申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2019-01-30

公开（公告）日：2022-07-12

公开（公告）号：CN109652421B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;A01K67/027

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.07.12#授权;2019.05.14#实质审查的生效;2019.04.19#公开

摘要：本发明提供了靶向编辑羊繁殖负调控基因NPFFR1的sgRNA及其编码DNA和应用，属于CRISPRGas9技术领域。本发明的sgRNA序列如SEQIDNO.1所示，转录所述sgRNA序列的DNA序列如SEQIDNO.2所示。本发明提供的sgRNA能特异识别羊NPFFR1基因，引导Cas9核酸内切酶高效切割编码区，打靶效率在90％以上。基于本发明提供的sgRNA构建Cas9sgRNA表达系统可实现在细胞或个体水平上对羊NPFFR1基因进行靶向修饰，用于研究羊繁殖调控基因功能及培育新品种基因编辑羊。

主权项：1.SEQIDNO.1所示的sgRNA或含有SEQIDNO.2所示DNA序列的打靶载体在特异识别和靶向修饰羊NPFFR1基因第六外显子中的应用。

全文数据：靶向编辑羊繁殖负调控基因NPFFR1的sgRNA及其编码DNA和应用技术领域本发明涉及基因工程领域，特别是CRISPRGas9技术领域领域，具体地说，涉及特异靶向羊NPFFR1基因的sgRNA及其编码DNA和应用。背景技术动物繁殖是一个十分复杂的生理过程，其受诸多因素的调控，下丘脑-垂体-性腺轴是调控繁殖最重要的轴线。哺乳动物进入初情期后，下丘脑以脉冲的形式释放促性腺激素释放激素gonadotropinreleasinghormone,GnRH到垂体门脉系统，然后到达腺垂体，分别促进促卵泡激素follicle-stimulatinghormone,FSH和促黄体生成素luteinizinghormone，LH的合成和释放，这两种促性腺激素到达卵巢后，协同促进卵泡发育、成熟及排卵。排出卵子的数量直接决定了动物的繁殖效率。单胎动物每个发情周期往往只排出一个成熟的卵子，这样严重降低了其繁殖力，究其原因是非常复杂的，诸多因素参与调控这一过程，其中促性腺激素抑制激素gonadotropin-inhibitoryhormone,GnIH是最关键的负调控因子。其既能够直接抑制促性腺激素的合成与释放，又能间接作用于性腺，从而抑制配子发生。研究人员发现，免疫抑制动物机体内的GnIH能够促进更多的卵子发育成熟及排出，进而提高其繁殖力。NPFFR1为GnIH的天然受体，GnIH发挥作用离不开其受体，GnIH和NPFFR1结合后以自分泌或旁分泌的方式抑制生殖。NPFFR1基因在哺乳动物发情前期和间情期表达量最高，而在发情期表达量最低，表明NPFFR1是繁殖负调控的直接因子。2014年研究人员将小鼠的NPFFR1基因敲除后发现其后代平均产仔数显著增加且身体健康，进一步说明该基因的抑制状态解除后，GnRH信号通路促生殖效应得到加强。目前为止，在应用于生产的猪、牛、羊等大型家畜的基因编辑和分子育种中，研究最多的是肌肉生成抑制素myostatin,MSTN和成纤维细胞生长因子5fibroblastgrowthfactor5,FGF5基因的敲除。其中MSTN是肌肉生长的负调控因子，将其敲除后动物产肉量明显增加；FGF5对哺乳动物的毛发生长具有抑制作用，将其敲除后动物产毛量显著增加。受以上研究的启发，发明人试图通过类似的手段寻求一种能够增加大型家畜后代产仔羔、犊数的方法。除了猪是多胎外，牛和羊等家畜大都是单胎，若能使其产多胎，则对畜牧业生产意义重大。经过联合分析，最终选定NPFFR1基因为研究对象，如果大动物NPFFR1基因敲除后的表型与小鼠的近似，则其将成为继MSTN和FGF5基因之后又一对生产实践具有重要价值的基因。自最早的基因编辑技术锌指核酸酶ZFNs问世以来，新的基因编辑技术发展如火如荼，先后又诞生了转录激活因子类似效应因子核酸酶TALENs和RNA指导的CRISPRCas核酸酶系统。前两种技术是将DNA结合蛋白组件与核酸内切酶催化结构域连接，在特定的基因位点诱导靶向DNA双链断裂DSB，其构建过程均较为繁琐。CRISPR-Cas9是一种微生物适应性免疫系统，使用RNA引导的核酸酶切割DNA。相比于ZFN和TALEN，CRISPR-Cas9系统操作更简单，效率也更高。如果能筛选到高效且特异性靶向编辑NPFFR1基因的CRISPR-Cas的gRNA序列，引导Cas9核酸酶对该位点进行靶向编辑，就能为制备NPFFR1基因编辑羊和新品种培育提供有力的技术支撑。