申请/专利权人：陕西慧康生物科技有限责任公司

申请日：2017-11-28

公开（公告）日：2021-07-16

公开（公告）号：CN107868118B

主分类号：C07K5/083(20060101)

分类号：C07K5/083(20060101);C07K1/16(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.07.16#授权;2018.05.01#实质审查的生效;2018.04.03#公开

摘要：本发明公开了一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，该方法采用正相色谱先对Boc‑Gly‑HisTrt‑LysBoc‑OH三肽纯化，然后再进行脱保护，得到产品纯度95％以上的GHK三肽，而脱保护并不影响正相色谱纯化Boc‑Gly‑HisTrt‑LysBoc‑OH三肽纯化后的纯度，此方法解决了反相色谱法GHK在反相色谱柱中极性大不保留的问题。而且正相色谱中采用累加进样分离法，此方法可以提高有效柱容量，节省大量时间和消耗，可达到成本低、收率高、规模产业化的要求。

主权项：1.一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：（1）溶样将合成的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH粗品加入甲醇与乙醇体积比为2:8～4:6的混合液中，超声分散后用滤膜过滤，收集滤液；（2）纯化采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15%平衡后，用流动相B:15%累加进样，每隔2～5min进样一次，每次进样量为样品总体积的13～15，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B15%20min、40%～75%60min、75%恒流，样品流速为20～50mLmin，色谱的检测波长为200～240nm；收集纯化后的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH溶液，减压浓缩，得到纯度95%以上的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH；（3）脱保护将纯度95%以上的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3～4小时，减压浓缩，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤，旋转蒸发，冻干，得到纯度95%以上的GHK三肽。

