申请/专利权人：江苏省家禽科学研究所

申请日：2018-01-11

公开（公告）日：2022-05-24

公开（公告）号：CN110157819B

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/42

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.05.24#授权;2019.09.17#实质审查的生效;2019.08.23#公开

摘要：本发明公开了一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒，所述的试剂盒包括：LAMP缓冲液，BstDNA聚合酶，dNTPs，荧光染料，LAMP检测引物组，阳性对照与阴性对照。本发明试剂盒可用于快速检测畜禽粪便中的印第安纳沙门氏菌。该试剂盒实现结果判定可视化，根据反应结束后颜色的差异，即可判定结果，具有快速、简单、特异性强、灵敏度高、适合现场检测的优点。

主权项：1.一种检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1）LAMP缓冲液；2）BstDNA聚合酶；3）dNTPs；4）荧光染料：SYBRGreenI；5）LAMP检测引物组：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，所述的外引物F3序列如SEQIDNO.1所示，所述外引物B3的序列如SEQIDNO.2所示，所述的内引物FIP序列如SEQIDNO.3所示，所述内引物B3的序列如SEQIDNO.4所示；6）阳性对照：印第安纳沙门菌标准株ATCC51959基因组DNA；7）阴性对照：灭菌双蒸水。

全文数据：一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒技术领域本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒。背景技术印第安纳沙门氏菌SalmonellaIndiana在我国新兴流行的一种沙门氏菌血清型，目前在包括人、动物、食品和环境等不同来源中均具有较高的流行率，已成为仅次于肠炎沙门氏菌的流行血清型，超越了其它多种传统流行血清型。人畜感染印第安纳沙门氏菌可引起呕吐、腹泻、发烧、胃肠炎、局部感染等多种病症。抗生素是临床防治沙门氏菌的主要措施，研究表明近年来国内分离的印第安纳沙门氏菌普遍具有强耐药性，临床的调研数据表明常规抗生素如氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类、头孢类、氨基糖苷类、四环素类等药物已不能防控该病原。通过检测养殖场畜禽粪便中是否含有印第安纳沙门氏菌，可以及早发现病原，进而科学指导临床用药，具有重要意义。国内外对于印第安纳沙门氏菌的检测标准都是基于传统培养结合血清学分型的方法，其缺陷包括：1操作烦琐耗时，通常需要4-6天，完全不能满足病原监测与疾病防控需求；2灵敏度较低，当样品中沙门氏菌含量较低时，易造成假阴性结果；3准确性不高，尤其是加工食品中的沙门氏菌因表型不典型，出现假阴性结果。因此，如何提高印第安纳沙门氏菌检出率,缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因等抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品安全与公共卫生具有重要的意义。随着分子生物学的不断发展，对病原微生物的检测不再局限于形态学、生物化学、血清学等方面检验上，已发展到从分子水平上检测病原核酸和蛋白质等生物大分子。目前出现的免疫荧光、酶联免疫、放射免疫、PCR、斑点杂交、基因芯片等，虽然可以缩短检测时间，但需要配备专用设备，操作复杂，仍不能满足临床快速检测的要求。环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification，LAMP是一种新型核酸快速检测方法，其特点能在等温条件下、快速特异地扩增靶序列，同时通过添加荧光染料可实现肉眼直接进行结果判定。该技术在保持传统PCR技术优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时缩短了检测时间，已被用于多种病原微生物的检测，具有良好的发展前景。发明内容本发明针对传统技术在印第安纳沙门氏菌快速检测中存在的不足，针对畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的特点，经过创造性的研究，提供一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒。本发明技术方案如下：本发明提供了一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒，所述试剂盒包括10×LAMP缓冲液、8000UmLBstDNA聚合酶、10mMdNTPs、10×SYBRGreenI、LAMP检测外引物F3和B3、LAMP检测内引物FIP和BIP、阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为印第安纳沙门菌标准株ATCC51959基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水。进一步的，所述的外引物F3和B3序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述的内引物FIP和BIP序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。进一步的，所述的10×LAMP缓冲液含有200mMTris-HClpH8.8，25℃、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。