用下的样本流速测量：配置微球测试溶液，取设定量溶液作为样本液，纯水作为鞘液，启动鞘流发生控制模块，启动激光光束整形模块，启动成像采集模块，调整成像物镜，出现清晰的光散射微球，启动CMOS传感器，以视频形式记录微球的流动情况；统计多个微球的流速，求得平均速度作为该鞘流作用下的样本流速；4流动样品的二维光散射成像检测与测量：a配置待测样品溶液作为样本液，纯水或PBS缓冲液作为鞘液，启动鞘流发生控制模块；b启动光束整形光路产生激光光片；c启动成像采集模块，调整成像物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的待测样品轮廓，再调整物镜，使之处于离焦模式，物镜收集来自于待测样品分布于空间的散射光，触发CMOS传感器，物镜收集的散射光投射到探测器的平面上，传感器芯片捕获快速流动通过检测窗口时的样本二维光散射图像，视频记录光散射图像结果；d将捕获的二维光散射视频结果输入至图像处理系统进行图像处理和分析；将捕获的二维光散射视频结果输入至图像处理系统进行图像处理和分析，以及基于欧氏距离的相似度匹配二维光散射颗粒尺寸鉴别方法，具体为：1、根据米氏理论，模拟散射体的二维光散射，建立模拟数据库，并得到模拟图像的像素分布矩阵；2、对实验得到后的图像进行归一化、行灰度转换和水平灰度扫描，得到实验图像的像素分布矩阵；3、实验图像的像素分布矩阵与模拟图像的像素矩阵进行基于欧氏距离的相似度计算，得到欧氏距离值结果矩阵；4、求得欧氏距离值结果矩阵最小值，得到待测样品散射图样与模拟数据库最匹配的结果，该模拟散射体对应的模拟散射参数就是待测样品的粒径、折射率参数信息。

全文数据：基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪及方法技术领域[0001]本发明涉及生物医学仪器、细胞检测技术、微流控技术、光片技术等领域，具体是基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪及方法。背景技术[0002]细胞识别与分类对临床病理分析和诊断极其重要。目前，流式细胞仪是细胞检测分析的主要工具之一。流式细胞仪通常借助鞘流技术对高速流动的细胞实现队列化，然后利用光散射技术和荧光标记技术实现对单个细胞的多参数定性或定量检测分析。流式细胞仪通过集成多波长激光，多色荧光标记以及多通道检测，具有检测速度快、特异性高等优点。其缺点主要表现在体积较大、价格昂贵、操作过程复杂以及需要专业人员操作等，这限制了流式细胞仪的推广使用，尤其是在欠发达地区。[0003]针对以上存在的问题，人们提出了基于微流控技术的流式细胞检测。微流控流式细胞仪通过微加工技术和光学检测方法的融合，减小了仪器体积和成本，增强了仪器的灵活性、兼容性。此外，微流控流式细胞仪还具有样本量消耗小、反应速度快等优点。流式细胞仪中，鞘流作用将样品液聚焦成细流，让细胞以直线排列的方式快速流动，同时入射激光被整形成截面为圆形或椭圆形的光束，处于整形后光束中心的快速流动的细胞被激发，产生细胞散射光或荧光。鞘流效果不理想会使细胞偏离轴心，聚焦光束可能无法均匀、有较激发细胞，从而影响检测结果的准确性和稳定性。微流控细胞仪通常基于微加工技术，比如通过刻蚀技术实现不同的微流通道结构，进而实现鞘流作用，这对微加工操作水平和操作环境超净间要求较高。[0004]流式细胞仪荧光标记检测技术具有特异性强、灵敏度高的特点，能有效实现对细胞的检测分类。然而，荧光染色的操作繁琐，标记物可能影响生物细胞性质，特别是活细胞。此外，荧光试剂的价格也比较昂贵。近年来，人们提出了不依赖荧光标记物的免标记检测方法，目的是在非千扰非侵入的自然状态下获取细胞的结构、组分信息。光散射检测是一种有效的免标记细胞检测方法。微流控光散射细胞仪将光散射技术与微流控技术相结合，可实现对细胞的免标记、快速无损分析，但光散射检测信号容易受到入射光、腔室壁反射光等的影响，尤其是对于弱散射样本，有效提高光散射检测信噪比是一个很重要的问题。发明内容[0005]研发新型鞘流技术、光束激发技术及其耦合技术有望促进微流控流式细胞仪发展。