申请/专利权人：上海昂朴生物科技有限公司;中国人民解放军海军军医大学第三附属医院;江苏昂朴医疗科技有限公司

申请日：2018-12-29

公开（公告）日：2022-03-01

公开（公告）号：CN109609694B

主分类号：C12Q1/70(20060101)

分类号：C12Q1/70(20060101);C12Q1/6858(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.03.01#授权;2019.05.07#实质审查的生效;2019.04.12#公开

摘要：本发明公开了一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，包括以下步骤：A：提取HBV基因组DNA；B：对HBV基因组DNA进行扩增，获得第一扩增产物；C：使用第二、三引物对扩增第一扩增产物，得到第二、三扩增产物；D：对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；E：对测序文库进行质检定量；F：上机测序；G：数据分析得到耐药位点及分型相关信息。本发明还公开了一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒。采用本发明的方法具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点，能够有效检测HBV样品的多个耐药位点突变状态，尤其在低滴度样本上具有明显优势。

主权项：1.一种非诊断目的的基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：A：提取检测样本中的HBV基因组DNA；B：使用第一引物对，对所述HBV基因组DNA进行扩增，以得到第一扩增产物；C：使用第二引物对和第三引物对，扩增所述第一扩增产物，得到第二、三扩增产物；D：使用Illumina通用引物对对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；E：对所述测序文库进行质检定量；F：上机测序得到测序结果；G：数据分析得到耐药位点及分型相关信息，其中，第一引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，第二引物对的序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，第三引物对的序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；其中，所述Illumina通用引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO：57和如SEQIDNO：58所示；如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：5所示的引物的5’端均包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQIDNO：9-32所示的一种核苷酸序列，如SEQIDNO：4和如SEQIDNO：6所示的引物的5’端均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQIDNO：33-56所示的一种核苷酸序列。

全文数据：基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒及方法技术领域本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒及方法。背景技术乙型肝炎病毒HBV感染呈世界性流行，每年约有65万人死于HBV感染所致疾病。我国肝硬化和干细胞癌患者中，由HBV感染引起的比例分别为60％和80％。目前，核苷酸类似物NA如替比夫定LdT、阿德福韦酯ADV、恩替卡韦ETV、替诺福韦酯TDF等，已成为抗HBV感染的主要方法之一。随着NAs的长期应用，往往会出现病毒耐药株，造成NAs继续作用的困难。因此，在耐药早期进行检测往往可以起到更好的效果，而目前的检测手段往往难以检测到低滴度、低比例的HBV耐药突变，技术具有一定的局限性。发明内容本发明的首要目的是提供一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，该方法能够有效检测到低滴度样本的多个位点低比例的突变状况，具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点，以解决现有的HBV病毒的多耐药位点突变检测难以检测到低滴度、低比例的HBV耐药突变的问题。本发明的第二个目的是提供一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒及其应用。本发明的第三个目的是提供一种HBV分型及多耐药位点检测的系统。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：作为本发明的第一个方面，一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，包括如下步骤：A：提取检测样本中的HBV基因组DNA；B：使用第一引物对，对所述HBV基因组DNA进行扩增，以得到第一扩增产物；C：使用第二、三引物对，扩增所述第一扩增产物，得到第二、三扩增产物；D：使用Illumina通用引物对对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；E：对所述测序文库进行质检定量；F：上机测序得到测序结果；G：数据分析得到耐药位点及分型相关信息，其中，第一引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，第二引物对的序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，第三引物对的序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：5所示的引物均包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQIDNO：9-32所示的一种或多种核苷酸序列，如SEQIDNO：4和如SEQIDNO：6所示的引物均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQIDNO：33-56所示的一种或多种核苷酸序列。