申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2018-12-26

公开（公告）日：2022-11-29

公开（公告）号：CN109593730B

主分类号：C12N7/01

分类号：C12N7/01;C12N15/63;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.29#授权;2019.05.03#实质审查的生效;2019.04.09#公开

摘要：本发明提供了一种鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv‑ΔLorf5及其构建方法。本发明利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPkan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组缺失鸭瘟病毒Lorf5基因，再经过细胞内自发同源重组方法缺失MiniF元件，首次完成了无外源碱基和MiniF元件残留的鸭瘟病毒无痕缺失株的构建。本发明技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基的问题并缺失了MiniF元件，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。

主权项：1.鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；（2）以pEPkan-S为模板，以GS1783-BAC-ΔLorf5-F和GS1783-BAC-ΔLorf5-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及Lorf5基因上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-Lorf5，切胶回收获得I_SceI-Kana-Lorf5片段；（3）将I_SceI-Kana-Lorf5片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana；（4）将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，制备GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5感受态；（5）以pEPkan-S为模板，以GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切胶回收获得I_SceI-Kana-MiniF片段；（6）以CHv基因组为模板，以CHv-UL23-F和CHv-UL23-R作为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收获得UL23-MiniF片段；（7）以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；（8）将I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana；（9）将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23；（10）从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23中提取pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒，将pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5；其中，步骤（2）、步骤（5）和步骤（6）中PCR扩增体系为：ddH2O22μl、PrimeSTAR®MaxDNAPolymerase25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min；步骤（2）中引物序列为：GS1783-BAC-ΔLorf5-F:5’-CGTACTAACTGAAGTTGAATCTGATCTAGTAACCGGGGCCtagggataacagggtaatcgattt-3’；GS1783-BAC-ΔLorf5-R:5’-ATGTGAAAGACGTCAAAAGTTAAAACCGGTATATTAAATGGGCCCCGGTTACTAGATCAGATTCAACTTCAGTTAGTACGgccagtgttacaaccaat-3’；步骤（5）中引物序列为：GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’；GS1783-MiniF-R:5’-ATCGTTTTCGTTACCGCTTGCAGGCATCATGACAGAACACTACTTCCTATtagggataacagggtaatcgat-3’；步骤（6）中引物序列为：CHv-UL23-F:5’-GCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtcaattaattgtcatctcgg-3’；CHv-UL23-R:5’-CCGCTCCACTTCAACGTAACACCGCACGAAGATTTCTATTGTTCCTGAAGGCATATTCAACGGACATATTAAAAATTGA-3’。