全文数据：一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法技术领域[0001]本发明属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种GHK三肽的纯化方法。背景技术[0002]GHK三肽是一种含有三个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为H-Gly-HiS-LyS-〇H，GHK-Cu在医学上最早用于促进伤口愈合及增进肌肤弹性，近来部分研究认为能改善细纹，GHK有丰唇之功效，使用在唇膏的生产上，使用后使嘴唇看起来丰润柔亮，拥有独特的唇景，也是安全的丰胸产品的必备原料。[0003]经典的固相多肽合成方法合成GHK原材料价格贵、成本高、产率低，不适合规模化生产，同时经典常规的C18反相色谱纯化方法中，GHK极性大而不保留，造成经典的C18反相色谱纯化方法难以达到纯化目的。发明内容[0004]本发明所要解决的技术问题在于克服现有C18反相色谱纯化方法中，GHK极性大而不保留，造成经典的C18反相色谱纯化方法难以达到纯化目的的缺点，提供一种成本低、效率高、简单易行、易规模化生产的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法。[0005]解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：[0006]1、溶样[0007]将合成的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品加入甲醇与乙醇体积比为2:8〜4:6的混合液中，超声分散后用滤膜过滤，收集滤液。[0008]2、纯化[0009]采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为层析硅胶，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15%平衡后，用流动相B:15%累加进样，每隔2〜5min进样一次，每次进样量为样品总体积的13〜15,样品全部进完后进行梯度洗脱，收集纯化后的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H溶液，减压浓缩，得到纯度95%以上的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H〇[0010]3、脱保护[0011]将纯度95%以上的此〇-〇17-把3〇〇-1^3出〇：-〇11加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3〜4小时，减压浓缩，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤，旋转蒸发，冻干，得到纯度95%以上的GHK三肽。[0012]上述溶样步骤丨中，优选将合成的Boc-Gly-HisTrt—LysBoc-0H粗品加入甲醇与无水乙醇体积比为2:8〜4:6的混合液中，超声分散后用〇.45um有机滤膜过滤。[0013]上述纯化步骤2中，按照步骤1中B〇c-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品的质量加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液，优选Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH粗品与所述混合液的质量-体积比为1g:10〜20mL。LOOM」上述纯化步骤2中，所述色谱柱填料为粒径200〜300目的层析硅胶;洗脱梯度为：流动相B15%〜17%20〜60min、40%〜85%30〜70min、75%〜85%恒流，优选洗脱梯度为:流动相B15%20min、40%〜75%60min、75%恒流;色谱的检测波长为200〜240nm;样品流速为20〜50mLmin。[0015]本发明的b〇c-Gly-HisTrt-LysBoc-〇H粗品是以Boc-Gly-0H、H-HisTrt-0H、H-LysBoc-OH、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺为原料，用液相合成方法首先合成Boc-Gly-OSu，Boc-Gly-〇Su与H-HisTrt-0H形成二肽Boc-Gly-HisTrt-0H后，再与HOSu形成活泼脂Boc-Gly-HisTrt-OSu，最后与H-LysBoc-OH反应制备而成。[0016]本发明先用正相高效液相色谱纯化Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH粗品后，再脱除保j户基，利用GHK三肽极性大的特性而有效除去保护基及使用的有机溶剂残留，从而达到GHK三肽的纯化目的。该方法得到的GHK三肽的纯度可达95%以上，而且脱保护并不影响正相色谱纯化Boc~Gly-HisTrt-LysBoc-0H后的纯度，解决了反相色谱法纯化GHK三肽时，GHKH肽在反相色谱柱中极性大不保留的问题，而且正相色谱中采用累加进样分离法，可以提高有效柱容量，节省大量时间和消耗，可达到成本低、收率高、效率高、简单易行、规模产业化生产的要求。附图说明[0017]图1是实施例2纯化后的GHK三肽质谱图。[0018]图2是实施例2纯化后的GHK三肽色谱图。具体实施方式[0019]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。[0020]实施例1[0021]1、溶样[0022]称取1gBoc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H，用60mL甲醇与无水乙醇体积比为2:8的混合洛液溶解，待溶液芫全澄清，用〇.45um有机滤膜过滤，收集滤液。[0023]2、纯化[0024]采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200〜300目的层析硅胶，柱子规格为4cmX20cm，填装体积为70mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:17%平衡后，用流动相B:l7%累加进样，每隔2min进样一次，每次进样量为样品总体积的14,样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为:流动相b17%20min、45%〜85%70min、85%恒流，样品流速为20mLmin，检测波长为200nm。收集纯化后的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H溶液，在40°C减压浓缩，得到纯度95•5%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H〇[0025]3、脱保护[0026]将纯度95.5%的Boc-Gly-HisTrt-Lys®oc-OH加入l5mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度95.6%的GHK三肽0•531g，收率61%。[0027]实施例2[0028]1、溶样[0029]称取lgBoc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品，用60mL甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用〇.45um有机滤膜过滤，收集滤液。[0030]2、纯化[0031]采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200〜300目的层析硅胶，柱子规格为4cmX20cm，填装体积为70mL，流动相A为正己院，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15%平衡后，用流动相B:15%累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的13,样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为:流动相B15%20min、40%〜75%6〇111111、75%恒流，样品流速为3〇11117111111，检测波长为21511111。收集纯化后的8〇£；-617-HisTrt-LysBoc-0H溶液，在40°C减压浓缩，得到纯度98.2%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH〇[0032]3、脱保护[0033]将纯度98.5%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH加入15mL三氟乙酸与二氯甲焼的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到GHK三肽0.592g，收率68%。[0034]发明人采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1。由图1可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与GHK三肽的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为GHK三肽。采用液相色谱仪对得到的产物的纯度进行测定，分析条件为：色谱柱C185wn250X4•6mm，流速0•8mLmin，检测波长215nm，流动相A:体积浓度0•1%的三氟乙酸水溶液，流动相B:体积浓度0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，洗脱条件:流动相B1%恒流15min，分析结果见图2。由图2可见，所制备的GHK三肽的出峰时间约为6•2分钟，纯度为98.5%。[0035]实施例3[0036]1、溶样[0037]称取lgBoc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品，用60mL甲醇与无水乙醇体积比为4:6的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45mi有机滤膜过滤，收集滤液。[0038]2、纯化[0039]采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200〜300目的层析硅胶，柱子规格为4cmX20cm，填装体积为70mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:16%平衡后，用流动相B:16%累加进样，每隔4min进样一次，每次进样量为样品总体积的15，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为:流动相B16%20min、50%〜80%60min、80%恒流，样品流速为50mLmin，检测波长为240mn。收集纯化后的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H溶液，在40°C减压浓缩，得到纯度95.8%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH。[0040]3、脱保护[0041]将纯度95.8%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH加入15mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度96.2%的GHK三肽0.556g，收率64%。[0042]实施例4[0043]1、溶样[0044]称取5gBoc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品，用60ml甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用〇.45um有机滤膜过滤，收集滤液备用。[0045]2、纯化[0046]采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径2〇〇-3〇〇目的层析硅胶，柱子规格为5cmX40cm，填装体积为300mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15%平衡后，用流动相B:15%累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的13,样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为:流动相B15%20min、40%〜75%6〇111；[11、75%丨旦流，样品流速为30‘111；1_11，检测波长为21511111。收集纯化后的80：-617-HisTrt-LysBoc-0H溶液，在4TC减压浓缩，得到纯度98.1%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H0[0047]3、脱保护[0048]将纯度98.1%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH加入75mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.3%的GHK三肽2.6g，收率60%。[0049]实施例5[0050]1、溶样[0051]称取50gBoc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品，用100mL甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用〇.45um有机滤膜过滤，收集滤液备用。[0052]2、纯化[0053]采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200-300目的层析硅胶，柱子规格为5cmX40cm，填装体积为300mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:l5%平衡后，用流动相B:15%累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的I3,样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为:流动相B15%20min、40%〜75%3〇111；[11、75%丨旦流，样品流速为301111^111；[11，检测波长为21511111。收集纯化后的80；-617-HisTrt-LysBoc-0H溶液，在40°C减压浓缩，得到纯度98.0%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H0[0054]3、脱保护[0055]将纯度98•0%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH加入75〇mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.1%的GHK三肽28.7g，收率66%。[0056]实施例6[0057]1、溶样[0058]称取150gBoc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品，用150mL甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用〇•45wii有机滤膜过滤，收集滤液备用。[0059]2、纯化[0060]采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径2〇0-300目的层析硅胶，柱子规格为1〇cmX50cm，填装体积为2500mL，流动相A为正己焼，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:l5%平衡后，用流动相B:l5%累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的13，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相b15%60min、40%〜75%6〇1111]1、75%恒流，样品流速为5〇11117111；111，检测波长为21511111。收集纯化后的8〇3-Gly-HisTrt-LysBoc-0H溶液，在40°C减压浓缩，得到纯度97.8%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H〇[0061]3、脱保护[0062]将纯度97.8%的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH加入2250mL三氟乙酸与二氯甲焼的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.〇%的GHK三肽81.〇g，收率62%。