发明内容本发明的目的是提供一种高效且特异靶向羊NPFFR1基因的sgRNA及其应用。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：本发明首先提供了特异靶向羊NPFFR1基因的sgRNA，其RNA序列如SEQIDNO.1所示。具体地，转录所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO.2转录SEQIDNO.1。含有本发明所述sgRNA的CRISPRCas9打靶载体属于本发明的保护范围。进一步地，本发明提供了一种CRISPRCas9打靶载体，含有药物筛选标记puro。该筛选标记能够在短时间内富集更多的阳性细胞。优选地，在转染打靶载体时利用和打靶载体大小近似的带荧光的PX458比PX459大114bp载体做对照，能实时准确监测转染效率。采用核转染大分子量的打靶载体。本发明的实施例中，在检测打靶效率时采用直接TA克隆测序的方法，避免了利用T7E1和Surveyor酶切时会出现假阳性结果的可能性。本发明提供了所述sgRNA或含有其的CRISPRCas9打靶载体在特异识别和靶向修饰羊NPFFR1基因中的应用。进一步地，所述靶向修饰为基因敲除、基因转入或定点过表达内源基因。本发明提供了所述sgRNA或含有其的CRISPRCas9打靶载体在在制备转基因动物或动物种质资源改良中的应用。本发明提供了所述sgRNA或含有其的CRISPRCas9打靶载体在在构建羊NPFFR1基因突变库中的应用。本发明提供了所述sgRNA或含有其的CRISPRCas9打靶载体在培育新品种基因编辑羊的应用。本发明提供了一种产多胎转基因动物的制备方法，包括将含有本发明所述sgRNA的CRISPRCas9打靶载体注射入动物受精卵细胞质或细胞核中，然后经体外短时培养后移植入同种雌性动物输卵管中，或体外培养至囊胚期移植到同种雌性动物子宫中，以生产能产多胎的转基因动物。本发明提供的sgRNA1RNA序列如SEQIDNO.1，DNA序列如SEQIDNO.2能高效的识别羊NPFFR1基因第六外显子，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割，引导Cas9核酸内切酶高效切割编码区，打靶效率在90％以上。基于本发明提供的sgRNA构建Cas9sgRNA表达系统可实现在细胞或个体水平上对羊NPFFR1基因进行靶向修饰，用于研究羊繁殖调控基因功能及培育新品种基因编辑羊，进而培育产多胎的转基因羊。附图说明图1为羊NPFFR1基因打靶示意图。图2为本发明打靶载体酶切电泳图。图3NPFFR1-sgRNA1载体连接后测序比对结果。方框标出部分为100％正确连接。深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图4NPFFR1-sgRNA2载体连接后测序比对结果。方框标出部分为100％正确连接。深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图5NPFFR1-sgRNA3载体连接后测序比对结果。方框标出部分为100％正确连接。深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图6NPFFR1-sgRNA4载体连接后测序比对结果。方框标出部分为100％正确连接。深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图7NPFFR1-sgRNA5载体连接后测序比对结果。方框标出部分为100％正确连接。深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图8NPFFR1-sgRNA6载体连接后测序比对结果。方框标出部分为100％正确连接。深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图9载体核转染效果图。图10绵羊胎儿成纤维细胞药筛效果图。图11sgRNA1-3靶点附近序列的PCR扩增电泳图。图12sgRNA4-6靶点附近序列的PCR扩增电泳图。图13sgRNA1-2,sgRNA4-6靶点PCR产物测序结果图。图14第一次试验sgRNA1靶位点的TA克隆测序结果。图14A，图14B，图14C，图14D，图14E分别代表sgRNA1靶点五种不同的Indel类型，图14F为未发生突变的TA克隆。序列比对结果中虚线代表碱基删除，深色突出显示表示碱基插入，方框圈出的序列为sgRNA或PAM序列。图15第二次试验sgRNA1靶位点的TA克隆测序结果。图15A，图15B，图15C，分别代表sgRNA1靶点三种不同的Indel类型，图15D为未发生突变的TA克隆。