申请/专利权人：大连民族大学

申请日：2018-08-28

公开（公告）日：2021-12-10

公开（公告）号：CN109777806B

主分类号：C12N15/29(20060101)

分类号：C12N15/29(20060101);C12N15/10(20060101);C07K14/415(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.12.10#授权;2019.06.14#实质审查的生效;2019.05.21#公开

摘要：本发明涉及紫斑牡丹IKU2基因，属于生物工程技术领域。本发明从紫斑牡丹种子不同发育时期的转录组文库中筛选得到调控种子大小的基因IKU2，为通过基因工程技术改良紫斑牡丹种子产量提供分子依据。

主权项：1.一种来源于紫斑牡丹的IKU2基因，其特征在于，IKU2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

全文数据：紫斑牡丹IKU2基因技术领域本发明属于生物工程技术领域，本发明具体涉及紫斑牡丹IKU2基因。背景技术牡丹为芍药科Paeoniaceae芍药属Oaeonia的多年生落叶小灌木。开发利用木本油料可以有效的缓解我国食用油不足的现状，2011年3月，国家卫生部监督局根据《食品安全法》的规定及新资源食品评审专家委员会审核，公开批准牡丹籽油为新资源食品，牡丹籽油被定为新型健康木本食用油。目前中国大面积示范种植的油用牡丹品种主要有适合南方气候的凤丹P.ostii和适合北方气候的紫斑牡丹P.suffruticosaAndr.var.papaveracea。但其较小的种子横径0.88±0.04cm、纵径1.00±0.07cm则制约了牡丹的高效开发和利用。紫斑牡丹具有极高的观赏价值和药用价值,它含有以高比例的不饱和脂肪酸92％以上和α-亚麻酸43％以上为特征的黑色椭圆形种子，种子油对癌症、心血管疾病、炎症和自身免疫疾病等具有明显疗效。近年来，由于牡丹籽油的价值和需求越来越大，因此解析牡丹种子大小机制和油脂合成调控机制具有重要的理论和应用价值。有文献报道，拟南芥早期胚乳和种子的大小至少受到3个基因IKU1、IKU2和MINI3调控。它们作用于同一个代谢途径，其突变体植株的胚乳数量减少且种子变小。IKU1、IKU2和MINI3突变体以隐形包子体模式在种子发育中起作用，抑制游离核时期胚乳核的增殖，导致胚乳细胞化提前发生，间接抑制胚的增殖和珠被细胞的伸长，导致种子变小[1,2]。目前，IKU2基因的功能研究仅在拟南芥等模式植物中进行了验证，在木本油料作物，尤其是紫斑牡丹中的IKU2基因功能仍未见报道。[1]MLuo,PBilodeau,ESDennis,WJPeacock.AChaudhury.Expressionandparent-of-origineffectsforFIS2,MEA,andFIEintheendospermandembryoofdevelopingArabidopsisseeds.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,9719:10637.[2]GarciaD,SaingeryV,ChambrierP,etal.Arabidopsishaikumutantsrevealnewcontrolsofseedsizebyendosperm.[J].PlantPhysiology,2003,1314:1661-70.发明内容为了克服现有技术的不足，本发明提供紫斑牡丹的IKU2基因序列，本发明的目的在于从紫斑牡丹种子不同发育时期的转录组文库中筛选得到调控种子大小的基因IKU2，提供紫斑牡丹IKU2基因的制备方法，并通过实验系统研究它的序列特征，着重解析其表达特性，为通过基因工程技术改良紫斑牡丹种子产量提供分子依据。上述基因的制备方法具体步骤如下：1紫斑牡丹种子总RNA的提取；根据上海生工公司柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒推荐方法改进后进行油用牡丹种子总RNA的提取2cDNA第一链的合成；以提取的RNA作为模板进行反转录反应，以提取的RNA作为模板进行反转录反应，然后合成cDNA。3紫斑牡丹IKU2基因保守区的扩增；根据油用牡丹IKU2基因的保守区域设计特异性引物，正向引物序列FP:ATTGGTGAACCTCTCCCTTTAC反向引物序列RP:CTCTGAAGCGTCGATGTAATCA，以cDNA作为模板进行PCR扩增4PCR扩增产物的回收纯化；将上述PCR反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪上观察，在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用干净纸巾吸尽凝胶表面液体。尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率。对所切目的DNA凝胶部分进行回收纯化。5连接目的片段与克隆载体pMD19-T；利用pMD19-T载体与目的片段连接。