权利要求：1.一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：⑴溶样将合成的Boc-G1y-HisTrt-LysBoc-0H粗品加入甲醇与乙醇体积比为2:8〜4:6的混合液中，超声分散后用滤膜过滤，收集滤液；⑵纯化采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为层析硅胶，流动相々为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15%平衡后，用流动相B:15%累加进样，每隔2〜5min进样一次，每次进样量为样品总体积的13〜15，样品全部进完后进行梯度洗脱，收集纯化后的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H溶液，减压浓缩，得到纯度95%以上的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH；⑶脱保护将纯度95%以上的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-OH加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3〜4小时，减压浓缩，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤，旋转蒸发，冻干，得到纯度95%以上的GHK三肽。2.根据权利要求1所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在溶样步骤⑴中，将合成的Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品加入甲醇与无水乙醇体积比为2:8〜4:6的混合液中，超声分散后用〇•45mi有机滤膜过滤，收集滤液。3.根据权利要求1所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在纯化步骤⑵中，按照步骤⑴中Boc-Gly-HisTrt-LysBoc-0H粗品的质量加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液，Boc-Gly-HisTrt_LysB〇c_〇H粗品与所述混合液的质量―体积比为lg:10〜20mL。4.根据权利要求2所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在纯化步骤2中，所述色谱柱填料为粒径200〜300目的层析桂胶。5.根据权利要求2所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在纯化步骤⑵中，所述洗脱梯度为:流动相B15%〜17%20〜60min、40%〜85%30〜70min、75%〜85%恒流。6.根据权利要求5所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在纯化步骤⑵中，所述洗脱梯度为:流动相B15%2〇1^11、40%〜75%6〇111111、75%恒流。7.根据权利要求2所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在纯化步骤2中，色谱的检测波长为200〜240nm。8.根据权利要求2所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在纯化步骤⑵中，样品流速为20〜50mLmin。

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