申请/专利权人：上海海洋大学

申请日：2018-11-23

公开（公告）日：2022-03-01

公开（公告）号：CN109486924B

主分类号：C12Q1/6869(20180101)

分类号：C12Q1/6869(20180101);C12Q1/6806(20180101);C12N15/11(20060101);C40B50/06(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.03.01#授权;2019.04.12#实质审查的生效;2019.03.19#公开

摘要：本发明公开了基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法，包括样本DNA序列破碎、修复序列平末端、序列末端加上串联条形码接头、修复序列空缺并延伸和PCR扩增的步骤构建DNA文库；其中串联条形码为6bp长度的DNA序列，且同时满足最小编辑长度3以内、包含不同碱基的片段、使用不同激光色的碱基且相邻碱基激光色不同和不含有AAA、ACA、CCC、CAC、GGG、GTG、TTT和TGT的碱基序列。通过提前引入串联条形码进行DNA标记，大大减少污染数据不能被识别的可能性，极大改善在DNA文库构建和基因富集过程中非常普遍的样本之间相互污染问题。

主权项：1.基于Illumina测序的串联条形码，其特征在于，包括IS1串联条形码和IS2串联条形码，其中：所述IS1串联条形码在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃的过程中IS1序列和与所述IS1序列具有部分互补片段的IS3X’序列结合形成；所述IS2串联条形码在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃的过程中IS2序列和与所述IS2序列具有部分互补片段的IS3Y’序列结合形成；所述IS1序列包括IS1_Ind1至IS1_Ind24，所述IS2序列包括IS2_Ind25至IS2_Ind48，所述IS3X’序列包括IS3_Ind1至IS3_Ind24，所述IS3Y’序列包括IS3_Ind25至IS3_Ind48，如下表所示，其中*表示PTO修饰： Name Sequence Name Sequence TCTGCC IS1_Ind1 A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtc*t*g*c*c IS3_Ind1 ggcagaAGATCGGAA*G*A*G*C GTCTCT IS1_Ind2 A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgt*c*t*c*t IS3_Ind2 agagacAGATCGGAA*G*A*G*C ATATTG IS1_Ind3 A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTat*a*t*t*g IS3_Ind3 caatatAGATCGGAA*G*A*G*C TGGAAG IS1_Ind4 A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtg*g*a*a* IS3_Ind4 cttccaAGATCGGAA*G*A*G*C TCTAGT IS1_Ind5 A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtc*t*a*g*t IS3_Ind5 actagaAGATCGGAA*G*A*G*C AGAGTA IS1_Ind6 A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTag*a*g*t*a IS3_Ind6 tactctAGATCGGAA*G*A*G*C GGCCAA IS1_Ind7 A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgg*c*c*a* 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全文数据：基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法技术领域本发明涉及分子标记，涉及DNA文库标记，具体涉及一种基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法。背景技术在使用Illumina方法进行测序时，目前通用DNA文库构建的步骤为破碎、修复平末端、加上IS7、IS8引物识别位点接头、补足接头与序列之间出现的空缺，最后进行indexingPCR时为序列加上条形码以便区分样本，测序后得到的数据根据此条形码进行分类。但是，上述方法在整个实验步骤最后加上条形码，如果在之前的步骤中样本之间发生相互污染，则无法区分数据是属于哪个样本。现有技术中，专利申请CN107502607A公开了一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法，用于反转录mRNA，合成cDNA时进行标记，但不适用于DNA文库构建。专利CN104573407B公开了一种物种特异性内源性条形码的搜索方法及其在多样本混合测序中的应用，通过重叠延伸PCR技术，利用样本内源DNA序列的差异对PCR产物进行标记，与DNA文库构建无关，也没有包括条形码标记技术。目前，DNA样本间交叉污染现象非常严重，对后续数据的组装和分析造成很大困扰和隐患。发明内容为克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法，在文库构建初期即加入可以区分样本的串联条形码InlineIndex接头，通过串联条形码标记构建DNA文库，准确区分不同DNA样本。相对于传统的分子条形码技术，不仅纠正受到污染的数据，还大大增加条形码组合的数量用于区分更多样本，节约成本。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：第一方面，基于Illumina测序的串联条形码为6bp长度的DNA序列，且同时满足ⅰ最小编辑长度3以内，和ⅱ包含不同碱基的片段，和ⅲ使用不同激光色的碱基，且相邻碱基激光色不同，和ⅳ不含有'AAA'、'ACA'、'CCC'、'CAC'、'GGG'、'GTG'、'TTT'和'TGT'的碱基序列。优选的，所述串联条形码包括IS1串联条形码、IS2串联条形码和与所述IS1串联条形码和IS2串联条形码对应的IS3串联条形码。