申请/专利权人：春发生物科技(宁夏)有限公司

申请日：2018-11-27

公开（公告）日：2022-11-18

公开（公告）号：CN109566852B

主分类号：C07K7/00

分类号：C07K7/00;A23J3/16;A23L27/24;A23L27/26

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.18#授权;2021.04.16#实质审查的生效;2019.04.05#公开

摘要：本发明涉及一种醇厚味呈味肽及其制备方法与应用，该呈味肽的序列为：Asp‑Glu‑Leu‑Leu‑Asn‑Ala‑ArgDELLNAR或Leu‑Asp‑Lys‑Asn‑Leu‑Phe‑ArgLDKNLFR。本发明结合生物发酵、超滤分离、凝胶层析、制备液相和质谱分析技术，分离纯化和鉴定两种新的醇厚味呈味肽，再以发酵所得的发酵基质为原料制备肉味香精。本发明一方面避免了豆粕蛋白资源的浪费，开辟了绿色环保的低值蛋白质资源的高效利用途径；另一方面通过美拉德反应制备肉味香精的研究，开拓含醇厚味呈味肽的发酵基质的利用途径。

主权项：1.一种醇厚味呈味肽，其特征在于：该呈味肽的序列为：Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ala-Arg或Leu-Asp-Lys-Asn-Leu-Phe-Arg。