本发明提出了一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪及方法，所发明鞘流技术无需复杂微加工操作，可快速、低成本形成鞘流器，通过光片照明技术与该鞘流技术的耦合，可显著提高光散射检测信噪比，实现对流动颗粒或细胞的免标记、快速成像。本发明实现了对颗粒的亚微米尺寸识别以及对细胞的高通量、免标记、快速检测。所发明基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪及方法具有检测速度快、精度高、体积小、成本低、操作简单等特点，具有较高的推广价值。[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0007]本发明公开了一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞伩，包括:激光光束整形模块、鞘流发生控制模块、成像采集模块和图像处理系统；[0008]所述激光光束整形模块产生激光光片入射到所述鞘流发生控制模块，所述鞘流发生控制模块通过水动力聚焦作用形成鞘流，激光光片与鞘流作用下的聚焦样品流耦合，样品流中快速流动的待测颗粒或者细胞被激发并发生光散射，通过所述成像采集模块捕获待测颗粒或者细胞的二维光散射图像，并输送至所述图像处理系统进行数据分析和结果输出。[0009]进一步的，所述激光光束整形模块包括:依次设置的激光光源，准直透镜，光束扩束器，柱面透镜组和机械狭缝；[0010]所述激光光源产生单色纺锤形光束，经过准直透镜后的激光束投射到光束扩束器上，然后通过柱面透镜进行光束整形，形成激光光片，光片宽度由机械狭缝控制。[0011]进一步的，所述柱面透镜组包含焦距不同的柱面透镜，能够形成厚度在微米级的不同光片。[0012]进一步的，所述柱面透镜组安装在可调安装座上，通过安装座选择所需要的柱面透镜。[0013]进一步的，所述鞘流发生控制模块包括:鞘流流动室，样本控制台，鞘液进样导管，鞘液注射器，鞘液注射栗，样本液进样导管，样本液注射器，样本液注射栗，废液导管，废液池；[00M]所述鞘流流动室固定在控制台上，鞘液注射器通过鞘液进样导管连接鞘流流动室，样本液注射器通过样本液进样导管连接鞘流流动室，鞘液注射泵驱动鞘液流动，样本液注射泵驱动样本液流动，废液池通过废液导管连接鞘流流动室。[0015]进一步的，所述鞘流流动室是以两根管径大小不同的玻璃管为微流通道构成的双玻璃管嵌套结构。[0016]进一步的，所述成像采集模块包括:成像物镜，物镜安装控制台，CMOS传感器；[0017]所述成像物镜固定在物镜安装控制台上，CMOS传感器记录被成像物镜图像探测到的散射图像。[0018]本发明公开了一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪的工作方法，包括光片照明及其厚度测量、水动力聚焦及其鞘流效果测量、鞘流作用下的样本流速测量、流动样品的二维光散射成像检测与测量：[0019]1光片照明及其厚度测量：[0020]取方形毛细玻璃管，吸取设定量配置好的荧光溶液，并将承载溶液的玻璃管固定在样物台上；启动激光光束整形模块产生激光光片，光片入射到承载荧光溶液的玻璃管上，并且束腰位置处于探测物镜中心，调整物镜，直到光片轮廓清晰;在CMOS传感器前增加波长滤光片，滤除激发光波长，检测荧光溶液的发射波长，启动CMOS传感器，记录光片在玻璃管中的传播轮廓;通过垂直扫描图像中光片的束腰，测量光片厚度；[0021]2水动力聚焦及其鞘流效果：[0022]选择不同管径的玻璃管作为微流通道，构建鞘流流动室;配置荧光溶液作为样本液，纯水作为鞘液，启动鞘流发生控制模块;启动激光光束整形模块，调整照明光片位置，使光片能够与鞘流中聚焦的样本流耦合并激发荧光溶液发射荧光；启动成像采集模块，调整成像物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的样本流轮廓，触发CMOS传感器，记录微流通道中形成鞘流的情况;测量鞘流聚焦作用下样本溶液的宽度，分析样本溶液的宽度随鞘液和样本液的驱动流速变化；[0023]C3鞘流作用下的样本流速测量：[0024]配置微球测试溶液，取设定量溶液作为样本液，纯水作为鞘液，启动鞘流发生控制模块，启动激光光束整形模块，启动成像采集模块，调整成像物镜，出现清晰的光散射微球，启动CMOS传感器，以视频形式记录微球的流动情况;统计多个微球的流速，求得平均速度作为该鞘流作用下的样本流速。