进一步的，所述LAMP试剂盒的检测反应体系为：每25μL反应液中，10×LAMP缓冲液2.5μL，BstDNA聚合酶1μL，dNTPs3.5μL，10×SYBRGreenI2.5μL，F3和B3各1μL，FIP和BIP各1μL，待检样品DNA3μL以及适量的灭菌双蒸水。进一步的，所述LAMP试剂盒的检测方法为：将含反应体系的离心管置于恒温环境，65℃反应50min，并在80℃持续10min后取出；肉眼观察反应液变混浊说明含有印第安纳沙门氏菌，如澄清说明不含印第安纳沙门氏菌；或观察颜色变化，颜色变为绿色说明含有印第安纳沙门氏菌，颜色仍为橙色说明不含印第安纳沙门氏菌；或使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，出现特异性梯状条带说明含有印第安纳沙门氏菌，未出现梯状条带说明不含印第安纳沙门氏菌。相比于现有技术，本发明的有益效果为：1快速高效：整个扩增可在1h内完成，扩增产量可达109～1010个拷贝靶序列；2操作便捷：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一台水浴锅即可完成检测；3特异性强：本发明根据印第安纳沙门氏菌特有基因序列设计的特异性检测引物组，应用上述引物组，只能扩增印第安纳沙门氏菌基因组，而对其它血清型沙门氏菌和非沙门氏菌病原的扩增结果均为阴性；4高灵敏度：对畜禽粪便样品中印第安纳沙门氏菌的最低检测极限可达到60cfu反应，比普通PCR高1个数量级；5可用于临床检测：通过肉眼观察，如肉眼观察反应液变混浊说明含有印第安纳沙门氏菌，如澄清说明不含印第安纳沙门氏菌；或观察颜色变化，颜色变为绿色说明含有印第安纳沙门氏菌，颜色仍为橙色说明不含印第安纳沙门氏菌；6可指导临床抗生素合理使用：对印第安纳沙门氏菌检测阳性的养殖场，可以使用氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类、头孢类、氨基糖苷类、四环素类等常规抗生素以外的药物进行防控，有效降低药物筛选工作量。本发明根据印第安纳沙门氏菌特有的基因序列设计LAMP检测引物组，具有灵敏度高，特异性强的优点，与传统的印第安纳沙门氏菌血清学分型与PCR检测方法相比，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于临床批量检测。附图说明图1为印第安纳沙门氏菌LAMP检测结果的凝胶电泳展示图；图2为印第安纳沙门氏菌LAMP检测结果的可视化判定图，左侧为绿色，右侧为橙色。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。实施例1检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌LAMP引物的设计根据GenBank数据库中已知的沙门氏菌全基因组DNA序列，通过比较基因组学筛选印第安纳沙门氏菌的特有基因序列，按照LAMP反应的原理进行引物组的设计，结果优化得到两组引物对，其中F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，具体引物序列如表1所示。表1畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌LAMP检测引物序列引物名称引物序列5’-3’SEQIDF3TCAATAATGTTTTTTGCCCATAGNO.1B3TCCATTCAAACATGGTAGTTTCNO.2FIPGAACATCCGAAGTTGATGAAAAGTTGGCATCTGACAAAGAAGTGNO.3BIPACCACTCGAAAAGAATACGAAAAGAGAATTTCACATTCTTCGAACTCNO.4实施例2畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌LAMP检测方法的建立1、LAMP检测模板制备将印第安纳沙门氏菌ATCC51959在TSB肉汤培养基中培养12h，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取沙门氏菌标准菌株基因组，作为待检模板。2、LAMP检测试剂的配制110×LAMP缓冲液：包含200mMTris-HClpH8.8，25℃、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。28000UmLBstDNA聚合酶；310mMdNTPs；4LAMP引物外引物浓度均为5pmolμL，内引物浓度均为40pmolμL；5荧光染料：10×SYBRGreenI；6阳性对照：印第安纳沙门氏菌ATCC51959基因组DNA；7阴性对照：灭菌双蒸水。3、LAMP检测体系经反复筛选与优化后，得到磺胺类药物耐药基因三重LAMP检测体系如表2所示。表2检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP反应体系试剂剂量10×LAMPbuffer2.5μLF31μLB31μLFIP1μLBIP1μLBstDNA聚合酶1μLdNTPs3.5μL10×SYBRGreenI2.5μL模板DNA3μL灭菌双蒸水8.5μL4、LAMP反应条件与结果的判定将LAMP反应体系配制于PCR管中，充分混匀后置于恒温环境水浴锅或PCR反应仪65℃反应50min，并在80℃维持10min，取出。反应结束后使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现特异的梯状条带如图1，印第安纳沙门氏菌LAMP检测结果的凝胶电泳展示图，阴性则无此现象。也可用肉眼观察，阳性菌株颜色变为绿色如图2左侧，阴性菌株颜色为橙色如图2右侧，印第安纳沙门氏菌LAMP检测结果的可视化判定图。实施例3特异性评价用实施例2的方法进行本发明LAMP检测方法的特异性评价，将试验菌株过夜培养后，用煮沸法提取基因组DNA，按照实施例2所述方法进行LAMP检测，结果如表3所示，只有印第安纳沙门氏菌为阳性反应，其它血清型沙门氏菌以及非沙门氏菌菌株均为阴性结果。