序列比对结果中虚线代表碱基删除，深色突出显示表示碱基插入，方框圈出的序列为sgRNA或PAM序列。图16第三次试验sgRNA1靶位点的TA克隆测序结果。图16A，图16B，图16C，图16D分别代表sgRNA1靶点四种不同的Indel类型，图14E为未发生突变的TA克隆。序列比对结果中虚线代表碱基删除，深色突出显示表示碱基插入，方框圈出的序列为sgRNA或PAM序列。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1sgRNA表达载体的构建从NCBI中调取羊NPFFR1基因序列XM_015104295.1，根据sgRNA的筛选原则，筛选出PAM序列及对应的sgRNA靶点，其PAM基序为NGG。一共设计了6个sgRNA靶位点，分别为sgRNA1,sgRNA2,sgRNA3,sgRNA4,sgRNA5,sgRNA6,打靶位置如图1所示，其中，sgRNA1序列中识别该靶点的核苷酸序列如序列表中序列SEQIDNO.1所示；编码该上述序列的DNA序列如序列表中的SEQIDNO.2所示。根据上述六个靶点序列，设计相应的引物序列，由生工生物公司合成，纯化方式为HPLC，具体序列见表1。表1羊NPFFR1基因打靶序列引物核苷酸名称序列5′to3′Ovisaries-sgRNA1-FcaccgTTCAACGAGAACTTCCGCCGOvisaries-sgRNA1-RaaacCGGCGGAAGTTCTCGTTGAAcOvisaries-sgRNA2-FcaccgTGCTGCTCCTCATCGACTACOvisaries-sgRNA2-RaaacGTAGTCGATGAGGAGCAGCAcOvisaries-sgRNA3-FcaccGTGATGCTCCTCGCGCGTGAOvisaries-sgRNA3-RaaacTCACGCGCGAGGAGCATCACOvisaries-sgRNA4-FcaccgTTGCACGTGGCGTTGTCGAAOvisaries-sgRNA4-RaaacTTCGACAACGCCACGTGCAAcOvisaries-sgRNA5-FcaccgCTTGCACGTGGCGTTGTCGAOvisaries-sgRNA5-RaaacTCGACAACGCCACGTGCAAGcOvisaries-sgRNA6-FcaccgACGGTCAGCGTGACGGCCGAOvisaries-sgRNA6-RaaacTCGGCCGTCACGCTGACCGTcOlio的形成：将引物稀释成100微摩，磷酸化退火，体系：sgRNAup100微摩1μL，sgRNAdown100微摩1μL，T4ligationbuffer,10×，1μL，T4PNK1μL，ddH2O6μL，总体积10μL。程序如下：37℃30min；95℃5min；PCR仪内每分钟降5℃-25℃。结束后250倍稀释，载体酶切。酶切产物跑0.8％的琼脂糖凝胶电泳见图2。16℃连接过夜。连接反应结束后，使用PlasmidSafeexonuclease去除线性DNA残基。37℃30min,70℃30min。之后保存到-20℃，可保存至少一周。该步骤结束后的产物可直接用于转化大肠杆菌，推荐使用Stbl3感受态。采取热击的方法：取2ulPlasmidSafe后的质粒，加入到20ul感受态中，冰上10min，热击42℃，30s，立即置于冰上2min，加入100ulSOC，直接涂板。使用含有Amp100的LB平板。37℃过夜。第二天观察，对照板应无克隆，而含sgRNA插入的板中长有克隆。挑取单克隆摇菌12h,菌液送北京擎科生物公司进行测序。6个sgRNA靶点连接后的测序比对结果见图3，图4，图5，图6，图7，图8。加深标识的部分为sgRNA序列信息及其测序峰图结果，测序比对结果显示sgRNA成功连入载体。验证质粒构建正确后，大提质粒，进行后续转染细胞实验。实施例2细胞转染1、常规方法制备胎儿成纤维细胞。2、采用核转方式。使用核转染-AmaxaTMBasicNucleofectorTMKitforPrimaryMammalianFibroblastsLonza，采用NucleofectorTM2b的程序V-024进行转染，转染的步骤参见试剂盒说明书。对照组转染和PX459大小近似的带荧光的PX458载体做对照，能实时准确监测转染效率。转染情况见图9，由绿色荧光蛋白的发光程度可知对照组PX458载体的转染效率较高，相比之下，比PX458更小的不带荧光标记的PX459打靶载体的转染效率会更高。3、药物筛选-细胞转染48h后，使用puromycin进行筛选，以在最短时间内富集阳性细胞。筛选情况见图10，经过筛选后部分细胞因未转入PX459打靶载体而死亡，剩下活着的细胞大部分为表达puro的阳性细胞，这部分细胞最有可能发生基因编辑。