6大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞的制备；①大肠杆菌菌株DH5α在LB固体平板上进行划线；②挑取生长正常的单菌落，接种于LB液体培养基中；③取上述活化好的菌液接种至准备好的BTMedia中；④菌体用冰上预冷的BTBufferA轻柔充分重悬菌体；⑤菌体用冰上预冷的BTBufferB轻柔充分重悬菌体。7连接产物的转化；①将连接反应液加入100μL感受态细胞中，轻柔混匀后冰上静置30min；②将离心管置于42℃水浴锅中热激90s，取出后立即在冰中放置5min；③加入900μL预热至37℃的不含抗生素的LB液体培养基，颠倒混匀，37℃条件下180rmin振荡培养1h；④4000rpm离心5min后弃800μL上清，将剩余菌体悬起后涂布于包含24mgL异丙基硫代半乳糖苷Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG、20mgL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷X-Gal和50mgL氨苄青霉素钠Ampicillin，Amp的LB固体培养基平板上，待菌液完全吸收后于37℃倒置培养14-16h后观察是否有菌落。8重组质粒的提取；提取重组质粒，将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。9测序；将PCR检测后的质粒测序，对测序结果进行分析。本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明从紫斑牡丹中首次获得IKU2基因，本发明从紫斑牡丹种子不同发育时期的转录组文库中筛选得到调控种子大小的基因IKU2，作为调控种子生长的关键基因，有重要价值。连接产物的纯化过程中水浴后在冰上快速冷却可减少被杂菌污染的机会，LB液体培养基与固体培养基相比反应更高效快速，提高了其转化效率。本发明对解析紫斑牡丹IKU2基因的功能和制备方法，对改良牡丹种子大小，提高产量具有重要意义。通过实验系统研究IKU2的序列特征，解析其表达特性，为通过生物技术进行改良来提高植物产量奠定理论基础，为理解紫斑牡丹种子生长发育机制研究提供技术依据。附图说明下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图1是IKU2基因编码序列及其推导的氨基酸序列图。图2是IKU2理化特性分析图。图3是IKU2亲疏水性分析图。图4是IKU2亚细胞定位分析图。图5是IKU2信号肽分析图。图6是IKU2蛋白三级结构预测图。图7是IKU2基因的溶解曲线图。图8是IKU2基因在紫斑牡丹4个发育时期种子种的相对表达量图。图9是紫斑牡丹四个发育时期的种子大小图。图10是紫斑牡丹种子RNA电泳图片和IKU2基因扩增产物电泳图片。具体实施方式下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。实施例11.紫斑牡丹种子IKU2基因cDNA的获得采集大连民族大学金石滩校区紫斑牡丹基地的4个发育时期6月20日、7月7日、7月17日和7月27日的种子，做好标记立即液氮速冻，然后将种子用液氮研磨，根据上海生工公司柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒推荐方法改进后进行紫斑牡丹种子总RNA的提取。以提取的RNA作为模板进行反转录反应，操作步骤如下：①在PCR管中配制下列混合液，反应体系如下：②轻柔混匀后离心，70℃反应10min后迅速置于冰上冷却5min；③离心数秒使混合液聚集于PCR管底部；④在上述PCR管中配制反转录反应液，反应体系如下：⑤温和混匀后42℃保温60min；⑥70℃保温15min后冰上冷却；⑦取5μL样品进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；⑧紫外灯下观察拍照，将所得到的cDNA置于-20℃保存或用于后续实验。2.紫斑牡丹IKU2基因保守区的扩增根据油用牡丹转录因子的保守区域设计特异性引物，正向引物ForwardPrimer,FP和反向引物ReversePrimer,RP分别为：5’-ATTGGTGAACCTCTCCCTTTAC-3’和：5’-CTCTGAAGCGTCGATGTAATCA-3’。①以cDNA作为模板进行PCR扩增，反应体系如下：②轻轻混匀后离心，将各小管置于PCR仪上，设置反应程序为：94℃5min预变性，1个循环；94℃30s变性，55℃30s退火，72℃2min延伸，35个循环；72℃10min延伸，1个循环；4℃保存。③取5μL样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；④紫外灯下观察拍照，将所得到的cDNA置于-20℃保存。3.PCR扩增产物的回收纯化将上述PCR反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪上观察，在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用干净纸巾吸尽凝胶表面液体。尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率。