申请/专利权人：中国医学科学院北京协和医院

申请日：2017-12-21

公开（公告）日：2021-10-12

公开（公告）号：CN108129558B

主分类号：C07K14/415(20060101)

分类号：C07K14/415(20060101);C07K1/18(20060101);C07K1/16(20060101);C07K1/14(20060101);C07K1/36(20060101);A61K38/16(20060101);A61P37/08(20060101);G01N33/68(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.10.12#授权;2018.07.03#实质审查的生效;2018.06.08#公开

摘要：本发明提供了一种桦树花粉主要致敏蛋白Betv8的提取和分离纯化方法及应用。所述Betv8的提取方法包括使用pH4.5的醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉致敏蛋白进行提取，所述的分离纯化方法包括先制备桦树花粉水溶蛋白提取液，随后通过阳离子交换层析和ConA琼脂糖凝胶4B层析进一步分离纯化，最终获得纯化的主要致敏蛋白Betv8。本发明所制备的提取液或纯化蛋白可用于患者血清样品中主要致敏蛋白的检测，同时还可进一步制备成过敏原检测试剂或脱敏制剂，在提高桦树花粉的皮试阳性率及脱敏疗效方面具有广泛应用。

主权项：1.一种桦树花粉主要致敏蛋白Betv8的提取方法，其特征在于，所述方法包括使用pH为4.5的醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉致敏蛋白进行提取。