且所述IS3串联条形码与所述IS1串联条形码和IS2串联条形码之间分别具有部分互补片段。优选的，所述IS1串联条形码包括IS1序列和与所述IS1序列具有部分互补片段的IS3X’序列，通过在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃，所述IS1序列和所述IS3X’序列结合形成所述IS1串联条形码。优选的，所述IS2串联条形码包括IS2序列和与所述IS2序列具有部分互补片段的IS3Y’序列，通过在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃，所述IS2序列和所述IS3Y’序列结合形成所述IS2串联条形码。第二方面，通过上述串联条形码标记的DNA文库的构建方法，具体地，包括以下步骤：1生物样本DNA序列破碎，获取DNA片段序列，和2修复上述DNA片段序列平末端，和3在所述DNA片段序列5’端加上IS1串联条形码接头，所述DNA片段序列3’端加上IS2串联条形码接头，且引物IS7的结合位点位于所述IS1串联条形码接头外侧，引物IS8的结合位点位于所述IS2串联条形码接头外侧，和4修复所述DNA片段序列空缺并延伸，和5采用所述引物IS7、IS8对DNA序列进行PCR扩增，即得。本发明的有益效果在于：传统DNA文库的构建方法中，不断重复地清洗步骤很容易造成样本之间，或者外源性DNA对样本的污染，加上生物探针敏感，导致低浓度的污染DNA也可能被捕获、测序。本发明通过提前引入串联条形码进行DNA标记，大大减少污染数据不能被识别的可能性，极大改善在DNA文库构建和基因富集过程中非常普遍的样本之间相互污染问题。另外，通过本发明标记后的DNA样本可以相互混合用于基因富集、测序，大大降低基因富集技术操作的复杂性和繁琐程度。附图说明图1：串联条形码的制作过程为：在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃的过程中对应的IS1和IS3X’结合形成IS1串联条形码；同样的，在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃的过程中对应的IS2和IS3Y’结合形成IS2串联条形码。图2：DNA文库的建立过程依次为：DNA序列平末端修复、两端添加串联条形码接头、修复空缺并延伸DNA；由于引物IS7、IS8的结合位点分别位于IS1、IS2的接头序列最外侧，用引物IS7和引物IS8对DNA序列进行PCR扩增即完成DNA文库。基因富集实验过程中，利用特异探针对DNA文库进行目标片段抓取，引物IS4和测序用条形码Index引物的结合位点分别位于引物IS7和引物IS8外侧，获得最终目标片段后对DNA序列进行indexPCR扩增，并进行Illumina测序，也可用引物IS4和Index引物对DNA文库进行扩增直接测序获得基因组信息。具体实施方式下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1构建串联条形码，根据表1所提供的DNA序列进行合成，先配置OligoHybridizationBufferNaCl5M1mL，Tris-ClpH8.01M100μL，EDTApH8.00.5M20μL和H2O8.88mL。具体步骤如下：将IS1和对应编号的IS3混合，并加入OligoHybridizationBuffer来形成双链接头IS1_adapter_P5.F500μM10μL、IS3_adapter_P5+P7.R500μM10μL、OligoHybridizationBuffer10×10μL、H2O70μL。将IS2和对应编号的IS3混合，并加入OligoHybridizationBuffer来形成双链接头IS2_adapter_P7.F500μM10μL、IS3_adapter_P5+P7.R500μM10μL、OligoHybridizationBuffer10×10μL、H2O70μL。将上述两种混合液分别在PCR仪中95℃下反应10秒，然后以0.1℃秒的速率从95℃降温至12℃，再以20μL每管进行分装，并在管盖上做好编号，在-20℃环境下保存备用，如图1所示。表1：InlineIndex信息NameSequenceNameSequenceTCTGCCIS1_Ind1A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtc*t*g*c*cIS3_Ind1ggcagaAGATCGGAA*G*A*G*CGTCTCTIS1_Ind2A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgt*c*t*c*tIS3_Ind2agagacAGATCGGAA*G*A*G*CATATTGIS1_Ind3A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTat*a*t*t*gIS3_Ind3caatatAGATCGGAA*G*A*G*CTGGAAGIS1_Ind4A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtg*g*a*a*gIS3_Ind4cttccaAGATCGGAA*G*A*G*CTCTAGTIS1_Ind5A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtc*t*a*g*tIS3_Ind5actagaAGATCGGAA*G*A*G*CAGAGTAIS1_Ind6A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTag*a*g*t*aIS3_Ind6tactctAGATCGGAA*G*A*G*CGGCCAAIS1_Ind7A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgg*c*c*a*aIS3_Ind7ttggccAGATCGGAA*G*A*G*CTATCTCIS1_Ind8A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTta*t*c*t*cIS3_Ind8gagataAGATCGGAA*G*A*G*CTTATGCIS1_Ind9A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtt*a*t*g*cIS3_Ind9gcataaAGATCGGAA*G*A*G