按照TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒对所切目的DNA凝胶部分进行回收纯化，具体操作如下：①先向BufferWB中加入56mL的100％乙醇，混匀备用；②称重1.5mL离心管重量，将切下来的凝胶用干净纸巾洗去水分并切碎装入离心管中，再进行称重，计算体积以1mg＝1μL进行体积计算加入3倍体积的胶块溶解液BufferGM；③向凝胶中加入相应的胶块溶解液BufferGM，充分振荡混合，使胶块充分溶解约5-10分钟；④将上述所得到的溶液加入到已事先放在收集管里的吸附柱中，室温12000rpm离心1min；⑤将所得滤液重新收集于吸附柱中再次离心，去掉滤液；⑥向吸附柱中加入700μL的BufferWB，室温12000rpm离心1min，弃滤液；⑦重复上述步骤1次；⑧同样离心条件下空离一次，将吸附柱放入新的收集管中，在膜中央处加入30μL灭菌水或ElutionBuffer，室温静置1min；⑨12000rpm离心1min洗脱DNA，离心管底部即为目的基因回收产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测回收质量。4.连接目的片段与克隆载体pMD19-T按照试剂盒的说明，依次加入下列溶液构成连接反应体系：反应液混匀后，16℃连接6-8h。5.大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞的制备①从超低温冰箱中取出保存的大肠杆菌菌株DH5α在LB固体平板上进行划线，37℃条件下倒置培养14-16h；②挑取生长正常的单菌落，接种于5mLLB液体培养基中，37℃条件下180rmin振荡培养14-16h；③取上述活化好的菌液0.15mL接种至准备好的15mLBTMedia中，于37℃摇床充分振荡培养2小时至菌液OD600＝0.5-0.6；④将全部菌液转移至50mL聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10min；⑤于4℃，5000rpm离心5min收集菌体沉淀；⑥菌体沉淀用5mL冰上预冷的BTBufferA轻柔充分重悬菌体，冰上放置10min；⑦于4℃，4000rpm离心5min收集菌体沉淀；⑧菌体沉淀用1.2mL冰上预冷的BTBufferB轻柔充分重悬菌体，按每管100μL分装至冰上预冷的1.5mL离心管中；⑨菌体直接用于转化或用液氮速冻后于超低温冰箱中保存。6.连接产物的转化①将连接反应液加入100μL感受态细胞中，轻柔混匀后冰上静置30min；②将离心管置于42℃水浴锅中热激90s，取出后立即在冰中放置5min；③加入900μL预热至37℃的不含抗生素的LB液体培养基，颠倒混匀，37℃条件下180rmin振荡培养1h；④4000rpm离心5min后弃800μL上清，将剩余菌体悬起后涂布于包含24mgL异丙基硫代半乳糖苷Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG、20mgL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷X-Gal和50mgL氨苄青霉素钠Ampicillin，Amp的LB固体培养基平板上，待菌液完全吸收后于37℃倒置培养14-16h后观察。7.重组质粒的提取按照生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取重组质粒，具体操作如下：①将经蓝白斑筛选的单菌落接种至含Amp抗生素的液体培养基中，37℃充分振荡培养14h；②取3mL菌液，于室温12000rpm离心2min收集菌体，倒尽或吸干培养基；③在菌体沉淀中加入250μLBufferP1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体；④加入250μLBufferP2，立即温和颠倒离心管混匀，室温静置3min；⑤加入350μLBufferP3，立即温和颠倒离心管充分混匀后12000rpm离心10min；⑥小心吸取600μL上清移入吸附柱，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；⑦在吸附柱中加入500μLBufferDW1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；⑧向吸附柱中加入500μLWashSolution，12000rpm离心1min，倒掉管中废液；⑨重复步骤⑧一次，然将空吸附柱和收集管放入离心机，12000rpm离心2min；⑩在吸附膜中央加入75μL预热至60℃的ElutionBuffer，室温静置2min，12000rpm离心1min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。IKU2基因序列特征及表达特性分析1ORF及保守结构域分析通过BioXM2.6软件分析得到IKU2基因ORF全长为2595bp，编码864个氨基酸图1。