全文数据：一种醇厚味呈味肽及其制备方法与应用技术领域本发明涉及食品领域，具体涉及用于食用香精产品的一种具有较强醇厚味的呈味肽的制备方法与应用。背景技术每一种食物都有其特征味道，而食物口味的呈现为其中各种味道化合物之间的综合平衡表现。呈味肽是指从食物中提取或由氨基酸合成得到的对食品风味具有一定贡献的分子质量低于5000D的寡肽类，包括特征滋味肽和风味前体肽。呈味肽不仅可直接对基本味产生贡献，还可以与其他风味物质如谷氨酸钠、肌苷酸钠、鸟苷酸钠、琥珀酸钠、醋酸钠、酸味剂等产生交互作用，明显提升或改变原有味感。呈味肽不但能产生特征滋味，还可以作为挥发性风味物质的前体物参与美拉德反应，形成特殊的芳香气味，通常所说的各种肽的呈味作用是其综合的效果。呈味肽的基本味感包括甜味、酸味、鲜味、咸味、苦味。除了传统的五大味觉，第六味----厚味Kokumi，也称醇厚味，浓厚味，在近几年已被人们发现并认识。日本研究者将能够引起滋味浓厚感与持久感的物质统称为Kokumi，这是继Umami鲜味后又一个创新的食品基本风味描述词汇。1997年，日本味之素株氏会社发现谷胱甘肽具有强烈增加食品“醇厚感”的特性，能够赋予浓缩牛肉汁中的Kokumi味；也有研究表明：γ-谷酰基肽是使肽类具有Kokumi感的关键；2012年在发酵的鱼酱和大豆酱中发现存在Kokumi滋味的短肽；另有研究发现，从河豚鱼中提取得到具有Kokumi感的八肽。能够引起食品中Kokumi感的肽类一般具有Glu、Asp或Cys，此类肽没有味道或者有轻微的味道，但在一定浓度下，这类肽与适当浓度的其他呈味组分盐、味精、酸味剂等有协同或者增味的功效。另外，通过对Kokumi感呈味机理的研究发现，其主要是通过钙敏感受体CaSR被人们感知，如谷胱甘肽和其他γ-谷酰基肽可刺激CaSR传递Kokumi感。由于Kokumi肽能够改善食品口感，增加原有滋味的强度，因此可以被利用开发为新型调味料或健康食品。发明内容本发明的目的在于提供一种具有醇厚味呈味肽及其制备方法与应用。本发明采用的技术方案为：本发明提供了一种醇厚味呈味肽，该呈味肽的序列为：Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ala-ArgDELLNAR或Leu-Asp-Lys-Asn-Leu-Phe-ArgLDKNLFR。本发明还提供了上述醇厚味呈味肽的制备方法，包括如下步骤：1原料的预处理将豆粕与等质量的炒小麦混合均匀，然后加入与物料同等质量的常温水浸泡1h至适度膨胀，然后沥干水，添加牛肉，其中牛肉的添加量为豆粕用量的40％，混合均匀后置于高压灭菌锅，121℃蒸煮灭菌15分钟，取出，冷却至室温；2制曲及发酵待原料冷却至室温，按接种量0.5％接入米曲霉，充分混合均匀；然后置于恒温通风培养箱中制曲，期间进行两次翻曲，待曲料疏松，长出黄绿色菌体即制得成曲；将制成的曲料放入发酵罐，加等质量的盐水拌匀，连续发酵30天，收集发酵产物，121℃灭菌15min即为发酵基质；3超滤分离将发酵基质离心取上清液，选取截留分子量为5KDa的超滤膜，采用Pellicon超滤系统进行分离，并取透过液冷冻干燥，得冻干粉组分DS-G；4凝胶层析分离将冻干粉DS-G溶于去离子水中，配成10mgmL的溶液，取1mL溶液上柱1.6cm×100cm，凝胶层析柱的填料为SephadexG-10葡聚糖凝胶树脂，用蒸馏水洗脱，收集时间段为30min～45min的流出液，冷冻干燥后得到组分DS-G-2。5反相高效液相色谱法RP-HPLC分离纯化呈味肽将冻干粉DS-G-2用蒸馏水配成5mgmL的溶液，用反相高效液相色谱系统进行分离，其中上液量为500ul，流动相A为含0.05％TFA的乙腈，流动相B为含0.05％TFA的水溶液，收集出峰时间为7.5min-8.5min之间的单峰组分R3，冷冻干燥成粉末；6质谱鉴定呈味肽将R3用去离子水溶解，取1ml样品经0.22μm膜过滤后用于质谱分析，最终鉴定得到两个呈味肽，序列分别为Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ala-Arg、Leu-Asp-Lys-Asn-Leu-Phe-Arg。优选地，所述步骤2的培养箱温度范围在30℃-35℃；培养湿度为80％-95％；两次翻曲时间设定为24小时与36小时；置于发酵罐中的盐水浓度为12％；发酵温度的范围为：35℃-42℃。优选地，所述步骤4的蒸馏水洗脱流速为0.8mlmin，波长检测为214nm。优选地，所述步骤5的洗脱条件为梯度洗脱15-25min流动相A液10–30％，流动相B液90–70％，流速10mLmin，以214nm波长检测。优选地，所述步骤6的质谱分析软件为PEAKSStudio软件，采用Denovo测序和数据库搜索匹配后，对一级质谱信号值较强且可信度较高的mz＝396.7750和mz＝453.2978的两个多肽进行二级质谱分析。