全文数据：一种桦树花粉主要致敏蛋白Betv8的提取和分离纯化方法及应用技术领域[0001]本发明涉及蛋白的分离纯化方法及应用，具体涉及桦树花粉主要致敏蛋白Betv8的分离纯化方法及应用。背景技术[0002]过敏是由机体对通常无害的大分子如蛋白质物质的免疫反应所引起的。工业化国家中超过25%的人口患有I型过敏并且数量增在稳定增加，桦树花粉症是I型过敏反应的非常常见的形式。在中国，桦树花粉是北方地区春季主要致敏花粉之一叶世泰，中国气候致敏花粉调查，1991。[0003]目前已命名的桦树花粉致敏蛋白有7种，分别为Betvl、Betv2、Betv3、Betv4、Betv6、Betv7、Betv8,其中Betv1是桦树花粉的主要过敏蛋白，在不同地区的人群中，Betv1可以被62-98%桦树过敏患者血清所识别（MoverareRetal，IntArchAllergyImmunol,2002,1284:325-35；SekerkovaAetal,IntArchAllergyImmunol,2011,1544:278-85,更多关于Betv1过敏原、其异构过敏原和变体的信息，详见于www•al1ergenorg〇[0004]然而，自Ipsen等从桦树花粉中分离出分子量为17kDa的主要致敏蛋白Betv1以来，对于桦树花粉过敏蛋白的研究，也主要集中Betv1上，有关其基因编码序列、氨基酸序列、蛋白质三维结构以及与各种同源变应原间的交叉反应性现已有大量文献报道。但是，对于桦树花粉中其他的主要致敏蛋白的鉴定和分离纯化，现有技术中并未给出具体报道。发明内容[0005]本发明的主要目的是鉴定了桦树花粉中另一主要致敏蛋白Betv8,并提供了针对上述Betv8蛋白的提取和分离纯化方法。[0006]本发明中BetV8蛋白的提取方法，其特征在于，包括以pH为4.5的醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉Betv8蛋白进行提取;优选地，所述醋酸盐缓冲液为醋酸钠。[0007]本发明中Betv8蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包含了以下步骤：[0008]1桦树花粉水溶蛋白提取液的制备；[0009]2阳离子交换层析，包括将上述步骤1所制备的桦树花粉水溶蛋白提取液上样之后，首先使用结合缓冲液进行冲洗，随后固定结合缓冲液并逐渐增加洗脱缓冲液的浓度进行洗脱，收集洗脱液第1个洗脱峰;其中结合缓冲液为pH为4.5的醋酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为pH为4•5的醋酸钠缓冲液和NaCl溶液。[0010]3ConA琼脂糖凝胶4B层析，包括将上述步骤2制备的含有目的蛋白的洗脱液上样之后，先使用结合缓冲液冲洗柱子，随后使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液第1个洗脱峰；其中结合缓冲液的成分为TrisHC1，NaCl，MnCl2，CaCl2，pH7.4;洗脱缓冲液的成分为：甲基-a-D-卩比喃葡糖苷，Tris-HCl，NaCl，pH7.4。[0011]进一步的，本发明中涉及的桦树花粉水溶蛋白提取液的制备可以采用本领域常规的方法进行提取，优选地，本发明使用pH为4•5醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉水溶蛋白进行提取。[0012]进一步的，本发明中涉及的阳离子交换层析具体步骤为:包括先使用lOmM结合缓冲液平衡柱子，然后将所制备的花粉水溶蛋白提取液浓缩之后进行上样，继续使用上述结合缓冲液冲洗约20mL，随后固定结合缓冲液，逐渐增加洗脱缓冲液的浓度至5〇%，冲洗三个柱体积，同时收集洗脱液第1个洗脱峰;其中结合缓冲液为pH为4.5的20mM醋酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为pH为4.5的20mM醋酸钠缓冲液和1MNaCl溶液。[0013]进一步的，本发明中涉及的ConA琼脂糖凝胶4B层析具体步骤为:先用5mL结合缓冲液平衡柱子，将阳离子交换层析收集的洗脱液浓缩之后上样，然后使用5mL结合缓冲液冲洗柱子，最后用洗脱缓冲液洗脱柱子，收集洗脱液第1个洗脱峰;其中，结合缓冲液为:20raMTrisHC1，0_5MNaCl，lmMMnCl2，lniMCaCl2，pH7.4;洗脱缓冲液为:0.1M甲基-a-D-吡喃葡糖苷，20mMTris_HCl，0.5MNaCl，pH7.4。[0014]更进一步的，本发明的主要致敏蛋白Betv8分离纯化方法中，还包含了对所述Betv8蛋白鉴定步骤，优选地，通过SDS-PAGE、等电聚焦电泳或免疫印迹鉴定所述Betv8蛋白。