由此，能够有效检测HBV样品的多个耐药位点突变状态，尤其在低滴度样本上具有明显优势。根据本发明，所述检测样本为宿主样本的血清或血浆样本。根据本发明，还包括对步骤D的测序文库进行分离纯化的步骤，分离纯化的方法选自琼脂糖凝胶纯化、磁珠纯化和纯化柱纯化等中的至少一种。根据本发明，步骤F的测序仪选自Illumina测序仪中的至少一种进行所述测序，Illumina测序仪包括但不限于：Miseq、Hiseq、Nextseq、Miniseq、Novaseq。根据本发明，乙型肝炎分型及多耐药位点为V173L、L180M、M204VI、A181TV、N236T、S202G、M250V、T184G、I169T、A194T中的一种或几种。作为本发明的第二个方面，一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒，包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对、如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对、如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对。进一步的，如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：5所示的引物包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQIDNO：9-32所示的一种或多种核苷酸序列，如SEQIDNO：4和如SEQIDNO：6所示的引物均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQIDNO：33-56所示的一种或多种核苷酸序列。根据本发明，所述多耐药位点为V173L、L180M、M204VI、A181TV、N236T、S202G、M250V、T184G、I169T、A194T中的一种或几种。作为本发明的第三个方面，一种上述所述的试剂盒的应用，所述试剂盒用于检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态。作为本发明的第四个方面，一种检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的系统，包括：扩增装置，用于利用如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对对核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；再用于利用如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对、如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对对第一扩增产物进行扩增，以获得到第二、三扩增产物；然后再用于利用如SEQIDNO：57和SEQIDNO：58所示的Illumina通用引物对对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；测序装置，与扩增装置相连，并且适于对扩增产物进行测序，以便得到测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。分析装置，与测序装置相连，用于基于测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。进一步的，所述分析装置包括比对单元，所述比对单元中存储有参考序列，用于将所述测序结果与参照序列进行比对，以确定所述检测样品每个突变位点的突变。进一步的，检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的系统还包括核酸抽提装置，所述核酸抽提装置适用于从乙型肝炎病毒宿主分离乙型肝炎病毒核酸样本。作为本发明的第五个方面，一种用于检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的特异性引物对，包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对、如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对、如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对。进一步的，如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：5所示的引物包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQIDNO：9-32所示的一种或多种核苷酸序列，如SEQIDNO：4和如SEQIDNO：6所示的引物均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQIDNO：33-56所示的一种或多种核苷酸序列。本发明的有益效果是：具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点；能够有效检测HBV样品的多个耐药位点突变状态；而且通过两轮PCR的方法获得目的片段，再用通用引物扩增形成文库，可以使扩增效果更稳定，尤其在低滴度样本上具有明显优势。附图说明图1为确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法的流程示意图。