[0025]⑷流动样品的二维光散射成像检测与测量：[0026]a配置待测样品溶液作为样本液，纯水或TOS缓冲液作为鞘液，启动鞘流发生控制模块；[0027]⑹启动光束整形光路产生激光光片；[0028]c启动成像采集模块，调整成像物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的待测样品轮廓，再调整物镜，使之处于离焦模式，物镜收集来自于待测样品分布于空间的散射光，触发CMOS传感器，物镜收集的散射光投射到探测器的平面上，传感器芯片捕获快速流动通过检测窗口时的样品二维光散射图像，视频记录光散射图像结果；[0029]d将捕获的二维光散射视频结果输入至图像处理系统进行图像处理和分析。[0030]进一步的，所述流动样品的二维光散射成像检测与测量的步骤d中，图像处理系统的处理分析算法以及基于欧氏距离的相似度匹配二维光散射颗粒尺寸鉴别方法，具体为：[0031]1.根据米氏理论，模拟散射体的二维光散射，建立模拟数据库，并得到模拟图像的像素分布矩阵；[0032]2.对实验得到后的图像进行归一化、行灰度转换和水平灰度扫描，得到实验图像的像素分布矩阵；[0033]3.实验图像的像素分布矩阵与模拟图像的像素矩阵进行基于欧氏距离的相似度计算，得到欧氏距离值结果矩阵；[0034]4.求得欧氏距离值结果矩阵最小值，得到待测样品散射图样与模拟数据库最匹配的结果，该模拟散射体对应的模拟散射参数就是待测样品的粒径、折射率参数信息。[0035]本发明有益效果：[0036]1本发明中使用玻璃管构建的双玻璃管嵌套结构作为微流体细胞仪的鞘流流动室，玻璃管价格低廉并且容易获得，具备普遍推广性，克服了传统流式细胞仪中鞘流流动室存在的成本尚、体积大等限制性问题；[0037]2本发明中低成本的鞘流发生流动室可作为一次性使用的部件单元，避免了传统流式细胞仪中流动室的重复冲洗过程，简化了装置，也减低了样品交叉污染的可能性；[0038]3本发明中采用玻璃管作为微流体通道，不需要进行微加工操作，制作工序简单，有效减少了制作时间，满足大量、快速生产的要求；[0039]4不同于传统细胞伩中采用点照明方法激发样本，本发明中采用光片照明方法作为激发方式，光片照明与鞘流技术有机融合，降低了成像过程中的背景噪声，提高成像信噪比；[OCMO]5本发明中采用光片激发流式二维光散射技术，相比基于荧光标记的检测方法，f需要依赖于染料标记，免去了染料的消耗成本和染色操作，检测过程简单，也不会对细胞产生直接的损伤和干扰，尤其适于活细胞检测，另外与一维光散射强度测量方法相比，基于图像检测的二维光散射方法能够获得更稳定更丰富的信息；[0041]6本发明提供的基于欧氏距离的相似度匹配颗粒鉴别方法，以模拟数据库作为匹配对象，不需要传统细胞仪标准小球校准提供参考值的复杂实验过程；[0042]7本发明提供的基于欧氏距离的相似度匹配二维光散射颗粒尺寸鉴别方法，突破了传统物镜的光学分辨率限制，分辨率从微米级水平提高到了亚微米级水平。附图说明[0043]图1是本发明装置组成的结构示意图；[0044]图2是本发明中构建的鞘流流动室结构示意图；[0045]图3是本发明中构建的鞘流与激光光片耦合的示意图；[0046]图4是本发明装置对流动样品进行光散射成像的原理示意图；[0047]图5a—图5⑹是本发明实例一中的光片测量与分析结果示意图；[0048]图6a—图6e是本发明实例一中的鞘流效果测试与分析结果示意图；[0049]图7是本发明实例一中不同鞘流效果作用下的样本流体速度分析结果示意图；[00S0]图8a—图8j是本发明实例二中的颗粒尺寸二维光散射成像和鉴别结果示意图；[0051]图中，光束整形模块⑴包括：1激光光源，2准直透镜，3扩束器，4柱面透镜组，5柱面透镜组控制安装座，6机械狭缝；[0052]鞘流发生控制模块（n包括:7鞘流流动室，8样本控制台，9鞘液进样导管，10鞘液注射器，11鞘液注射泵，I2样本液进样导管，13样本液注射器，14样本液注射栗，15废液导管，16废液池；[0053]成像采集模块m包括:17成像物镜，18物镜安装控制台，19CM0S传感器；[0054]图像处理系统IV包括:20图像处理系统。