实施例3本发明六个sgRNA打靶效率的验证1、靶点扩增引物利用PrimerPremier6.0设计引物。引物由北京生工生物有限公司合成，引物序列如表2所示:表2靶点扩增引物Primer名称序列5′to3′TargetSite1-FAACCGCTCCTACCCGCTCTACTTargetSite1-RCCACTGACAACTGCTCACTGCCTargetSite2-FGCCGTGCTCTTCTCGCATATCTACTargetSite2-RACTGACAACTGCTCACTGCCTTGTargetSite3-FCCCGAGCCTTCTTTGACACCTargetSite3-RGCACTGTTCCCCAAGATCGCTATargetSite4,5-FGGTAGAATGACAACCTAGCTCGACTargetSite4,5-RCCAGCAAGGAGGTCTACCACTargetSite6-FGGCCTACCCTTTTGTCTTGTTCCACTargetSite6-RCGCGTACATGACCACGATCAGC消化富集到的阳性细胞和未转染的野生型，用天根试剂盒提取DNA，利用上述引物进行PCR扩增，扩增体系为：3％DMSO，高保真DNA聚合酶PrimeSTARMAXDNAPolymeraseR045A，Takara0.5μl，dNTPmix2.5mMeach25μl，GCBufferIIRR02AG，Takara8μl，Forwardprimer1μl，Reverseprimer1μl，cDNA2μl,11.5μlH2O。扩增条件为：98℃预变性2min，98℃10s，65℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。使用1.5％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。靶点序列的PCR扩增电泳图见图11和图12，图11中的sgRNA3靶点处因为有gap存在，多次扩增均以失败告终。PCR产物纯化：电泳后将凝胶置于紫外灯下，将目的条带分离，回收提纯DNA，操作如下：1在紫外灯下分离目的凝胶片段，置于干净EP管中，称其质量。胶块体积换算公式:1μL＝lmg。2向EP管内加入3倍体积的DR-1Buffer，震荡混合后放入45℃水浴锅中使胶块充分溶解，时间为8-10min。3取出平衡柱SpinColumn和收集管CollectionTube，并按要求正确安置好。将2中溶液转入SpinColumn管内，而后12000rpm离心1min，重复离心一次。4吸取RinseA500μL加入到SpinColumn中，离心条件同上。5吸取已添加过无水乙醇RinseB700μL加入SpinColumn，离心条件同上，弃滤液，重复离心一次。6继续离心，条件不变，时间为2min。7取一新的CollectionTube，将SpinCohmm安放好，并向SpinColumn中加入Rnase-freeddH2025μL，室温条件下静置1-2min。812000rpm离心1min使得DNA洗脱到CollectionTube中，-20℃保存。产物纯化后送北京擎科公司测序，根据测序结果，将出现套峰的产物进行连接转化：1取一干净的EP管，使用移液器向其滴加T-Vector1μL，InsertDNA8μL，10×Enhancer1μL。混合均匀后常温反应3分钟。2将1的连接产物加到100μLDH5α感受态细胞中，轻微震荡后置于冰中30min左右，取出后42℃水浴1min，而后放置冰中约2min。3向2管内添加750mlLB液体培养基不含Amp，使用枪头靠管壁轻轻吹打混匀，而后置于37℃恒湿箱内150rmin培养60min。4取出后直接离心，2000rpm离心2min，抽取上清液使管内保留100μL左右，并用移液器吹打管内液体使其混匀。5将上述菌液涂抹在固体培养板上含Amp，37℃培养12-16h。6选取培养基上的单个菌落，将其接种于含Amp的LB液体培养中，37℃培养12h左右。PCR产物测序结果见图13，在5个靶点中本来是6个，其中sgRNA3扩增失败只有sgRNA1靶点出现了套峰，说明只有sgRNA1发挥了比较明显的切割作用。sgRNA1靶点PCR产物进行TA克隆。质粒提取：1将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10～15ul基础培养基氨苄西林培养介质的50ml培养瓶中。2室温下5000×g离心10min。3弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的SolutionIRNaseA，彻底混匀。