图2为确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统的结构示意图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本发明实施例中的2×GoldStarMasterMix和DNase-Freewater均可通过市售获得。1、本发明的引物对的设计，见表1表1引物对的序列上游引物序列5'—3'SEQID下游引物序列5'—3'SEQID第一引物对TAGGACCCCTGCTCGTGTTANO：1GCTAGGAGTTCCGCAGTATGGNO：2第二引物对GACTCGTGGTGGACTTCTCTCANO：3GTTGTACAGACTTGGCCCCCNO：4第三引物对GGGCTTTCCCCCACTGTYNO：5GRGCAACGGGGTAAAGGKNO：6第四引物对TAGGACCCCTGCTCGTGTTANO：7GGGTTGCGTCAGCAAACACNO：8其中，第一引物对针对HBV基因组的多个耐药位点设计，可以有效富集低滴度样本检测位点，扩增产物可以使用第二、三引物对进行扩增。第二引物对针对HBV基因组的多个耐药位点设计，引物包含部分Illumina接头序列，以适应Illumina测序仪。第三引物对针对HBV基因组的多个耐药位点设计，引物包含部分Illumina接头序列，以适应Illumina测序仪。第四引物对同样针对HBV基因组的多个耐药位点设计，可以有效富集低滴度样本检测位点，扩增产物可以使用第二、三引物对进行扩增。2、本发明的标签的设计，见表2表2标签序列3、Illumina通用引物对的设计使用Illumina公司通用的建库PCR引物，包括一条通用的上游引物，和一条带有标签Index序列的下游引物。Illumina通用引物对的序列如表3所示。使用高效的PCR扩增酶进行PCR，其中PCR循环数选择6轮。使用带有标签Index序列的引物进行PCR以后，可以将不同来源的文库进行混合，然后上机测序。表3Illumina通用引物对的序列其中，下划线部分的碱基可以依据Illumina的官方说明使用多种碱基组合，从而产生更多的、不同标签的引物，用于不同的文库的区分。本发明中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代测序平台包括但不限于Illumina-SolexaMiseq、Hiseq、Nextseq、Miniseq、Novaseq等测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa测序平台等的至少一种进行测序。在本发明中所使用术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA。本发明的实施例的核酸标签见表2。通过将核酸标签与DNA相连，可以精确地表征DNA样品来源。在上下游PCR引物的5’端分别加上3个碱基以上的标签序列，含不同标签的上下游引物分别组合用来区分不同的样本。需要说明的是此处的标签是人为设计的碱基序列，一般由3个碱基以上构成，其目的是使每一个核酸样本的PCR产物两端都有唯一的序列标签，从而有效地将不同样本相同的PCR产物区分开来。由此，利用上述核酸标签，可以同时构建多个样品的DNA文库，充分发挥测序深度的优势，同时检测多个样本的突变状态。例如利用Illumina测序技术，同时对多种DNA进行测序的高通量，提高DNA测序的效率和通量，降低了DNA测序成本。本发明提供了一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，包括以下步骤：步骤1：使用提取试剂盒对提取检测样本中的HBV基因组DNA；步骤2：使用如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对，对所述HBV基因组DNA进行扩增，以得到第一扩增产物；步骤3：使用如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对以及如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对，扩增所述第一扩增产物，得到第二、三扩增产物；步骤4：使用如SEQIDNO：57和SEQIDNO：58所示Illumina通用引物对对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；步骤5：对所述测序文库进行质检定量；步骤6：上机测序得到测序结果；步骤7：数据分析得到耐药位点及分型相关信息。其中，如SEQIDNO：3所示的引物和如SEQIDNO：5所示的引物均包含第一标签序列，第一标签序列如SEQIDNO：9——SEQIDNO：32所示；如SEQIDNO：4所示的引物和SEQIDNO：6所示的引物均包含第二标签序列，第二标签序列如SEQIDNO：33——SEQIDNO：56所示。本发明的实施例中，将核酸标签引入到测序文库中的方法并不受特别限制。既可以在构建文库的过程中，按照常规方法，将标签引入到测序文库中。也可以在对待测序的核酸样品进行预处理，通过PCR扩增的方法，将标签引入到扩增产物中，之后通过常规的构建文库的方法，针对所得到的含有标签的扩增产物构建测序文库，从而得到含有标签的测序文库。由此，可以在对多个核酸样品进行扩增之后，就可以混合在一起，进行文库构建，从而容易获得含有各自核酸标签序列的多种核酸样本的测序文库。本发明的实施例中，样本的来源并不受特别限制。HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离，优选的，HBV核酸样本是从乙肝患者血清或血浆样本中分离的。本发明的实施例中，以提取的HBV基因组DNA为模板进行扩增，其中所使用的聚合酶包括但不限于常规的taq酶、pfu高保真酶或其它聚合酶，优先选用pfu高保真酶。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增情况。本发明的实施例中，还包括对步骤4的扩增产物纯化回收，纯化方法包括但不限于琼脂糖凝胶回收、磁珠纯化和纯化柱纯化。本发明的实施例中，为了有效提高建库各步骤中的产物纯度、减少杂质干扰、有利于后续步骤的进行，可以对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，纯化方法包括但不限于磁珠纯化、纯化柱纯化、琼脂糖胶电泳纯化，优选磁珠纯化。