[0015]本发明还提供了一种过敏原体外检测方法，包括使用上述Betv8蛋白提取液或分离纯化的Betv8蛋白对血清样品进行检测。[0016]本发明还提供了将上述Betv8蛋白在制备过敏原检测试剂中的应用，优选地，过敏原检测试剂为过敏原皮试液。[0017]本发明还提供了将上述Betv8蛋白在制备脱敏试剂中的应用。[0018]本发明的有益效果：[0019]1以桦树花粉水溶蛋白为底物，通过免疫印迹方法对桦树花粉症患者血清进行分析，首次发现一条分子量约为70kDa的蛋白与血清IgE阳性反应率高达51%，符合主要致敏蛋白定义标准。[0020]2本发明提供的主要致敏蛋白的分离纯化方法，通过改良花粉蛋白提取液成分，可以显著提高天然桦树花粉粗提液中主要致敏蛋白Betv8的含量，然后通过阳离子交换层析及ConA琼脂糖凝胶4B层析首次对桦树花粉粗提液中目的蛋白进行分离纯化。[0021]3目前临床中使用的过敏原体外检测方法一ImmonoCAP中并不包含Betv8,本发明首次发现其较高的IgE阳性反应率，有助于将该蛋白的粗提液或纯化蛋白应用于制备过敏原皮试液或脱敏制剂，可提高桦树花粉的皮试阳性率及脱敏疗效。此外，纯化的Betv8蛋白还有望开发成体外检测试剂。附图说明[0022]图1•两种提取方法中桦树花粉粗提液中主要致敏蛋白（约7〇kDa含量对比。其中，L1:以磷酸盐缓冲液pH7.5作为提取液;L2:以醋酸盐缓冲液pH4.5作为提取液。[0023]图2•桦树花粉粗提液免疫印迹结果。其中，图2a、图2b、图2c分别为使用不同桦树花粉症症患者血清L1至L41为不同血清样品）进行免疫印迹的结果，底物均为以醋酸盐缓冲液提取的桦树花粉粗提液。[0024]图3.阳离子交换层析结果。箭头所指为含目的蛋白的收集峰;M:蛋白markenLl-12:2-13号收集液，其中4-10号收集液SDS-PAGE可见明显70kDa蛋白条带即目的蛋白）。[0025]图4.HiTrap™ConA4B层析的分离结果。箭头所指为含目的蛋白的收集峰;M:蛋白marker;flow:未收集的洗脱液；1-14为1-14号收集液，其中5-14号收集液SDS-PAGE可见提纯的70kDa蛋白条带（即目的蛋白）。[0026]图5.纯化蛋白免疫印迹及抑制实验。L1-2:阳离子交换层析中富含70kDa蛋白的洗脱液SDS-PAGE;L3-4:HiTrap™ConA琼脂糖凝胶4B洗脱液SDS-PAGE;L5:以纯化蛋白为底物，桦树花粉过敏患者血清为一抗图2中L29所用血清进行免疫印迹;L6:以桦树花粉粗提液为底物，桦树花粉过敏患者血清为一抗进行免疫印迹;L7:以桦树花粉粗提液为底物，桦树花粉过敏患者血清为一抗，分离纯化蛋白为抑制物，进行免疫印迹抑制实验，纯化后的蛋白可部分抑制70kDa条带与血清反应L7中70kDa条带较L6中该条带变弱）。其中横线标注部分为70kDa蛋白（即目的蛋白）。具体实施方式[0027]下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。如无特别说明，本发明中所采用的操作方法详见《基因分子生物学，JamesDWatson，第六版》。[0028]实施例1桦树花粉中富含主要致敏蛋白（约70kDa的提取[0029]1.1花粉原料[0030]中国桦树花粉为2014年4月桦树花粉季内于内蒙古赤峰白桦林采集，采集后于-80°C冷冻保存。[0031]1.2实验步骤[0032]1.2.1白桦花粉2g，溶于20mL20mM醋酸钠pH4.5中，加入250UL复合蛋白酶抑制剂，祸旋振荡1分钟，4°C振荡过夜;在4°C下，6000g离心花粉混悬液30分钟，留上清，用0.2wn滤器过滤上清，3kDaMil1ipore超滤管浓缩至5mU-20°C保存。[0033]1.2.2使用BCA试剂盒检测桦树花粉蛋白提取液中蛋白浓度[0034]将BCA试剂盒中的试剂A与试剂B按50:1的比例混合，配成BCA工作液。取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测样品各25uL，加入到96孔板中，之后每孔加入200uLBCA工作液，轻轻水平震荡，使之混匀。将96孔板密封，37°C温箱中孵育30分钟。使用酶标伩测量样品在562nm处的吸光值。将标准品和待测样品的0D562值减去空白标准品的0D562值，用标准品0D562对其浓度UgmL绘制标准曲线，得到方程和线性相关系数，带入待测样品0½62即可计算其蛋白浓度。[0035]1.2.3与常规桦树花粉主要致敏蛋白提取方法比较[0036]目前我们常用的花粉水溶蛋白提取缓冲液为pH为7•5的磷酸盐缓冲液，将上述步骤1.2.1中的醋酸钠缓冲液替换为磷酸盐缓冲液pH7_5，其他步骤相同，通过SDS-PAGE对比两种不同提取方法中主要致敏蛋白的含量。