申请/专利权人：重庆医科大学

申请日：2020-10-27

公开（公告）日：2022-05-13

公开（公告）号：CN114480592A

主分类号：C12Q1/6858

分类号：C12Q1/6858

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2022.07.05#实质审查的生效;2022.05.13#公开

摘要：本专利基于磁性纳米富集技术和传统PCR技术改造后获得一种经济、简便、高效单链靶基因的获取方法；采用UDG介导PCR技术来获得检测探针，解决探针化学合成技术长度的限制；采用链置换反应技术来提高靶基因与检测探针反应的特异性，实现对靶基因的特异检测。当样本为突变型靶基因时，能够与检测探针自发的发生链置换反应，荧光信号迅速增高；当为野生型靶基因时，由于存在不匹配位点，影响链置换反应的热力学和动力学，故不利于与长链检测探针产生链置换过程，荧光信号增长缓慢。分析荧光曲线图的结果，便可快速对样本进行基因分型。

主权项：1.一种基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术，其方法包括以下步骤：1、磁性纳米粒子的制备取一定量的六水合氯化铁和七水硫酸亚铁，将其溶解于除氧的超纯水18.2MΩcm，25℃中，混合均匀形成Fe3+:Fe2+摩尔比为1.75:1的反应液；在连续搅拌及N2保护下，缓慢滴加适量的氨水溶液NH3-H2O，28.0％～30.0％直到最终PH接近10，反应液由原来的橙红色变为黑色，然后升温至80℃再孵育30min；反应结束后，黑色沉淀物用磁铁分离，然后用超纯水和无水乙醇交替洗涤5次，最后得到Fe3O4固体，于80℃的真空烘箱中干燥至恒重，密封保存以备后续使用。2、磁珠联合不对称PCR富集单链靶基因使用Primer-BLAST根据不对称PCR的原则设计引物，并将上游引物的5`端用生物素标记；按照PCRMasterMix10μl、模板1μl、上下游引物各1μl浓度比为5:1，用ddH20补充至20μl配制反应体系；按下列条件进行PCR：步骤一，95℃预变性30s；步骤二，95℃10s，60℃30s，重复步骤二39次；将PCR产物与0.5mg标记有链霉亲和素的磁珠混合，孵育5min；5min后，通过施加外部磁场分离磁珠，然后用洗涤缓冲液洗涤，以去除蛋白质和盐污染，最终将单链靶基因富集在纳米磁珠表面。3、UDG介导PCR获得与靶基因长度匹配的长链检测探针利筛选获取含不同基因型靶基因的细胞，利用DNA吸附柱快速提取DNA，并用NANO-DROP1000型紫外分光光度计验证；将PCR上游引物中dTTP用dUTP代替，下游引物则标记上荧光基团FAM，PCR反应底物为dATP，dTTP，dCTP和dGTP和高保真DNA聚合酶；按照普通PCR的反应条件，进行扩增反应；PCR产物与1U的UDG酶在Reactionbuffer200mMTris-HCl、pH8.2、10mMEDTA、100nMNacl中混合,50℃孵育5min；5min后，产物按照1:5的比例与上样缓冲液混合，进行12％的非变性PAGE分析，并通过切胶仪切下切下相应的产物条带；使用EZ-10柱式DNA纯化试剂盒生工，中国进行纯化，最终获得纯化后的长链检测探针。4、通过链置换反应检测SNPs将获得的具有Toehold位点的长检测探针与富集有单链靶基因的磁性纳米粒子在均相溶液中充分反应；经过磁性分离后，通过荧光分光光度计对上清液的荧光信号进行检测，从而实现临床样本中SNPs的准确快速检测。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 重庆医科大学 基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术

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