具体实施方式[0055]下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的说明。[0056]本发明公开了一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，装置组成的结构原理如图1所示，包括激光光束整形模块I，鞘流发生控制模块n，成像采集模块m和图像处理系统IV。[0057]激光光束整形模块I产生激光光片入射述鞘流发生控制模块n，鞘流发生控制模块n通过水动力聚焦作用下形成鞘流效果，从激光光束整形模块[入射的激光光片与鞘流作用下p聚焦样品流耦合，并激发样品流中快速流动的待测颗粒或者细胞发生光散射，通过成像采集模块m捕获待测颗粒或者细胞的二维光散射图像，并输送至所述图像处理系统IV进行数据分析和结果输出。[0058]光束整形模块I包括激光光源1，准直透镜2，扩束器3，柱面透镜组4，柱面透镜组控制安装座5,机械狭缝6。激光光源1产生单色纺锤体光束，经过准直透镜2进行光束准直调整，然后投射到扩束器3上对光束直径进行相应倍数的扩大，扩束后的光束经过柱面透镜组4形成光片，光片的宽度通过机械狭缝6进行控制。柱面透镜组4包含焦距不同的柱面透镜，可以形成厚度在微米级的层状光束;柱面透镜组4安装在控制台5上，可以选择实验时使用的柱面透镜，并根据选择的参数对柱面透镜的位置进行调整。本发明中采用激光光源丨是二极管半导体固体激光器，波长是532nm，产生的激光光束直径为1.052mm;光束扩束器3的可选扩束倍数为lx，2x，10x，1¾;柱面透镜组4包括焦距不同的柱面透镜，可选焦距为13.7mm，25•4mm，50•0mm，150.0mm。[0059]鞘流发生控制模块包括鞘流流动室7，样本控制台8，鞘液进样导管9，鞘液注射器10,鞘液注射泵11，样本液进样导管12,样本液注射器13,样本液注射杲14,废液导管15,废液池I6。鞘流流动室7固定在控制台8上，鞘液注射器10通过鞘液进样导管9连接鞘流流动室7，样本液注射器13通过样本液进样导管12连接鞘流流动室7，鞘液注射栗11驱动鞘液流动，样本液注射泵14驱动样本液流动。鞘流流动室7是采用玻璃管构建的双玻璃管嵌套结构，如图2所示，作为鞘液微流通道的外玻璃管外径为D11，内径为D12，长度为L1，作为样本液微流通道的内玻璃管外径为D21，管外径为D22，长度为L2，将外玻璃管套在内玻璃管上并通过塑料固定环形成双玻璃管嵌套结构。固定环为同心环结构，其尺寸根据内外管的尺寸相匹配。样本控制台8是三轴位移平台，控制流动室7的空间移动。由图3所见，鞘流作用下的样本流与激光光片耦合形成激发区域。[0060]成像采集模块包括成像物镜17，物镜安装控制台18，CMOS传感器19。在成像时，物镜I7工作在去焦模式，即通过物镜安装控制台18调整物镜的聚集平面远离待测样本一定距离，该距离定义为离焦距离，被物镜探测到的散射光投射到CMOS传感器，传感器记录该样本的二维光散射图像。本发明中CMOS传感器选择为CMOS相机，传感器芯片尺寸是22.3mmx14•9mm，物镜的放大倍数是10x，数值孔径是0.25。由图4所见，在光片-鞘流耦合激发下的待测颗粒经过检测窗口时的光散射被采集。[0061]图像处理系统20由计算机和基于计算机的程序算法组成。程序算法包括图像特征提取、光散射模拟数据库和相似度搜索与匹配的颗粒尺度鉴别方法算法。光散射模拟数据库是基于Mie理论，根据不同颗粒尺寸和不同折射率的颗粒在单色光激发下散射光的空间分布，模拟获得的光散射图样。然后采用基于欧氏距离的相似度匹配方法对实验得到的光散射图像与数据库的模拟图像进行匹配，从而得到颗粒的尺度、折射率等信息。