本发明还提供了一种发酵基质，该发酵基质由包括如下步骤的方法制备得到：1原料的预处理将豆粕与等质量的炒小麦混合均匀，然后加入与物料同等质量的常温水浸泡1h至适度膨胀，然后沥干水，添加牛肉，其中牛肉的添加量为豆粕用量的40％，混合均匀后置于高压灭菌锅，121℃蒸煮灭菌15分钟，取出，冷却至室温；2制曲及发酵待原料冷却至室温，按接种量0.5％接入米曲霉，充分混合均匀；然后置于恒温通风培养箱中制曲，期间进行两次翻曲，待曲料疏松，长出黄绿色菌体即制得成曲；将制成的曲料放入发酵罐，加等质量的盐水拌匀，连续发酵30天，收集发酵产物，121℃灭菌15min即为发酵基质；其中培养箱温度范围在30℃-35℃；培养湿度为80％-95％；两次翻曲时间设定为24小时与36小时；置于发酵罐中的盐水浓度为12％；发酵温度的范围为：35℃-42℃。本发明还提供了上述发酵基质在用于制备美拉德反应型香精调味品中的应用，以提高产品的醇厚味和鲜味。本发明所具有的有益效果：本发明结合生物发酵、超滤分离、凝胶层析、制备液相和质谱分析技术，分离纯化和鉴定两种新的醇厚味呈味肽，再以发酵所得的发酵基质为原料制备肉味香精。本发明一方面避免了豆粕蛋白资源的浪费，开辟了绿色环保的低值蛋白质资源的高效利用途径；另一方面通过美拉德反应制备肉味香精的研究，开拓含醇厚味呈味肽的发酵基质的利用途径。附图说明图1为柱层析分离结果图；图2为层析分离组分的醇厚味评价结果；图3为反相高效液相色谱分离的结果图；图4为反相高效液相色谱分离组分的醇厚味评价结果；图5为Triple-TOF质谱仪对R-3的氨基酸序列进行分析的结果图；图6为两个呈味肽的氨基酸序列结构图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。实施例1取新鲜的牛肉剔除脂肪，准确称取1kg并用绞肉机搅碎备用，将豆粕2.5kg、炒小麦2.5kg二者混合均匀，在水中浸泡1小时后取出沥干水，与牛肉混合均匀。将制曲原料置于高压灭菌锅中，121℃灭菌15分钟，使蛋白质适度变性，取出冷却至室温。称量60g米曲霉分散于200g水中得到菌悬液，接种至原料中并搅拌混合均匀。然后，将接种后的曲料置于恒温32℃、恒湿95％的通风培养箱中进行培养，期间在24小时和36小时进行两次翻曲，当曲料变为均匀的淡黄绿色即为成曲。最后，将成曲放入发酵罐，配以浓度为12％的盐水10kg，搅拌均匀后，于40℃条件下密闭发酵10天，调整发酵温度至35℃，继续发酵20天。发酵结束后，收集发酵产物121℃灭菌15min即为发酵基质。将发酵基质离心8000rpm，取上清液，采用Pellicon超滤系统并选取截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，将分子量小于5KDa的透过液冷冻干燥后得冻干粉DS-G。接下来将冻干粉用离子水中配成10mgmL的溶液，取1mL溶液采用凝胶层析柱填料为SephadexG-10葡聚糖凝胶树脂进行分离，蒸馏水洗脱洗脱流速为0.8mlmin，波长检测为214nm，层析图谱见图1，分离得到的5个组分分别标注为DS-G-1、DS-G-2、DS-G-3、DS-G-4和DS-G-5。将各组分冷冻干燥后，配成浓度为1mgmL的水溶液，采用定量分析法对各组分进行感官评价。将超滤分离得到的DS-G溶液的醇厚味评分记为10分，对凝胶层析分离得到的5个组分的醇厚味与其比较并打分，其中DS-G-2具有较高的醇厚味，见图2。将收集的DS-G-2组分与蒸馏水配成5mgmL的溶液，上液量500ul用反相高效液相色谱系统进行分离，其中流动相A为含0.05％TFA的乙腈，流动相B为含0.05％TFA的水溶液。DS-G-2的分离情况如图3所示，共分离得到5个组分，分别为R1、R2、R3、R4和R5，收集各个组分冷冻干燥，配置成1mgml的水溶液，采用定量分析法进行感官评价。以DS-G-2溶液的醇厚味评分记为10分，将RP-HPLC分离得到的5个组分的醇厚味与其比较，如图4所示，得到醇厚味评分最高的组分R3，并进一步采用质谱进行分析鉴定呈味肽，结果如图5，6所示，鉴定得到两个呈味肽，分别为Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ala-ArgDELLNAR和Leu-Asp-Lys-Asn-Leu-Phe-ArgLDKNLFR。将发酵产物应用于酱牛肉风味香精的开发。取0.5kg发酵基质，与0.03kg葡萄糖、0.02kgD-木糖、0.005kg半胱氨酸、0.005kg谷氨酸、0.015kg牛肉、食用香料0.002kg大蒜粉、0.003大茴香和0.08kg的NaCl等反应原料混合，调节pH＝6，在美拉德反应釜中100℃反应1.5h，所得到的反应产物即为酱牛肉风味香精，其酱牛肉特征味明显，醇厚感强烈，且具有一定的鲜味。