2理化特性分析通过ProtParam程序对IKU2蛋白的理化性质进行了分析，分子式为C4217H6693N1117O1297S28，分子量为94690.91Da，理论等电点为5.74，等电点小于7为酸性蛋白，为酸性蛋白；该蛋白含Leu最多，占15.4％；总的带正电残基精氨酸Arg+赖氨酸Lys为71，负电残基天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu为84；不稳定系数为32.84，不稳定系数小于40时为稳定蛋白，表明IKU2是一个稳定蛋白图2。3亲、疏水性和跨膜结构域分析通过对亲疏水性的分析可以反映出蛋白质表面氨基酸的分布和跨膜结构域。利用ProtScale程序对IKU2基因的亲、疏水性进行分析，信号中的正、负值分别代表疏水性和亲水性。结果如图3所示，IKU2蛋白均具有多个明显的亲水区域，大部分氨基酸属于亲水性氨基酸。它们分别在氨基酸序列第616位具有最高的分值3.311，而在氨基酸第631位具有最低的分值-3.256，紫斑牡丹IKU2属于亲水性蛋白。进一步利用TMHMM程序对IKU2蛋白跨膜区进行了分析，结果表明它只含有一个跨膜区。4亚细胞定位及信号肽分析蛋白质处于特定的亚细胞位置上才能行使其功能，故研究亚细胞定位对了解蛋白质的功能非常重要。亚细胞定位分析发现，IKU2蛋白定位于质膜上图4；信号肽是引导前体蛋白通过细胞膜分泌到胞外的一段序列，对其预测和分析有助于了解蛋白质的细胞定位和区分蛋白质的功能域。最高原始剪切位点分值C、最高信号肽分值S以及最高综合剪切位点分值Y分别为0.821、0.964和0.858。通常可能的信号肽剪切点由最高Y值来推测，为具有最高C值的点同时又是S值由高变低时陡峭的位置。由此可知IKU2蛋白存在信号肽，为分泌蛋白。5磷酸化位点分析磷酸化是蛋白质最常见、最重要的一种翻译后修饰方式之一，该过程能够参与调节细胞生长、细胞分化和信号转导等多种生命活动。蛋白质磷酸化位点主要在丝氨酸Ser、苏氨酸Thr和酪氨酸Tyr残基上，通常基因功能与多肽链中氨基酸潜在磷酸化位点的多少有很大相关性。利用NetPhos程序对IKU2蛋白磷酸化位点的数量进行预测，若Potential值大于Threshold值，那么存在磷酸化位点，相反则不存在。IKU2蛋白有74个Ser、17个Thr、9个Tyr可能成为磷酸化位点。6二级结构和三维结构分析研究蛋白的空间结构对了解其功能有着重要的指导作用，因此分析了IKU2蛋白的二级结构和三级结构。蛋白的二级结构主要指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式，是其空间结构预测的基础。通过HNNMethods对IKU2蛋白的二级结构进行了预测，该蛋白存在329个无规则卷曲Randomcoil占38.08％、292个α-螺旋Alphahelix占33.80％、161个伸展链Extendedstrand占18.63％。将氨基酸序列提交到SWISS-MODEL软件，得到紫斑牡丹IKU2蛋白的三维结构图6。7在紫斑牡丹种子不同生长期的表达特性分析提取的高质量紫斑牡丹种子总RNA，经反转录获得cDNA，并以之为模板进行实时定量PCR扩增。反应结束后，使用软件分析数据，结果如图7所示，IKU2基因的溶解曲线为单峰，说明使用的引物特异性较好。8IKU2基因的获得提取RNA后用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，如图10A所示，观察到3条清晰条带，说明RNA完整性良好。反转录后通过PCR扩增得到IKU2转录因子基因图10B。IKU2基因在紫斑牡丹不同发育时期的种子中均有表达，从6月20日到7月17日期间，种子发育前期，紫斑牡丹种子中的IKU2基因表达量呈较稳定趋势，但在7月27日种子发育后期其达到表达量峰值，约为7月17日的2.42倍图8。紫斑牡丹的IKU2基因编码不稳定的亲水蛋白，分子式为C4217H6693N1117O1297S28，分子量为94690.91Da，理论等电点为5.74。有信号肽和跨膜结构域，定位在质膜上，存在多个磷酸化位点，二级结构中无规则卷曲所占比例最高。IKU2基因在紫斑牡丹不同发育时期的种子中均有表达，随着发育时间的延长，该基因表达量呈逐渐升高的趋势，在第四时期表达量达到峰值。随之种子的大小也逐渐变大。在紫斑牡丹中首次获得IKU2基因，作为调控种子生长的关键基因，有重要价值。连接产物的纯化过程中水浴后在冰上快速冷却可减少被杂菌污染的机会，LB液体培养基与固体培养基相比反应更高效快速，提高了其转化效率。相对于其他模式植物种子大小发育的分子生物学研究，控制作物种子大小发育的分子机理研究还比较滞后，因此该领域的研究存在巨大的发展空间。目前已发现的调控种子大小发育的基因数量较少，需进一步研究挖掘；有些功能基因的调控过程尚不清楚。以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

权利要求：1.一种来源于紫斑牡丹的IKU2基因，其特征在于，其具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的紫斑牡丹的IKU2基因，其特征在于，IKU2基因ORF全长为2595bp，编码864个氨基酸。

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