所用菌株及菌株编号如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性；“－”表示阴性。表3特异性评价结果菌株名称菌株编号检测结果印第安纳沙门氏菌ATCC51959+鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028－纽波特沙门氏菌ATCC6962－肠炎沙门氏菌ATCC13076－鸡伤寒沙门氏菌ATCC10398－山夫登堡沙门氏菌CMCC50050－亚利桑那沙门氏菌CMCC50166－火鸡沙门氏菌CMCC50329－科特布斯沙门氏菌CMCC50123－都柏林沙门氏菌CMCC50042－雷丁沙门氏菌CMCC50103－德比沙门氏菌CMCC50112－甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50001－埃森沙门氏菌CMCC50720－吉夫沙门氏菌CMCC50773－鸭沙门氏菌CMCC50774－猪霍乱沙门氏菌CICC21493－鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015－明尼苏达沙门氏菌CMCC50061－海德尔堡沙门氏菌CMCC50111－婴儿沙门氏菌CMCC50348－汤卜逊沙门氏菌CMCC50023－巴雷利沙门氏菌CMCC50740－圣地亚哥沙门氏菌CMCC50716－加明那拉沙门氏菌CMCC50141－鸡伤寒沙门氏菌CMCC50770－肠炎沙门氏菌CMCC50041－圣保罗沙门氏菌CICC21486－波茨坦沙门氏菌CICC21500－布洛克利沙门氏菌CICC21489－肯塔基沙门氏菌CICC21488－阿贡纳沙门氏菌CICC21586－巴森海德沙门氏菌CICC21587－禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801－奇异变形杆菌ATCC12453－大肠埃希氏菌ATCC25922－金黄色葡萄球菌ATCC25923－铜绿假单胞菌ATCC27853－宋内氏志贺氏菌ATCC9290－空肠弯曲杆菌ATCC12022－肺炎克雷伯氏菌ATCC700603－实施例4灵敏度评价实验用实施例2的方法进行本发明LAMP检测方法的敏感性评价。将印第安纳沙门氏菌ATCC51959在TSB肉汤培养基中培养12h，测定菌液原始浓度后10倍梯度稀释，将稀释后的菌液分别与不含印第安纳沙门氏菌的鸡粪便混合，再用商品化的粪便基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，分别使用本发明的LAMP方法和普通PCR方法使用本发明中的F3和B3作为检测引物进行灵敏度评价试验。结果表明，本发明的LAMP检测方法对粪便中印第安纳沙门氏菌的最低检出限为60cfu反应，而普通PCR方法灵敏度为600cfu反应，说明本方法具有较高的检测灵敏度。实施例5检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒的组装使用下列成分组成用于畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌LAMP检测试剂盒：LAMP检测引物组根据表1中序列合成引物，用灭菌双蒸水稀释混合，其中外引物浓度为5pmolμL，内引物浓度为40pmolμL；10×LAMP缓冲液其组分包括200mMTris-HCl、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100；8000UmLBstDNA聚合酶；10mMdNTPs；10×SYBRGreenI；印第安纳沙门氏菌ATCC51959基因组DNA；灭菌双蒸水。将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等，组装成本发明所述的畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌LAMP检测试剂盒。实施例6临床样品检测从农贸市场和畜禽养殖场采集鸡、鸭、鹅、鸽、猪等畜禽粪便样品，接种于SBG增菌液中，37℃培养24h，使用商品化的粪便基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，按照实施例2中的方法进行LAMP检测，同时设置阳性对照和阴性对照。同时按照沙门氏菌检验国家标准GB4789.4-2016中的方法进行沙门氏菌分离鉴定与血清学分型。结果如表4所示，在采集的295份临床粪便样品中，本发明提供的LAMP方法检出32例阳性，而国标检测方法共检出31例阳性，且采用国标方法检出的阳性样品在本发明的LAMP方法中均为阳性。上述结果表明本发明试剂盒所建立的检测方法在临床实际检测中的灵敏度高于传统细菌学检测方法。此外沙门氏菌国标检测方法GB4789.4-2016所需时间为4-5天，采用本发明试剂盒检测全程所用时间不足2小时。表4临床样品中印第安纳沙门氏菌的检测结果以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。序列表江苏省家禽科学研究所一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒2018-01-114SIPOSequenceListing1.0123DNASalmonellaIndiana1tcaataatgttttttgcccatag23222DNASalmonellaIndiana2tccattcaaacatggtagtttc22344DNASalmonellaIndiana3gaacatccgaagttgatgaaaagttggcatctgacaaagaagtg44447DNASalmonellaIndiana4accactcgaaaagaatacgaaaagagaatttcacattcttcgaactc47