4将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ulSolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降。5向4中液体加入250ul预冷的BufferN3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min可室温，最好4℃Buffer应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的。6小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1的比例向上清液中加入ETRSolution混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀加入ETRSolution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETRSolution将悬浮于溶液中。7将6中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。室温下12000×g离心3min，ETRSolution将于离心管底部形成蓝色层。8将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水乙醇室温，96～100％，轻柔混匀，室温下孵育1～2min。9将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。10重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。11将500ulBufferHB加入柱子中，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中废液目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的。12向柱子中加入混有乙醇的700ulDNAWashBuffer，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中液体。13重复12中的步骤。14弃去收集管中液体，空管在最大转速≥13000×g离心3min以干燥柱子对于移除柱子中残留的乙醇是必须的。15将柱子放入新的1.5ml离心管中，直接向柱子中的白色网状物上加入Endotoxin-FreeElutionBuffer80～100ul依终产物浓度而定，可每次30ul×2次，室温下放置2min，≥13000×g离心1min，以洗提DNA将提取约70～85％柱子中收集的DNA，可再重复一次以提取完全，但因再次加入洗提液，会使终产物浓度下降。质粒送北京擎科公司再次测序。试验重复三次，sgRNA1靶位点的TA克隆测序结果见图14-16。发明人遵照上段方法隔周对sgRNA1靶点PCR产物进行TA克隆，共进行3次重复实验，3次克隆的结果为：1如图14A-图14F所示，图中1#，2#等标记代表第1个克隆，第2个克隆，以此类推。在20个TA克隆里，有18个在靶点位置发生了Indel突变，其中产生了5种突变类型，因此，NPFFR1-sgRNA1的打靶效率为：1820＝90.00％。2如图15A-图15D所示，在17个TA克隆里，有16个在靶点位置发生了Indel突变，其中产生了3种突变类型，因此，NPFFR1-sgRNA1的打靶效率为：1617＝94.12％。3如图16A-图16E所示,在15个TA克隆里，有14个在靶点位置发生了Indel突变，其中产生了4种突变类型，因此，NPFFR1-sgRNA1的打靶效率为：14155＝93.33％。上述结果表明：本发明提供的sgRNA1RNA序列如SEQIDNO.1和DNA序列如SEQIDNO.2都能高效的识别羊NPFFR1基因第六外显子，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割，打靶效率达90％以上。此外，本发明提供的编码该sgRNA的DNA片段，能通过构建Cas9sgRNA表达系统实现在细胞或个体水平上对NPFFR1基因进行靶向修饰敲除或将其他目的基因敲入该位点，进而培育出新品种基因编辑羊。