*CAGTTGGIS1_Ind10A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTag*t*t*g*gIS3_Ind10ccaactAGATCGGAA*G*A*G*CGTCAAGIS1_Ind11A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgt*c*a*a*gIS3_Ind11cttgacAGATCGGAA*G*A*G*CCAGCAAIS1_Ind12A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTca*g*c*a*aIS3_Ind12ttgctgAGATCGGAA*G*A*G*CTCGCCGIS1_Ind13A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtc*g*c*c*gIS3_Ind13cggcgaAGATCGGAA*G*A*G*CCTAAGAIS1_Ind14A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTct*a*a*g*aIS3_Ind14tcttagAGATCGGAA*G*A*G*CCCGCTTIS1_Ind15A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcc*g*c*t*tIS3_Ind15aagcggAGATCGGAA*G*A*G*CAAGTTAIS1_Ind16A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTaa*g*t*t*aIS3_Ind16taacttAGATCGGAA*G*A*G*CGGTACCIS1_Ind17A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgg*t*a*c*cIS3_Ind17ggtaccAGATCGGAA*G*A*G*CCCAGGTIS1_Ind18A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcc*a*g*g*tIS3_Ind18acctggAGATCGGAA*G*A*G*CAATCGAIS1_Ind19A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTaa*t*c*g*aIS3_Ind19tcgattAGATCGGAA*G*A*G*CAACGCAIS1_Ind20A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTaa*c*g*c*aIS3_Ind20tgcgttAGATCGGAA*G*A*G*CGACGACIS1_Ind21A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTga*c*g*a*cIS3_Ind21gtcgtcAGATCGGAA*G*A*G*CCGCGCTIS1_Ind22A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcg*c*g*c*tIS3_Ind22agcgcgAGATCGGAA*G*A*G*CCCGTAGIS1_Ind23A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcc*g*t*a*gIS3_Ind23ctacggAGATCGGAA*G*A*G*CGTAATCIS1_Ind24A*C*A*C*TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgt*a*a*t*cIS3_Ind24gattacAGATCGGAA*G*A*G*CGACCTTIS2_Ind25G*T*G*A*CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTga*c*c*t*tIS3_Ind25aaggtcAGATCGGAA*G*A*G*CTCATAAIS2_Ind26G*T*G*A*CTGGAGTTC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权利要求：1.基于Illumina测序的串联条形码，其特征在于，所述串联条形码为6bp长度的DNA序列，且同时满足ⅰ最小编辑长度3以内，和ⅱ包含不同碱基的片段，和ⅲ使用不同激光色的碱基，且相邻碱基激光色不同，和ⅳ不含有'AAA'、'ACA'、'CCC'、'CAC'、'GGG'、'GTG'、'TTT'和'TGT'的碱基序列。2.根据权利要求1所述的基于Illumina测序的串联条形码，其特征在于，所述串联条形码包括IS1串联条形码、IS2串联条形码和与所述IS1串联条形码和IS2串联条形码对应的IS3串联条形码。3.根据权利要求1或2所述的基于Illumina测序的串联条形码，其特征在于，所述IS1串联条形码包括IS1序列和与所述IS1序列具有部分互补片段的IS3X’序列，通过在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃，所述IS1序列和所述IS3X’序列结合形成。4.根据权利要求1或2所述的基于Illumina测序的串联条形码，其特征在于，所述IS2串联条形码包括IS2序列和与所述IS2序列具有部分互补片段的IS3Y’序列，通过在95℃以0.1℃秒的速率降温至12℃，所述IS2序列和所述IS3Y’序列结合形成。5.权利要求1-4任一项所述基于Illumina测序的串联条形码标记DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1生物样本DNA序列破碎，获取DNA片段序列，和2修复上述DNA片段序列平末端，和3在所述DNA片段序列5’端加上IS1串联条形码接头，所述DNA片段序列3’端加上IS2串联条形码接头，且引物IS7的结合位点位于所述IS1串联条形码接头外侧，引物IS8的结合位点位于所述IS2串联条形码接头外侧，和4修复所述DNA片段序列空缺并延伸，和5采用所述引物IS7、IS8对DNA序列进行PCR扩增，即得。

百度查询： 上海海洋大学 基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法

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