[0062]实施例1[0063]一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，通过光片与鞘流耦合的方式实现对快速流动的细胞进行单个形式的排列和激发。通过控制鞘流发生装置的参数，可以产生不同的鞘流效果对样本流进行水动力聚焦，样本流的厚度随着参数的不同设定而变化。在实验时可根据待测样本的尺寸选择对应的参数，提供与鞘流效果相适应的光片厚度，保证样本流中的待测颗粒或者细胞能够被均匀有效地激发，同时抑制光散射成像过程中背景噪声的干扰。光片厚度通过使用不同扩束倍数的扩束镜和不同焦距的柱面透镜相互配合的方式可实现灵活控制。本实例中，选择扩束镜的放大倍数是lx，柱面透镜的焦距是150mm。本实例中包括光片照明及其厚度测量、水动力聚焦及其鞘流效果测量、鞘流作用下的样本流速测量。光片照明及其厚度测量的具体操作步骤包括：[0065]⑴配置若丹明6G溶液激发波长535nm，发射波长575nm，取内直径700um、外直径900um的方形毛细玻璃管，取适量配置好的若丹明荧光溶液，并将承载溶液的玻璃管固定在样本载物台上，调整载物台，使玻璃管位于物镜中心；[0066]2打开激光光源，激光光束依次通过准直透镜、lx扩束镜、焦距为150mm的柱面透镜和机械狭缝的中心光轴，激光光束光路保持水平传播，通过柱面透镜安装座调整柱面透镜，使光片入射在承载荧光溶液的玻璃管上，并且光片束腰位置处于成像物镜中心，调整物镜，直到光片轮廓清晰；[0067]3在CMOS相机前增加波长滤光片，滤除激发光波长532nm，检测若丹明溶液的发射波长575nm，启动CMOS相机，记录光片在溶液中的传播轮廓；[0068]⑷通过垂直扫描图像中光片的束腰，测量其光片厚度，此处使用半高宽fwhM作为厚度的刻画参数。[0069]图5a是激光光片通过若丹明溶液显示的轮廓结果示意图，图5⑹是垂直扫描图像测量的光片厚度示意图，测量结果为55wn，这个实验测量的结果与理论计算值一致，说明本发明中的光束控制设计是有效准确的。[0070]水动力聚焦及其鞘流效果测量的具体操作步骤包括：[0071]1选择不同的玻璃管分别作为鞘液微流通道和样本液微流通道，构建鞘流流动室，其中，作为鞘液微流通道的玻璃管参数为内径700um，外径900wn，长度5mm;作为样本液微流通道为管径不同的两种玻璃管，参数为内径lOOwn，外径200wn，长度1mm作为1号玻璃管，内径50wn，外径lOOwii，长度1麵作为2号鞘流室的玻璃管参数，通过固定环固定内外玻璃管，分别构建1号鞘流流动室和2号鞘流流动室；[0072]2选择配置若丹明6G荧光溶液，用样本液注射器取lmL的荧光溶液，鞘液注射器取纯水5mL，分别连接到鞘流流动室的样本进样口和鞘液进样口，并分别固定在两个注射杲上；[0073]3设置注射泵的参数，主要是鞘液液量，样本液液量，鞘液流量速率Q2，样本液流量速率Q2，定义鞘液和样本液的相对流量速率倍数定义为：AQ二Q2Ah。对于驱动样本液的注射泵，液量设置为lmL，Qi设置为2yLmin，对于驱动鞘液的注射泵，液量:5mL，Q2初始值设置为2yLmin，AQ=1。启动注射泵，驱动溶液进入微流通道；[0074]4调整光片位置，使光片能够与鞘流中聚焦的样本流耦合，激发样本液发射荧光；[0075]5在CMOS相机前增加波长滤光片，滤除激发光波长532nm，检测若丹明溶液的发射波长575nm，调整采集物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的样本流轮廓，启动CMOS相机，记录样本液与鞘液的流量速率相等时，微流通道中形成鞘流的情况；[0076]⑹保持不变的情况下，调整Q2，使△Q=2，待鞘流稳定后，启动CMOS相机，记录微流通道中形成鞘流的情况；[0077]⑺重复步骤⑷，增加鞘液的流速直到2000uLmin，AQ=1000;[0078]8通过垂直扫描图像，测量鞘流聚焦作用下样本溶液的宽度，分析样本溶液的宽度随鞘液和样本液的驱动流速变化。