[0037]1.3结果[0038]两种提取方法中桦树粗提液中主要致敏蛋白含量对比见图1，使用传统的磷酸盐缓冲液pH7.5进行提取时，粗提液中Betv1含量最高（l7kDa，而另一主要致敏蛋白Betv8,约70kDa较少条带1，而本发明通过调整提取缓冲液的成分及酸碱度，利用醋酸盐缓冲液pH4.5作为提取液进行提取，粗提液中不仅包含了较高的Betv117kDa，还可以显著提高主要致敏蛋白Betv8的含量条带2。[0039]实施例2桦树花粉水溶蛋白免疫印迹Westernblot[0040]2.1以醋酸盐缓冲液提取的桦树花粉蛋白粗提液实施例1中1•2.1步骤制备的粗提液进行SDS-PAGE电泳:操作同前。电泳结束后，装配转膜“三明治”，顺序依次为负极一2层滤纸一分离胶一尼龙膜一2层滤纸一正极，以半干转膜法将蛋白从凝胶中转移至尼龙膜上。转膜缓冲液为250mMTrispure，1.92M甘氨酸。使用丽春红S对尼龙膜进行染色，根据染色结果，将尼龙膜切条并编号，以用于与不同血清孵育。将尼龙膜切条放入孵育盒中，加入封闭液，置于侧摆摇床上，室温封闭1小时。封闭液为5%的牛奶。封闭结束后，用TBST洗涤切条3次。将桦树花粉症患者及健康对照血清按1:10稀释，切条分别置于孵育槽内，每槽加入lml稀释血清。封闭孵育槽，置于侧摆摇床上，4°C过夜。后使用TBST洗涤切条3次。1:1000稀释HRP标记的羊抗人IgE抗体，每槽胶入lml稀释二抗，置于侧摆摇床上，室温孵育1小时。后使用TBST洗涤切条3次。ECL显色。[0041]2.2结果[0042]桦树花粉粗提液免疫印迹结果见图2,其中L1-L41为不同血清样品免疫印迹结果。使用醋酸盐缓冲液提取的桦树花粉粗提液在41份桦树花粉症患者血清中进行免疫印迹分析，结果显示58.5%n=24的血清可以与Betvl17kDa条带结合，51.2%n=21的血清可以与70kDa蛋白结合，70kDa蛋白的血清识别率已达到定义主要致敏蛋白的标准。[0043]实施例3阳离子交换层析[0044]3.1溶液配制[0045]3.1.ICationA:20mM酉昔酸钠，pH4.5,0.2iim滤纸过滤溶液，室温保存。[0046]3.1.2CationB:20mM醋酸钠、1MNaCl，pH4.5,0.2iim滤纸过滤溶液，室温保存。[0047]3.2蛋白样品制备:使用3kDaMi11ipore超滤管将实施例1中步骤1.2.1制备的桦树花粉粗提液进行3倍浓缩，备用。[0048]3.3装柱:使用前将柱子用Milli-Q7_K清洗。装配柱子，将其固定于三脚架上，并连接到蠕动泵上。首先用Milli-Q水清洗所有管路，并同时检查是否有渗漏，之后，向柱子中加入13体积的Milli-Q水，再倒入约3mL阳离子交换剂SP-sepherose，使柱子加满。[0049]3.4上样、洗脱和收集:首先用Milli-Q水清洗系统栗，然后将装配好的柱子连接到AKTAFPLC仪器上，再清洗样品泵。然后用l〇mlCation-A平衡柱子。通过样品泵上样，继续使用Cation-A冲洗约20ml。固定Cation-A，逐渐增加Cation-B浓度至50%。冲洗3个柱体积。同时收集洗脱液。根据收集峰选择不同洗脱液进行SDS-PAGE电泳以分析蛋白分离效果。[0050]3.5结果[0051]阳离子交换层析及SDS-PAGE电泳结果见图3,其中箭头所指为含目的蛋白的收集峰;选择2-13号收集液进行SDS-PAGE分析，其中4-10号收集液SDS-PAGE可见明显70kDa蛋白条带即目的蛋白）。[0052]实施例4HiTrap™ConA琼脂糖凝胶狃层析[0053]4.1溶液配制:按照预装柱操作说明配制相应溶液，具体如下：[0054]4.1.IBindingbuffer:20mMTrisHC1，0•5MNaCl，ImMMnCl2，ImMCaCl2，pH7.4。[0055]4.l.2Elutionbuffer:0.1M甲基-a-D-吡喃葡糖苷，20mMTris-HC1，0.5MNaCl，pH7.4〇[0056]4.2样品准备:将经阳离子交换层析分离得到的含有目的蛋白的洗脱液混合到一起，使用lOOODa透析袋透析I2小时，期间数次更换Bindingbuffer，以平衡样品。使用10kDa超滤管将其5倍浓缩。[0057]4.3上样、洗脱和收集:首先分别用Milli-Q水清洗系统泵，将预装的凝胶过滤柱安装到AKTAFPLC仪器上。然后分别用Milli-Q水冲洗柱子，后使用5mlBindingbuffer平衡柱子。通过样品栗上样。使用SmlBindingbuffer冲洗柱子，后Elutionbuffer洗脱柱子，收集洗脱液。根据收集峰，将可能还有目的条带的洗脱液进行SDS-PAGE电泳及等电聚焦电泳。