本发明的实施例中，将纯化回收的产物定量，使用的荧光定量分析仪定量包括但不限于Qubit，然后将不同样本的产物按照相同的摩尔数混合，得到混合的扩增产物。本发明的实施例中，使用Q-PCR的方法对测序文库进行质检定量，其中以IluminaP5、P7作为引物，使用Illuminaphixcontrolkitv3作为标准品。本发明的实施例中，通过二代测序平台进行测序，优选IlluminaMiseq平台，并进行数据分析，确定是否存在突变。本发明的实施例中，使用Illumina公司通用的建库PCR引物，包括一条通用的上游引物，序列如SEQIDNO：57所示，和一条带有标签Index序列的下游引物，序列如SEQIDNO：58所示，使用高效的PCR扩增酶进行PCR，其中PCR循环数选择6轮。使用带有标签Index序列的引物进行PCR以后，可以将不同来源的文库进行混合，然后上机测序。本发明的方法能够有效检测HBV样品的多个耐药位点突变状态，尤其在低滴度样本上具有明显优势。可以检测乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点为选自V173L、L180M、M204VI、A181TV、N236T、S202G、M250V、T184G、I169T、A194T中的至少一种。本发明还提供了一种用于HBV分型及多耐药位点检测的试剂盒，其包括：如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对、如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对、如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对。本发明还提供了一种HBV分型及多耐药位点检测的系统，该系统包括：扩增装置、测序装置、分析装置。其中：扩增装置用于对核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物，进一步得到第二、三扩增产物，进一步得到测序文库；测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述扩增产物进行测序，以便得到测序结果；分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。实施例1本实施例是采用Illumina测序技术对病人血清中HBV样品进行检测的，具体操作步骤如下：步骤1、按照说明书操作，用TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒天根生化科技北京有限公公司，DP315提取乙肝患者血清样本中的HBV基因组DNA。步骤2、使用如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对对样品进行扩增。步骤2的PCR扩增体系如表4示。表4步骤2的PCR扩增体系成分体积μlDNA52×GoldStarMasterMix10正向引物F1μM1反向引物R1μM1DNase-Freewater3步骤2的PCR的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸1min，共扩增35个循环；最终72℃延伸5min。由此，获得第一扩增产物。步骤3、分别使用如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对以及如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对对第一扩增产物进行扩增，针对不同的样品使用带有不同标签序列的引物。本实例中，针对10个样品检测上述两个片段所包含的多个耐药相关突变位点，采用标签序列区分样本，因此，第三引物、第五引物有10个标签序列，这10个标签序列如SEQIDNO：9——SEQIDNO：18所示，第四引物、第六引物有1个标签序列，这1个标签序列如SEQIDNO：33所示，每个样本有唯一的标签序列组合。步骤3的扩增体系如表5所示。表5步骤3的PCR扩增体系成分体积μlDNA52×GoldStarMasterMix10正向引物F1μM1反向引物R1μM1DNase-Freewater3步骤3的PCR的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s,57℃退火30s,72℃延伸1min，共扩增18个循环；最终72℃延伸5min。由此，获得PCR产物。步骤4、步骤3的PCR扩增产物采用1.5％的琼脂糖胶电泳确认产物情况，其中使用步骤3的PCR扩增产物5μl，电压120V，电泳30min，采用凝胶成像系统拍照检测。步骤5、之后的PCR产物回收采用AxyPrepTMPCRClean-upKitAxygen试剂盒进行回收。步骤如下表6所示：表6PCR产物的回收步骤6、取1μl步骤5的回收产物，使用2.0Invitrogen定量，然后将不同样本的产物按照相同的摩尔数混合，得到混合后的PCR产物。步骤7、取混合后的PCR产物20ng，进行PCR，使用Illumina公司通用引物进行扩增，Illumina公司PCR通用引物序列如SEQIDNO:57和SEQIDNO:58所示，循环数为6轮，获得测序文库；将上一步得到的DNA按照表7在0.2ml离心管中配制PCR反应体系：表7步骤7的PCR的反应体系步骤7的PCR的反应条件，见表8。表8步骤7的PCR的反应条件步骤8、反应完后使用AgencourtAMPureXPbeads纯化，具体步骤如表9所示。表9纯化步骤步骤9、文库质检定量。将上一步得到的文库2.0Invitrogen进行定量，Q-PCR进行质检。步骤10、上机测序及数据分析。将样本使用IlluminaMiseqPE-300程序进行双末端测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见Miseq操作说明书。步骤11、数据分析。Miseq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列，通过测序文库标签Index、样本标签序列barcode将测序序列对应到每个样本，然后将所得DNA序列与HBV的参考序列进行对比，最终对所测片段每个突变位点的突变情况进行分析，具体结果如表10所示。