[0079]结果如图6a-图6e所示，图6a，图6⑹和图6c是样本液微流通道管径为lOOwn，分别在AQ=50,1〇〇,10000设置参数下得到的测试结果示意图，图6d是样本液微流通道管径为50ym，在AQ=1〇〇〇设置参数下的测试结果示意图，图6e是对不同情况下的聚焦样本流进行数值分析的结果示意图，AQ=5〇时，W=93um;AQ=l〇〇时，W=57um;AQ=1000时，W=19wn。对于不同管径的内管构成的流动室，样本流宽度W随着AQ的变化曲线呈现相似趋势，尤其是当AQ=l〇0〇时，样本流宽胃达到小于20wn的水平。上述结果证明双玻璃管嵌套结构能够作为微流体细胞仪的鞘流流动室，有效形成鞘流。[0080]鞘流作用下的样本流速测量的具体操作步骤包括：[0081]⑴配置微球直径2um测试溶液。取适量微球溶液原液，稀释至约5xl05mL的浓度的lmL测试溶液以及取5mL纯水作为鞘液，并导入流动室；[0082]2设置驱动栗的参数:样本液注射泵的液量设置为lmL，Qi设置为2yLmin，鞘液的注射泵的液量:5mL，Q2初始值设置为2uLmin，AQ=1。启动注射泵，驱动溶液进入鞘流室；[0083]3启动光束整形光路，调整光片位置，使光片能够与鞘流中聚焦的样本流耦合，激发样本流中的微球发生光散射作用；[0084]⑷调整采集物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的光散射微球，启动CMOS相机视频帧频f=25s，视频记录样本液与鞘液的流量速率相等时，鞘流聚焦作用下样本流中颗粒的速度；[0085]⑸保持不变的情况下，调整Q2，使AQ=2，待鞘流稳定后，启动CMOS相机，视频记录微球的流动情况；[0086]⑹重复⑷，增加鞘液的流速直到为2000yLmin，AQ=1000;[0087]7提取视频帧图像，测量同一个微球在连续两帧图像的位移差AS，根据v=AS*f计算出单个微球流速，统计多个微球的流速，求得平均速度作为该鞘流作用下的样本流速。[0088]结果如图7所示，从图中可以看出，当AQ增大时，微球的流速也增加，当AQ=l〇〇时，微球的流速是3.15mras。[0089]实施例2[0090]本发明可实现亚微米分辨率水平颗粒尺寸识别。根据米氏理论构建模拟数据库，对采集的颗粒光散射图像进行基于欧氏距离的相似度匹配，判定颗粒的尺寸、折射率信息。区别于传统的基于相对强度测量的一维光散射方法，本发明基于图像识别的方法能够降低检测过程中入射光等因素对检测结果稳定性的影响，并且不需要标准小球校准过程，简化了颗粒尺寸识别的操作过程。本实例中选择平均直径为3.87wii，标准差为0.25wii的聚苯乙烯微^溶液作为测试溶液，对细胞仪装置的分辨率和精度进行测试分析。本实例中，鞘流流动室采用实施例1中的1号鞘流流动室参数。具体操作步骤包括；[0091]1吸取适量聚苯乙烯微球原液，用超纯水进行稀释，稀释至约5xl〇5mL浓度，取lmL测试溶液以及取5mL纯水作为鞘液，并导入鞘流流动室；[0092]⑵设置为2uLmin，Q2设置为200uLmin，启动注射栗，驱动溶液进入鞘流室；[0093]3启动光束整形光路，调整光片位置，使光片能够与鞘流中聚焦的样本耦合于同一个平面；[0094]⑷调整采集物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的光散射微球;再调整物镜，使之处于离焦状态，离焦距离为200M1，物镜收集来自于微球分布于空间的散射光；[0095]5启动CMOS相机视频帧频f=25s，物镜收集的散射光投射到探测器的平面上，传感器芯片捕获颗粒的二维光散射图像，视频采集快速流动通过检测窗口时的微球光散射图像，长度为5min;[0096]6根据获得的视频结果，提取帧图像，并进行图像截取，获得每个细胞的一张二维光散射图像，形成待分析的实验图像数据库；[0097]7根据米氏理论方法模拟颗粒在空间的光散射分布，并考虑本实例中的实验方案，模拟算法中的关键参数选择为:入射光波长是532nm，散射颗粒折射率是1.591，散射颗粒所环境折射率是1.334,极角和方位角范围是79°〜101°，选取模拟的颗粒直径范围3.60〜4.20mi，离焦距离设置为200mi，构建模拟二维光散射的图像数据库；[0098]⑻将实验数据库中的每一张光散射图像和模拟数据库的图像进行基于欧氏距离的相似度匹配计算，得出匹配值最高的模拟图像，根据该模拟图像所设定的粒径参数估计实验微球的直径大小，并输出结果。