申请/专利权人：中国辐射防护研究院

申请日：2016-08-22

公开（公告）日：2021-10-22

公开（公告）号：CN107760775B

主分类号：C12Q1/6883(20180101)

分类号：C12Q1/6883(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.10.22#授权;2018.12.07#实质审查的生效;2018.03.06#公开

摘要：本发明属于基因分子标记物的应用领域，涉及APOL6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂中的用途。将所述的APOL6基因作为分子标记物用于重离子辐射暴露检测，可更加便捷、准确，并可确定辐射剂量。

主权项：1.APOL6基因作为分子标记物在制备用于人淋巴细胞重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途，其中所述的重离子为12C6+离子，重离子辐射剂量为0.1-2.0Gy，所述的试剂试剂组包括用于PCR检测的全部必需试剂，用于PCR检测的全部必需试剂包括如下序列的引物：F：5’-GCAAGGACAGAGGTTCAGGAT-3’，R：5’-AGCCTCTGTGGCAGCAAAT-3’。

全文数据：AP0L6基因作为重离子辐射暴露诊断的分子标记物的用途技术领域[0001]本发明一般的涉及分子标记物在制备用于疾病或健康状况诊断的试剂中的用途，特别的涉及分子标记物在制备用于辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途。背景技术[0002]电离辐射是指可以引起物质发生电离的辐射。重离子是一种致密型高传能线密度的电离辐射，会对人体造成较为严重的损伤。在细胞水平，重离子辐射损伤主要包括细胞的存活率下降、细胞周期阻滞、染色体畸变等。针对重离子辐射对人体造成的损伤，现有的检测方法主要包括MTT比色法，流式细胞术以及染色体、微核检测法，但这些方法的缺点是只能从细胞水平检测辐射损伤的程度，无法观察辐射损伤的分子机理及微观变化。[0003]应用重离子辐射后分子变化的原理选择分子标志物进行重离子辐射的诊断检测是一种能在很大程度上克服上述缺陷的有前途的重离子辐射的诊断方法，但是选择具体的检测分子分子标志物需要关注如下两个问题:一是检测分子变化的敏感性、特异性，诱导检测分子变化需要的剂量要小;二是大多数重离子辐射导致的分子损伤修复快，分子变化必须要及时反映整个辐射照射剂量。因此，较难选出全部符合上述条件的分子标志物评价早先辐射照射或低剂量率辐射照射的损伤情况。[0004]基因芯片技术是建立在杂交序列基本理论上的分子生物学技术，它以一种全面、综合和系统的思维方式研究生命现象，可以完整地研究整个细胞或器官全部基因变化，可以通过基因分析发现对重离子辐射反应差异的基因，是一种新的分子放射生物学方法。基因芯片具有可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子进行高效、快速、低成本检测和分析的优势。[0005]AP0L6基因，载脂蛋白L基因家族，属于细胞程序性死亡调控基因家族，它的蛋白可以诱导主体凋亡或者自体吞噬性死亡。在人类，载脂蛋白L基因家族由六个基因组成，位于人类22号染色体。发明内容[0006]本发明的首要目的是针对重离子辐射暴露诊断的需求，提供分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途，以更加便捷、准确，并可确定辐射剂量。[0007]为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供AP0L6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途。[0008]在一种优选的实施方案中，本发明提供AP0L6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途，其中所述的重离子为12C6+离子。[0009]在一种优选的实施方案中，本发明提供AP0L6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途，其中重离子辐射剂量为〇.I-2.OGy。[0010]在一种优选的实施方案中，本发明提供AP0L6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途，其中所述的试剂试剂组包括用于PCR检测、基因芯片检测、southern印迹杂交检测、northern印迹杂交检测或原位杂交检测的全部必需试剂。[0011]在一种优选的实施方案中，本发明提供AP0L6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途，其中所述的试剂试剂组包括用于PCR检测的全部必需试剂。[0012]一种优选的实施方案中，本发明提供AP0L6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途，其中用于PCR检测的全部必需试剂包括如下序列的引物：[0013]F:5’-GCAAGGACAGAGGTTCAGGAT-3’，[0014]R:5，-AGCCTCTGTGGCAGCAAAT-3，。[0015]本发明的另一个目的是提供用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组，以使诊断更加便捷、准确，并可确定辐射剂量。[0016]为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组，其包括用于AP0L6基因检测的全部必需试剂。[0017]在一种优选的实施方式中，本发明提供用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组，其中所述的试剂试剂组包括用于PCR检测、基因芯片检测、southern印迹杂交检测、northern印迹杂交检测或原位杂交检测的全部必需试剂。[0018]在一种优选的实施方式中，本发明提供用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组，其中所述的试剂试剂组包括用于PCR检测的全部必需试剂。[0019]在一种优选的实施方式中，本发明提供用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组，其中用于PCR检测的全部必需试剂包括如下序列的引物：[0020]F:5’-GCAAGGACAGAGGTTCAGGAT-3’，[0021]R:5，-AGCCTCTGTGGCAGCAAAT-3，。具体实施方式[0022]以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。[0023]实施例1:用于重离子辐射暴露诊断的基因分子标志物的初步筛选[0024]利用基因芯片技术，通过检测重离子辐射照射后人淋巴细胞中不同基因的差异表达，初步筛选用于重离子辐射暴露诊断的基因分子标志物。[0025]1细胞总RNA的提取、定量、质检和纯化[0026]将人淋巴细胞株经0.1、0.5、2.OGy12C6+离子辐射照射后培养24h此三组为实验组;未辐射照射为对照组）。四组细胞按照Trizol试剂提取说明书提取总RNA。分光光度计测浓度和纯度，取总RNA5g在1%甲醛-琼脂糖凝胶中电泳检验。按照QlAGENRNeasy®KitQIAGEN公司，德国）说明书纯化总RNA。[0027]2cDNA合成[0028]取0.2ygRNA于0.2ml离心管中，配置如下反应溶液：200ng总RNA5ng多聚腺苷酸polyA+RNA2.5μ1，稀释液2μ1，T7引物0.8μ1，65°C保温IOmin，冰浴5min;配置cDNA合成体系:5X第一链混合液FirstStrandBuffer2μ1，0.IM二硫苏糖醇Ιμΐ，IOmM脱氧核糖核苷酸混合液0.5以1，4€:1^11；^5^。1^口丨1?仙86131〇。1=2.0且P值〈=0.05;差异倍数值正值表示上调，负值表示下调。[0034]对差异表达基因进行分析可见，三个剂量组共同差异表达的部分基因的差异倍数与辐射照射剂量存在剂量依赖关系，部分差异倍数上调基因列于表1，其中AP0L6基因随剂量增加，差异倍数逐渐下降，并且不同剂量差异倍数的差异显著，故选取AP0L6基因进行进一步PCR验证。[0035]表1存在剂量效应的共同表达上调基因[0036][0038]实施例2:PCR验证确认AP0L6基因作为分子标记物用于重离子辐射暴露诊断的可行性[0039]按Trizol试剂提取辐射照射组和未辐射照射组细胞总RNA，紫外分光光度计测定浓度，以总RNA为模板，具体操作步骤按逆转录试剂盒说明书反转录cDNA，逆转录体系是20μ1〇[0040]取适量辐射照射组和对照组样本CDNA，对AP0L6差异表达基因进行PCR验证。其引物序列及PCR扩增条件见表2。[0041]表2RT-PCR扩增基因的引物序列及扩增条件[0043]结果分析:三个剂量组与对照组细胞相比较，共同差异表达基因有504个，其中上调基因88个，下调基因416个。并且发现部分差异表达基因的差异倍数与辐射照射剂量存在剂量响应关系，其中不同剂量AP0L6基因的差异倍数差异显著。对其进行进一步PCR验证发现:验证结果与基因芯片结果一致见表3。[0044]表3RT-PCR扩增的相对定量结果[0046]注:*P〈0.05辐射照射组与对照组相比，具有统计学意义；[0047]F=2—AAct，其中：[0048]ΔΔct=Δct待测组-Δct对照组）[0049]Δct待测组）=待测组目的基因平均Ct值-待测组看家基因平均Ct值[0050]Δct对照组）=对照组目的基因平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值。[0051]由表可见，经12C6+离子辐射照射后AP0L6基因的表达水平均较对照组上调，并且随剂量增加，差异倍数减小。因此筛选AP0L6基因作为重离子辐射暴露的分子标记物，作为受照人员健康监护的一项指标。[0052]上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