表10所测片段每个突变位点的突变情况的分析结果样本169T173L180M181T181V184G194T202G204I204V236T250VR00200.020.160.120.070.030.000.040.101.880.051.370.05R00210.030.8187.2012.190.120.000.370.0859.6839.571.100.03R00220.160.2098.840.510.040.020.280.110.0599.480.760.03R00230.020.4598.550.280.020.000.131.450.0399.470.540.07R00240.030.190.220.100.040.000.090.150.190.100.740.08R00250.130.1298.944.280.590.000.070.300.0199.400.150.00R002699.210.3298.140.300.040.000.120.100.350.002.130.05R00270.040.6386.810.060.090.000.040.0798.810.034.750.18R00280.020.3219.110.170.100.000.030.0999.350.080.540.03R00290.010.190.191.400.000.000.470.030.630.090.850.01结论：本发明的方法能够有效检测HBV样品的多个耐药位点突变状态，可以检测乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点为I169T、V173L、L180M、A181TV、T184G、A194T、S202G、M204VI、AN236T中的一种或多种。实施例2本实施例是采用两种扩增方案对梯度稀释的标准品进行检测，标准品选自含有待检测序列的定点突变人工质粒，具体操作步骤如下：方案一：1、对108IUml标准品进行梯度稀释至107IUml、106IUml、105IUml、104IUml、103IUml、102IUml、10IUml。2、采用实施例1的操作步骤对上述梯度稀释后的标准品进行检测，结果如表11所示。表11所测片段每个突变位点的突变情况的分析结果结果显示：采用方案一的操作步骤可以检测浓度为102IUml的样品。结论：该方法可以有效地对乙肝患者的HBV核酸样本进行检测，可检测的HBV核酸样本滴度可低至102IUml。方案二：1、对108IUml标准品，标准品选自含有待检测序列的定点突变人工质粒，进行梯度稀释至107IUml、106IUml、105IUml、104IUml、103IUml、102IUml、10IUml。2、分别使用如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对以及如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对对稀释后的标准品进行扩增，针对不同的样品使用带有不同标签序列的引物。本实例中，针对10个样品检测上述两个片段所包含的多个耐药相关突变位点，采用标签序列区分样本，因此，第三引物、第五引物有10个标签序列，这10个标签序列如SEQIDNO：9——SEQIDNO：18所示，第四引物、第六引物有1个标签序列，这1个标签序列如SEQIDNO：33所示，每个样本有唯一的标签序列组合。该步骤的PCR扩增体系如表12所示。表12PCR扩增体系PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s,57℃退火30s,72℃延伸1min，共扩增18个循环；最终72℃延伸5min。由此，获得PCR产物。后续步骤如：PCR扩增产物确认、PCR产物回收、测序文库的获得、纯化、文库质检定量、数据分析等与实施例1的步骤一样。数据分析结果如表13所示。表13所测片段每个突变位点的突变情况的分析结果结论：采用方案二的操作步骤可以检测浓度为105IUml的样品。实施例3本实施例是采用两种方案对梯度稀释的标准品进行检测的，标准品选自含有待检测序列的定点突变人工质粒，具体操作步骤如下：方案一：1、对108IUml标准品进行梯度稀释至107IUml、106IUml、105IUml、104IUml、103IUml、102IUml、10IUml。2、采用实施例1的操作步骤对上述梯度稀释后的标准品进行检测，其中，在步骤3的PCR扩增时，针对8个样品检测上述两个片段所包含的多个耐药相关突变位点，采用标签序列区分样本，因此，第三引物、第五引物有8个标签序列，这8个标签序列如SEQIDNO：9——SEQIDNO：16所示，第四引物、第六引物有1个标签序列，这1个标签序列如SEQIDNO：33所示，每个样本有唯一的标签序列组合，结果如表14所示。表14所测片段每个突变位点的突变情况的分析结果结论：采用方案一的操作步骤可以检测浓度为102IUml的样品。方案二：1、对108IUml标准品，标准品选自含有待检测序列的定点突变人工质粒，进行梯度稀释至107IUml、106IUml、105IUml、104IUml、103IUml、102IUml、10IUml。2、采用实施例1的操作步骤对上述梯度稀释后的标准品进行检测，其中，使用如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的第四引物对替代实施例1的步骤2的第一引物对，对上述标准品进行扩增。PCR扩增体系如表15所示。表15PCR扩增体系PCR的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸1min，共扩增35个循环；最终72℃延伸5min。由此，获得第一扩增产物。后续步骤如：步骤3的PCR扩增、PCR扩增产物确认、PCR产物回收、测序文库的获得、纯化、文库质检定量、数据分析等与实施例1的步骤一样。数据分析结果如表16所示。表16所测片段每个突变位点的突变情况的分析结果结论：采用方案二的操作步骤可以检测浓度为104IUml的样品。综上所述，采用实施例1的检测方法可以检测到低滴度样本的多个位点低比例的突变状况，具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点。所述特异性引物对和标签可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