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表中国农业大学靶向编辑羊繁殖负调控基因NPFFR1的sgRNA及其编码DNA和应用KHP191110419.724SIPOSequenceListing1.0120RNA人工序列ArtificialSequence1cggcggaaguucucguugaa20220DNA人工序列ArtificialSequence2ttcaacgagaacttccgccg20325DNA人工序列ArtificialSequence3caccgttcaacgagaacttccgccg25425DNA人工序列ArtificialSequence4aaaccggcggaagttctcgttgaac25525DNA人工序列ArtificialSequence5caccgtgctgctcctcatcgactac25625DNA人工序列ArtificialSequence6aaacgtagtcgatgaggagcagcac25724DNA人工序列ArtificialSequence7caccgtgatgctcctcgcgcgtga24824DNA人工序列ArtificialSequence8aaactcacgcgcgaggagcatcac24925DNA人工序列ArtificialSequence9caccgttgcacgtggcgttgtcgaa251025DNA人工序列ArtificialSequence10aaacttcgacaacgccacgtgcaac251125DNA人工序列ArtificialSequence11caccgcttgcacgtggcgttgtcga251225DNA人工序列ArtificialSequence12aaactcgacaacgccacgtgcaagc251325DNA人工序列ArtificialSequence13caccgacggtcagcgtgacggccga251425DNA人工序列ArtificialSequence14aaactcggccgtcacgctgaccgtc251522DNA人工序列ArtificialSequence15aaccgctcctacccgctctact221622DNA人工序列ArtificialSequence16ccactgacaactgctcactgcc221724DNA人工序列ArtificialSequence17gccgtgctcttctcgcatatctac241823DNA人工序列ArtificialSequence18actgacaactgctcactgccttg231920DNA人工序列ArtificialSequence19cccgagccttctttgacacc202022DNA人工序列ArtificialSequence20gcactgttccccaagatcgcta222124DNA人工序列ArtificialSequence21ggtagaatgacaacctagctcgac242220DNA人工序列ArtificialSequence22ccagcaaggaggtctaccac202325DNA人工序列ArtificialSequence23ggcctacccttttgtcttgttccac252422DNA人工序列ArtificialSequence24cgcgtacatgaccacgatcagc22

权利要求：1.特异靶向羊NPFFR1基因的sgRNA，其RNA序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，转录所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求1-2任一所述sgRNA的CRISPRCas9打靶载体。4.如权利要求3所述的CRISPRCas9打靶载体，其特征在于，含有药物筛选标记puro。5.权利要求1-2任一所述的sgRNA或权利要求3-4任一所述的CRISPRCas9打靶载体在特异识别和靶向修饰羊NPFFR1基因的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述靶向修饰为基因敲除、基因转入或定点过表达内源基因。7.权利要求1-2任一所述的sgRNA或权利要求3-4任一所述的CRISPRCas9打靶载体在制备转基因动物或动物种质资源改良中的应用。8.权利要求1-2任一所述的sgRNA或权利要求3-4任一所述的CRISPRCas9打靶载体在构建羊NPFFR1基因突变库中的应用。9.权利要求1-2任一所述的sgRNA或权利要求3-4任一所述的CRISPRCas9打靶载体在培育新品种基因编辑羊的应用。10.一种产多胎转基因动物的制备方法，其特征在于，包括将权利要求3或4所述的CRISPRCas9打靶载体注射入动物受精卵细胞质或细胞核中，然后经体外短时培养后移植入同种雌性动物输卵管中，或体外培养至囊胚期移植到同种雌性动物子宫中，以生产能产多胎的转基因动物。

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