权利要求：1.AP0L6基因作为分子标记物在制备用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的重离子为12C6+离子。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于重离子辐射剂量为0.1-2.OGy。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的试剂试剂组包括用于PCR检测、基因芯片检测、southern印迹杂交检测、northern印迹杂交检测或原位杂交检测的全部必需试剂。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的试剂试剂组包括用于PCR检测的全部必需试剂。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于用于PCR检测的全部必需试剂包括如下序列的引物：F:5，-GCAAGGACAGAGGTTCAGGAT-3，，R:5，-AGCCTCTGTGGCAGCAAAT-3，。7.用于重离子辐射暴露诊断的试剂试剂组，其特征在于包括用于AP0L6基因检测的全部必需试剂。8.根据权利要求7所述的试剂试剂组，其特征在于所述的试剂试剂组包括用于PCR检测、基因芯片检测、southern印迹杂交检测、northern印迹杂交检测或原位杂交检测的全部必需试剂。9.根据权利要求7所述的试剂试剂组，其特征在于所述的试剂试剂组包括用于PCR检测的全部必需试剂。10.根据权利要求9所述的试剂试剂组，其特征在于用于PCR检测的全部必需试剂包括如下序列的引物：F:5，-GCAAGGACAGAGGTTCAGGAT-3，，R:5，-AGCCTCTGTGGCAGCAAAT-3，。

百度查询： 中国辐射防护研究院 APOL6基因作为重离子辐射暴露诊断的分子标记物的用途

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