[0058]4.4结果[0059]HiTrap™ConA琼脂糖凝胶4B层析及SDS-PAGE结果见图4,其中箭头所指为含目的蛋白的收集峰;M:蛋白marker;flow:未收集的洗脱液；1-14为1-14号收集液，其中5-14号收集液SDS-PAGE可见提纯的70kDa蛋白条带即目的蛋白）[0060]实施例5免疫印迹抑制实验[0061]本发明还通过免疫印迹抑制实验进一步验证所分离纯化得到的蛋白与实施例2中被桦树患者血清识别的蛋白为相同蛋白。[0062]主要实验步骤同实施例2的免疫印迹，唯一不同之处为患者血清预先分别与实施例4中所得到的分离纯化的蛋白室温条件下孵育1小时，抑制物浓度为100ygmL。[0063]免疫印迹抑制实验结果如图5所示，从图5可以看出，桦树花粉提取液经离子交换层析纯化后，洗脱液中可以获得一条富含7〇kDa的蛋白条带LI、L2;该洗脱液再经HiTrap™ConA琼脂糖凝胶4B层析分离纯化，洗脱液中可获得单一目的蛋白条带L3、L4，且该纯化蛋白可以与桦树花粉过敏患者血清特异性结合L5，以及可以竞争性的抑制桦树花粉中70kDa的蛋白与上述血清反应L6、L7，提示二者为相同的蛋白。[0064]实施例6等电聚焦电泳及免疫印迹[0065]6.1溶液配制[0066]6.1.1IEF样品缓冲液:7M尿素，2M硫脲，2%CHAPS，0.5%IPGbufferpH3-7,溴酚蓝0.002%，65111]\101'1'。[0067]6•1.2SDS-PAGE平衡缓冲液：50mMTris-HClpH8•8，6M尿素，2%SDS，30%甘油，0•0002%溴酚蓝，加Mi11i-Q水定容至400ml。将储存液平均为两份，分别为平衡缓冲液I和II。平衡缓冲液I使用前加入65mMDTT，现用现配。平衡缓冲液n内加入5g碘乙醇胺（25mgmL。然后分装-20°C保存。[0068]6.1.3琼脂糖封闭液:称取0.2如琼脂糖，加入100此溴酚蓝浓缩液，溶于501111305-PAGE电泳缓冲液中，加热溶解，冷却至60°C左右时，分装，室温保存。[0069]6.2第二向凝胶制备:制备SDS-PAGE凝胶分离胶，选择1.5厘米厚度的玻璃板，分离胶灌注后使剩余板高约为0.8厘米左右，用于放置IPG胶条。不需要灌注浓缩胶和插入梳子。[0070]6_3等电聚焦样品制备:将HiTrap™ConA4B分离得到的含有目的蛋白的洗脱液使用lOOODa透析袋进行透析，期间多次更换Mi11i-Q水，以充分除盐。BCA测定洗脱液中蛋白浓度。根据蛋白浓度计算出150mg蛋白对应提取液体积，加入3倍体积-20。：预冷的丙酮以沉淀蛋白，并可起到除盐作用，-2TC放置3小时。取出后，15000g，4°C离心30分钟，此时可见蛋白沉淀与管底。弃丙酮，用50yL95%的丙酮洗涤沉淀3次，置于通风橱内，待丙酮挥发完全。将冻存的IEF上样缓冲液室温下解冻，此时加入1MDTT65ulmL。用125uLIEF上样缓冲液将蛋白沉淀重悬，随后放入加热震荡器中，22°C，中速震荡，15分钟。10000g离心样品5分钟。[0071]6.4上样和第一向电泳[0072]6.4_1将-2〇1保存的1?6预制胶条阳-10室温条件下放置1〇分钟。移液器将样品加至等电聚焦槽中央。用镊子取下IPG预制胶条的保护膜，胶面向下，先将正极端放入胶槽内，轻轻下压，最后是负极端也置于等电聚焦槽内。在胶条上方缓慢滴加400ULDryStrip。盖好胶槽盖子，将其放入等电聚焦电泳仪中。[0073]6•4•2设置电泳参数:温度一19°C，最大电流一0•05mA条，胶条长度一7厘米，30V13小时，200V1小时，500V1小时，500至8000V30分钟，8000V2小时。[0074]6.5平衡胶条:取出_20°C保存的平衡缓冲液I和II，室温下溶解。向平衡缓冲液I中加入65mMDTT。当第1向电泳结束后，取出胶条，放入UmL离心管中，加入5mL平衡缓冲液I中，室温滚动震荡仪上平衡15分钟。然后放入含有5mL平衡缓冲液ni5mL离心管中，室温滚动荡仪上平衡15分钟。[0075]6•6将琼脂糖密封液加热溶解。胶条平衡完毕后，在Mi11i-Q水中快速洗涤1-2秒，置于在滤纸上，以去除多余液体。用镊子将胶条放入SDS-PAGE凝胶上表面，将5此蛋白Marker加到滤纸上，将滤纸片沿一端插入玻璃板间。随后用移液器将已融化的琼脂糖密封液加到胶条表面。待琼脂糖凝固后，向电泳槽内加入适量电泳缓冲液，开始电泳。初始电压设置为80V，当溴酚蓝染料向下移动1厘米左右时，将电压调至150V。大约50分钟左右，电泳结束。[0076]6•7免疫印迹:等电聚焦后取下凝胶，进行免疫印迹，方法同前。使用桦树花粉症患者血清检测分离蛋白是否为目的蛋白。[0077]6.8经免疫印迹实验进一步验证，本发明经离子交换层系和凝胶过滤层析分离获得的分子量单一的蛋白条带，为具有IgE阳性的目的蛋白。

