申请/专利权人：四川澄华生物科技有限公司

申请日：2021-06-30

公开（公告）日：2021-09-21

公开（公告）号：CN113416684A

主分类号：C12N1/21(20060101)

分类号：C12N1/21(20060101);C12N9/04(20060101);C12N9/96(20060101);C12P33/02(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.03.29#授权;2021.10.12#实质审查的生效;2021.09.21#公开

摘要：本发明公开一种高效率生产12‑酮基胆酸的方法，包括以下步骤，（1）种子培养；（2）扩大培养：将步骤（1）所得摇瓶种子接种到发酵罐的液体培养基中进行发酵罐发酵，此过程包括第一阶段和第二阶段，第一阶段进行增殖发酵；第一阶段完成后进行第二阶段发酵，流加诱导物质溶液，同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水，并设置通气比为0.8‑1.2，保持溶氧为15‑25%，温度为25℃；（3）催化转化。本发明步骤（2）中，添加了吡格列酮作为氧化酶活化激动剂，显著提高12α‑羟基类固醇脱氢酶的酶活水平，最高可达1500~1700UmL，前体物质的投入量从20gL直接提高到300gL，大幅提高前体物质的投料量，提高了生产效率。

主权项：1.一种高效率生产12-酮基胆酸制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）种子培养：将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种接种到摇瓶的液体培养基摇瓶中，保持温度37℃，40-60RH％，220rpm的摇床中培养8-12h，得到摇瓶种子；（2）扩大培养：将步骤（1）所得摇瓶种子接种到发酵罐的液体培养基中进行发酵罐发酵，此过程包括第一阶段和第二阶段，第一阶段进行增殖发酵，设置通气比0.8，保持第一阶段的发酵液溶氧大于50%，且保持发酵温度为37℃，增殖发酵时间为四个小时内；第一阶段完成后进行第二阶段发酵，流加诱导物质溶液，同时流加吡格列酮甲醇溶液和氨水，并设置通气比为0.8-1.2，保持溶氧为15-25%，温度为25℃，所述诱导物质溶液中，按质量百分比包含乳酸0.1％、乳糖5％、甘油2％和消泡剂0.05％，以及0.01mmolL的IPTG；（3）催化转化：当培养菌菌体密度OD600大于25且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶活大于25UmL时，向发酵液中流加辅助物质溶液，一段时间后开始流加前体物质溶液，设置通气比为0.8-1.2，保持溶氧为30-50%，且保持发酵温度为25℃，pH8.2-8.5；所述前体物质溶液为40%胆酸和等胆酸摩尔当量的氢氧化钠，余量为水；所述辅助物质溶液包括浓度为0.01倍胆酸摩尔当量的核黄素和pH11的氢氧化钠溶液，余量为水；前体物质溶液和辅助物质溶液流加完毕1h后，开始间隙检测胆酸浓度，当胆酸浓度为小于等于0.3％时，结束培养。

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