权利要求：1.一种醇厚味呈味肽，其特征在于：该呈味肽的序列为：Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ala-Arg或Leu-Asp-Lys-Asn-Leu-Phe-Arg。2.权利要求1所述醇厚味呈味肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1原料的预处理将豆粕与等质量的炒小麦混合均匀，然后加入与物料同等质量的常温水浸泡1h至适度膨胀，然后沥干水，添加牛肉，其中牛肉的添加量为豆粕用量的40％，混合均匀后置于高压灭菌锅，121℃蒸煮灭菌15分钟，取出，冷却至室温；2制曲及发酵待原料冷却至室温，按接种量0.5％接入米曲霉，充分混合均匀；然后置于恒温通风培养箱中制曲，期间进行两次翻曲，待曲料疏松，长出黄绿色菌体即制得成曲；将制成的曲料放入发酵罐，加等质量的盐水拌匀，连续发酵30天，收集发酵产物，121℃灭菌15min即为发酵基质；3超滤分离将发酵基质离心取上清液，选取截留分子量为5KDa的超滤膜，采用Pellicon超滤系统进行分离，并取透过液冷冻干燥，得冻干粉组分DS-G；4凝胶层析分离将冻干粉DS-G溶于去离子水中，配成10mgmL的溶液，取1mL溶液上柱1.6cm×100cm，凝胶层析柱的填料为SephadexG-10葡聚糖凝胶树脂，用蒸馏水洗脱，收集时间段为30min～45min的流出液，冷冻干燥后得到组分DS-G-2；5反相高效液相色谱法RP-HPLC分离纯化呈味肽将冻干粉DS-G-2用蒸馏水配成5mgmL的溶液，用反相高效液相色谱系统进行分离，其中上液量为500ul，流动相A为含0.05％TFA的乙腈，流动相B为含0.05％TFA的水溶液，收集出峰时间为7.5min-8.5min之间的单峰组分R3，冷冻干燥成粉末；6质谱鉴定呈味肽将R3用去离子水溶解，取1ml样品经0.22μm膜过滤后用于质谱分析，最终鉴定得到两个呈味肽，序列分别为Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ala-Arg、Leu-Asp-Lys-Asn-Leu-Phe-Arg。3.根据权利要求2所述的醇厚味呈味肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2的培养箱温度范围在30℃-35℃；培养湿度为80％-95％；两次翻曲时间设定为24小时与36小时；置于发酵罐中的盐水浓度为12％；发酵温度的范围为：35℃-42℃。4.根据权利要求2所述的醇厚味呈味肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4的蒸馏水洗脱流速为0.8mlmin，波长检测为214nm。5.根据权利要求2所述的醇厚味呈味肽的制备方法，其特征在于：所述步骤5的洗脱条件为梯度洗脱15-25min流动相A液10–30％，流动相B液90–70％，流速10mLmin，以214nm波长检测。6.根据权利要求2所述的醇厚味呈味肽的制备方法，其特征在于：所述步骤6的质谱分析软件为PEAKSStudio软件，采用Denovo测序和数据库搜索匹配后，对一级质谱信号值较强且可信度较高的mz＝396.7750和mz＝453.2978的两个多肽进行二级质谱分析。7.一种发酵基质，其特征在于：该发酵基质由包括如下步骤的方法制备得到：1原料的预处理将豆粕与等质量的炒小麦混合均匀，然后加入与物料同等质量的常温水浸泡1h至适度膨胀，然后沥干水，添加牛肉，其中牛肉的添加量为豆粕用量的40％，混合均匀后置于高压灭菌锅，121℃蒸煮灭菌15分钟，取出，冷却至室温；2制曲及发酵待原料冷却至室温，按接种量0.5％接入米曲霉，充分混合均匀；然后置于恒温通风培养箱中制曲，期间进行两次翻曲，待曲料疏松，长出黄绿色菌体即制得成曲；将制成的曲料放入发酵罐，加等质量的盐水拌匀，连续发酵30天，收集发酵产物，121℃灭菌15min即为发酵基质；其中培养箱温度范围在30℃-35℃；培养湿度为80％-95％；两次翻曲时间设定为24小时与36小时；置于发酵罐中的盐水浓度为12％；发酵温度的范围为：35℃-42℃。8.权利要求7所述发酵基质在用于制备美拉德反应型香精调味品中的应用。

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