权利要求：1.一种非诊断目的的基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：A：提取检测样本中的HBV基因组DNA；B：使用第一引物对，对所述HBV基因组DNA进行扩增，以得到第一扩增产物；C：使用第二引物对和第三引物对，扩增所述第一扩增产物，得到第二、三扩增产物；D：使用Illumina通用引物对对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；E：对所述测序文库进行质检定量；F：上机测序得到测序结果；G：数据分析得到耐药位点及分型相关信息，其中，第一引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，第二引物对的序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，第三引物对的序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：5所示的引物均包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQIDNO：9-32所示的一种或多种核苷酸序列，如SEQIDNO：4和如SEQIDNO：6所示的引物均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQIDNO：33-56所示的一种或多种核苷酸序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对步骤D的测序文库进行分离纯化的步骤，分离纯化的方法选自琼脂糖凝胶纯化、磁珠纯化和纯化柱纯化等中的至少一种。4.一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒，其特征在于，包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对、如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对、如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对。5.如权利要求4所述的基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒，其特征在于，如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：5所示的引物包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQIDNO：9-32所示的一种或多种核苷酸序列，如SEQIDNO：4和如SEQIDNO：6所示的引物均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQIDNO：33-56所示的一种或多种核苷酸序列。6.一种如权利要求4或5所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态。7.一种检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的系统，其特征在于，包括：扩增装置，用于利用如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对对核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；再用于利用如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对、如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对对第一扩增产物进行扩增，以获得到第二、三扩增产物；然后再用于利用如SEQIDNO：57和SEQIDNO：58所示的Illumina通用引物对对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；测序装置，与扩增装置相连，并且适于对扩增产物进行测序，以便得到测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变；分析装置，与测序装置相连，用于基于测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。8.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的特异性引物对，其特征在于，包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第一引物对、如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第二引物对、如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第三引物对。9.如权利要求8所述的特异性引物对，其特征在于，如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：5所示的引物包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQIDNO：9-32所示的一种或多种核苷酸序列，如SEQIDNO：4和如SEQIDNO：6所示的引物均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQIDNO：33-56所示的一种或多种核苷酸序列。

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