[0099]图8a，图8b，图8c，图8d，图8e，分别是实验室采集到的平均粒径为3.87M1，标准差为250nm的颗粒二维光散射图样，由图可见，散射图样呈现条纹分布，并且不同散射图像的条纹数量和强度分布呈现出差异，与模拟数据库的图像进行匹配的结果分别对应于图8f，图8g，图8⑹，图8i，图8j，从而得到粒径分别为3.70um，3.84um，3.87um，3.89圓，3.94圓。根据实验图像和模拟图像的相似度匹配得到颗粒的直径大小，实现了对标准差在±250nm的颗粒尺度分布的检测，鉴别分辨率超过了50nm，说明了本发明装置对于颗粒检测的高灵敏性。[0100]综上，本发明公开的基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，采用玻璃管作为微流通道，构建双玻璃管嵌套结构作为形成三维鞘流的鞘流流动室，省去了常见微流体细胞仪对通道刻蚀技术和操作的要求，不但降低了成本，也缩短了制作时间;低成本的鞘流发生装置可作为一次性使用的单元，避免了传统流式细胞仪中流动室的重复冲洗过程，也大大降低了样品交叉污染的可能性;采用的光片照明与鞘流耦合方式，利用激光光片提供了均匀照明激发样本，降低了成像过程中的背景噪声千扰;二维光散射成像技术提供待测样本极角和方位角两个角度范围上的光散射，与传统一维光散射检测技术相比，不但能够提供更多的信息，而且减小了一维光散射基于强度检测时容易受到入射光强度干扰的问题;在本发明基于欧氏距离的相似度匹配二维光散射颗粒尺寸识别方法，避免了传统细胞仪需要标准小球进行校准的要求，实现了亚微米分辨率水平的微颗粒尺寸鉴别;基于光片激发的二维光散射流式检测分析技术能够避免复杂的染色操作和荧光信号探测过程，在非干扰的自然情况下获得细胞信息，实现对细胞的识别和分类。[0101]上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

权利要求：1.一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，其特征在于，包括：激光光束整形模块、鞘流发生控制模块、成像采集模块和图像处理系统；所述激光光束整形模块产生激光光片入射到所述鞘流发生控制模块，所述鞘流发生控制模块通过水动力聚焦控制鞘流，激光光片与鞘流作用下的聚焦样品流耦合，样品流中快速流动的待测颗粒或者细胞被激发并产生光散射，通过所述成像采集模块捕获待测颗粒或者细胞的二维光散射图像，并输送至所述图像处理系统进行数据分析和结果输出。2.如权利要求1所述的一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，其特征在于，所述激光光束整形模块包括:依次设置的激光光源，准直透镜，光束扩束器，柱面透镜组和机械狭缝；所述激光光源产生单色纺锤形光束，经过准直透镜后的激光束投射到光束扩束器上，然后通过柱面透镜进行光束整形，形成激光光片，光片宽度由机械狭缝控制。3.如权利要求2所述的一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞伩，其特征在于，所述柱面透镜组包含焦距不同的柱面透镜，能够形成厚度在微米级的不同光片。4.如权利要求2所述的一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，其特征在于，所述柱面透镜组安装在可调安装座上，通过安装座选择所需要的柱面透镜。5.