权利要求：1.一种检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1LAMP缓冲液；2BstDNA聚合酶；3dNTPs；4荧光染料：SYBRGreenI；5LAMP检测引物组：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，所述的外引物F3和B3序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述的内引物FIP和BIP序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；6阳性对照：印第安纳沙门菌标准株ATCC51959基因组DNA；7阴性对照：灭菌双蒸水。2.根据权利要求1所述的一种检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述的LAMP缓冲液含有Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、甜菜碱和曲拉通X-100。3.根据权利要求1所述的一种检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：外引物F3和B3浓度为5pmolμL，内引物FIP和BIP浓度为40pmolμL。4.根据权利要求1所述的一种检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：该LAMP试剂盒的检测反应体系为：每25μL反应液中包括10×LAMP缓冲液2.5μL，BstDNA聚合酶1μL，dNTPs3.5μL，10×SYBRGreenI2.5μL，F3和B3各1μL，FIP和BIP各1μL，待检样品DNA3μL，其余为灭菌双蒸水。5.权利要求1～4任意一项所述的检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的LAMP试剂盒在检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：该LAMP试剂盒的检测方法为：将含反应体系的离心管置于恒温环境，65℃反应50min，并在80℃持续10min后取出；肉眼观察反应液是否变混浊；如反应液澄清说明不含印第安纳沙门氏菌；进一步观察颜色变化，颜色变为绿色说明含有印第安纳沙门氏菌，颜色为橙色说明不含印第安纳沙门氏菌。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：该LAMP试剂盒的检测方法为：将含反应体系的离心管置于恒温环境，65℃反应50min，并在80℃持续10min后取出；使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，出现特异性梯状条带说明含有印第安纳沙门氏菌，未出现梯状条带说明不含印第安纳沙门氏菌。

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