权利要求：1.一种桦树花粉主要致敏蛋白Betv8的提取方法，其特征在于，所述方法包括使用pH为4.5的醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉致敏蛋白进行提取。2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述醋酸盐缓冲液为醋酸钠。3.—种桦树花粉主要致敏蛋白Betv8的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1桦树花粉水溶蛋白提取液的制备；2阳离子交换层析，包括将上述步骤1所制备的桦树花粉水溶蛋白提取液上样之后，首先使用结合缓冲液进行冲洗，随后固定结合缓冲液并逐渐增加洗脱缓冲液的浓度进行洗脱，收集洗脱液;其中结合缓冲液为pH为4.5的醋酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为pH为4•5的醋酸钠缓冲液和NaCl溶液。3ConA琼脂糖凝胶4B层析，包括将上述步骤2制备的含有目的蛋白的洗脱液上样之后，先使用结合缓冲液冲洗柱子，随后使用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液;其中结合缓冲液的成分为TrisHCl，NaCl，MnCl2，CaCl2，pH7.4;洗脱缓冲液的成分为：甲基-〇-0-吡喃葡糖苷，Tris-HCl，NaCl，pH7.4。4.如权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1中使用pH为4.5的20mM醋酸盐缓冲液作为提取液对桦树花粉水溶蛋白进行提取；所述步骤2中阳离子交换层析具体操作为先使用10mM结合缓冲液平衡柱子，然后将所制备的花粉水溶蛋白提取液浓缩之后进行上样，继续使用上述结合缓冲液冲洗约2〇tnL，随后固定结合缓冲液，逐渐增加洗脱缓冲液的浓度至50%，冲洗三个柱体积，同时收集洗脱液;其中结合缓冲液为pH为4.5的20mM醋酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为pH为4.5的20mM醋酸钠缓冲液和1MNaCl溶液；所述步骤3中ConA琼脂糖凝胶4B层析具体操作为先用5mL结合缓冲液平衡柱子，将阳离子交换层析收集的洗脱液浓缩之后上样，然后使用5mL结合缓冲液冲洗柱子，最后用洗脱缓冲液洗脱柱子，收集洗脱液；其中，结合缓冲液为：20tnMTrisHC1，0.5MNaCl，lraMMnCl2，lmMCaCl2,pH7.4;洗脱缓冲液为：0.1M甲基-a-D-吡喃葡糖苷，20mMTris-HC1，0.5MNaCl，pH7.4〇5.利用权利要求1或2所述的提取方法制备的桦树花粉主要致敏蛋白Betv8提取液。6.利用权利要求3或4所述的分离纯化方法制备的桦树花粉主要致敏蛋白Betv8。7.—种过敏原体外检测方法，包括使用权利要求5所述的主要致敏蛋白Betv8提取液或权利要求6所述的主要致敏蛋白Betv8对血清样品进行检测。8.权利要求5所述的主要致敏蛋白Betv8提取液或权利要求6所述的主要致敏蛋白Betv8在制备过敏原检测试剂中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述过敏原检测试剂为过敏原皮试液。10.权利要求6所述的主要致敏蛋白Betv8在制备脱敏试剂中的应用。

百度查询： 中国医学科学院北京协和医院 一种桦树花粉主要致敏蛋白Bet v 8的提取和分离纯化方法及应用

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