如权利要求1所述的一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，其特征在于，所述鞘流发生控制模块包括:鞘流流动室，样本控制台，鞘液进样导管，鞘液注射器，鞘液注射泵，样本液进样导管，样本液注射器，样本液注射栗，废液导管，废液池；所述鞘流流动室固定在控制台上，鞘液注射器通过鞘液进样导管连接鞘流流动室，样本液注射器通过样本液进样导管连接鞘流流动室，鞘液注射栗驱动鞘液流动，样本液注射泵驱动样本液流动，废液池通过废液导管连接鞘流流动室。6.如权利要求5所述的一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，其特征在于，所述鞘流流动室是以管径大小不同的玻璃管为微流通道构成的嵌套结构。7.如权利要求1所述的一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪，其特征在于，所述成像采集模块包括:成像物镜，物镜安装控制台，CMOS传感器；所述成像物镜固定在物镜安装控制台上，CMOS传感器记录被成像物镜探测到的散射图像。8.—种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪的工作方法，其特征在于，包括光片照明及其厚度测量、水动力聚焦及其鞘流效果测量、鞘流作用下的样本流速测量、流动样品的二维光散射成像检测与测量步骤：1光片照明及其厚度测量：取方形毛细玻璃管，吸取设定量配置好的荧光溶液，并将承载溶液的玻璃管固定在载物台上；启动激光光束整形模块产生激光光片，光片入射到承载荧光溶液的玻璃管上，并且束腰位置处于探测物镜中心，调整物镜，直到光片轮廓清晰;在CMOS传感器前增加波长滤光片，滤除激发光波长，检测荧光溶液的发射波长，启动CMOS传感器，记录光片在玻璃管中的传播轮廓;通过垂直扫描图像中光片的束腰，测量光片厚度；⑵水动力聚焦及其鞘流效果测量：选择不同管径的玻璃管作为微流通道，构建鞘流流动室;配置荧光溶液作为样本液，纯水作为鞘液，启动鞘流发生控制模块；启动激光光束整形模块，调整照明光片位置，使光片能够与鞘流中聚焦的样本流耦合并激发荧光溶液发射荧光；启动成像采集模块，调整成像物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的样本流轮廓，触发CMOS传感器，记录微流通道中形成鞘流的情况;测量鞘流聚焦作用下样本溶液的宽度，分析样本溶液的宽度随鞘液和样本液的驱动流速变化；⑶鞘流作用下的样本流速测量：配置微球测试溶液，取设定量溶液作为样本液，纯水作为鞘液，启动鞘流发生控制模块，启动激光光束整形模块，启动成像采集模块，调整成像物镜，出现清晰的光散射微球，启动CMOS传感器，以视频形式记录微球的流动情况;统计多个微球的流速，求得平均速度作为该鞘流作用下的样本流速。⑷流动样品的二维光散射成像检测与测量：a配置待测样品溶液作为样本液，纯水或PBS缓冲液作为鞘液，启动鞘流发生控制模块；⑹启动光束整形光路产生激光光片；c启动成像采集模块，调整成像物镜，使物镜的聚焦平面处于聚焦的样本流上，并出现清晰的待测样品轮廓，再调整物镜，使之处于离焦模式，物镜收集来自于待测样品分布于空间的散射光，触发CMOS传感器，物镜收集的散射光投射到探测器的平面上，传感器芯片捕获快速流动通过检测窗口时的样本二维光散射图像，视频记录光散射图像结果；d将捕获的二维光散射视频结果输入至图像处理系统进行图像处理和分析。9.如权利要求8所述的一种基于光片照明与鞘流技术的免标记微流控细胞仪的工作方法，其特征在于，将捕获的二维光散射视频结果输入至图像处理系统进行图像处理和分析，以及基于欧氏距离的相似度匹配二维光散射颗粒尺寸鉴别方法，具体为：1、根据米氏理论，模拟散射体的二维光散射，建立模拟数据库，并得到模拟图像的像素分布矩阵；2、对实验得到后的图像进行归一化、行灰度转换和水平灰度扫描，得到实验图像的像素分布矩阵；3、实验图像的像素分布矩阵与模拟图像的像素矩阵进行基于欧氏距离的相似度计算，得到欧氏距离值结果矩阵；4、求得欧氏距离值结果矩阵最小值，得到待测样品散射图样与模拟数据库最匹配的结果，该模拟散射体对应的模拟散射参数就是待测样品的粒径、折射率参数信息。

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