全文数据：鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5及其构建方法技术领域本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5及其构建方法。背景技术细菌人工染色体bacterialartificialchromosome,BAC是一种新发展起来的DNA载体系统，它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点，在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用。将完整病毒基因组DNA分子插入BAC载体，利用该载体编码的最小生育力因子复制子Minimalfertilityfactorreplicon，Mini-F获得分子克隆化病毒，并结合大肠杆菌中成熟的基因定位修饰技术，从而实现在原核系统中病毒基因的缺失及外源基因的插入。目前较为常用的大肠杆菌基因定位修饰技术主要包括RedET介导的同源重组技术、RecA蛋白介导的同源重组技术、CreloxP介导的同源重组技术以及Tn转座子介导的随机插入和突变技术。利用分子克隆化技术手段现已获得成熟的细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台，同时利用大肠杆菌基因定位修饰RedET介导的同源重组技术可在细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台上进行鸭瘟病毒基因的缺失和外源基因的插入，该成果极大的推动了鸭瘟病毒基因功能的研究进程。RedET介导的同源重组技术是基于λ-噬菌体Red操纵子RedαRedβRedγ和Rac噬菌体RecERecT同源重组酶的同源重组打靶技术。该技术操作简单、快速、高效，广泛应用于基因缺失、突变工作。但是利用该操作技术进行基因缺失、突变会在缺失或突变位点残留约80bp左右外源碱基序列FRT位点，该位点的残留将影响基因功能的准确分析。MiniF元件作为维持BAC载体复制的最小生育力因子复制子，主要由调控BAC复制起点oriS的repE、repF基因、调控复制子分配的sopA、sopB基因以及编码着丝粒区域的sopC基因构成。为完成细菌抗性筛选及BAC标记筛选，MiniF元件加入了抗性筛选基因和荧光标记基因。MiniF元件插入病毒基因组，增加基因组长度，对病毒复制产生不确定影响。同时MiniF元件作为细菌序列在病毒基因组上残留，不利于减毒活疫苗的开发和许可。因此解决碱基残留问题并去除MiniF元件获得无痕基因缺失株，已成为探究鸭瘟病毒基因缺失方法的重点。鸭瘟DuckPlague，DP是由α-疱疹病毒亚科中鸭瘟病毒DuckPlaguevirus,DPV引起的鸭、鹅等水禽的急性接触性高度致死性传染病。该病首先由荷兰报道，随即在我国华南、华中和华东等养鸭业较为发达的地区流行，给我国的养鸭业造成了严重的经济损失。因此深入了解鸭瘟病毒基因功能、加强对鸭瘟疫病的研究对确保我国养鸭业健康、可持续发展尤为重要。Lorf5Lorf11、Lorf2、Lorf3、Lorf4Lorf9、Sorf3等基因为禽疱疹病毒特有基因，目前关于该类基因的研究报道鲜少，其功能尚不明确。在禽疱疹病毒中仅见于马立克病毒Lorf5基因被报道与病毒毒力相关。鸭瘟病毒Lorf5基因尚未有任何功能报道。但通过序列分析发现Lorf5基因在鸭瘟病毒不同毒株间高度变异，所有六株毒C端的60aa相同且三株弱毒的Lorf5序列100％相同，但弱毒缺失强毒所共有的44aaN端序列。三株弱毒与强毒相比在整个序列中发生了10处插入共82aa和1处缺失3aa，推测这些变异可能是弱毒在鸡胚上的连续传代导致的突变，指示其与强毒的致弱部分关联，提示Lorf5可能与鸭瘟病毒的毒力相关。因此探究Lorf5基因在鸭瘟病毒生命周期中的作用将为鸭瘟疫病防治工作提供助力。现有技术中利用以BAC为平台分子克隆化病毒的技术，将鸭瘟病毒基因组重组到含有BAC的病毒转移载体中，构建细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台DPVCHv-BAC-G。同时结合RedET修饰技术，在原核系统中通过成熟的基因操作手段完成鸭瘟病毒基因缺失和外源基因插入。但利用RedET修饰技术在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上对鸭瘟病毒基因缺失后，会在缺失基因处残余两处FRT位点，同时残留MiniF元件。FRT外源位点和MiniF元件的残留对基因功能的探究、减毒活疫苗的开发和许可存在影响。发明内容针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5及其构建方法，该构建方法可有效解决缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基，同时残留MiniF元件的问题。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5，其构建方法包括以下步骤：1将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；2以pEPkan-S为模板，以GS1783-BAC-ΔLorf5-F和GS1783-BAC-ΔLorf5-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及Lorf5基因上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-Lorf5，切胶回收获得I_SceI-Kana-Lorf5片段；3将I_SceI-Kana-Lorf5片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana；4将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，制备GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5感受态；5以pEPkan-S为模板，以GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切胶回收获得I_SceI-Kana-MiniF片段；6以CHv基因组为模板，以CHv-UL23-F和CHv-UL23-R作为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收获得UL23-MiniF片段；7以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；8将I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana；9将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23；10从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23中提取pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒，将pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得的Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5。进一步地，步骤2、步骤5和步骤6中PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min。进一步地，步骤2中引物序列为：GS1783-BAC-ΔLorf5-F:5’-CGTACTAACTGAAGTTGAATCTGATCTAGTAACCGGGGCCtagggataacagggtaatcgattt-3’；GS1783-BAC-ΔLorf5-R:5’-ATGTGAAAGACGTCAAAAGTTAAAACCGGTATATTAAATGGGCCCCGGTTACTAGATCAGATTCAACTTCAGTTAGTACGgccagtgttacaaccaat-3’。进一步地，步骤5中引物序列为：GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’；GS1783-MiniF-R:5’-ATCGTTTTCGTTACCGCTTGCAGGCATCATGACAGAACACTACTTCCTATtagggataacagggtaatcgat-3’。进一步地，步骤6中引物序列为：CHv-UL23-F:5’-GCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtcaattaattgtcatctcgg-3’；CHv-UL23-R:5’-CCGCTCCACTTCAACGTAACACCGCACGAAGATTTCTATTGTTCCTGAAGGCATATTCAACGGACATATTAAAAATTGA-3’。进一步地，步骤7中引物序列为：GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’；CHv-UL23-R:5’-CCGCTCCACTTCAACGTAACACCGCACGAAGATTTCTATTGTTCCTGAAGGCATATTCAACGGACATATTAAAAATTGA-3’。进一步地，步骤7中PCR融合体系为：ddH2O8μl、MaxDNAPolymerase10μl、模板I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段各1μl；PCR融合条件为：95℃预变性5min、95℃变性15s、55℃退火5s、72℃延伸1min，共5个循环。进一步地，步骤7中PCR扩增体系为：融合模板20μl、上游引物GS1783-MiniF-F0.5μl、下游引物CHv-UL23-R0.5μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min。本发明提供的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5及其构建方法，具有以下有益效果：为获得无外源碱基和MiniF元件残留的鸭瘟病毒基因缺失株，本发明在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台的基础上，利用Red-based修饰技术，即利用含有可编码Red操纵子和I_SceI酶基因序列的GS1783大肠杆菌菌株及含有编码卡那抗性及I_SceI酶切位点的质粒pEPkan-S，首先在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组缺失鸭瘟病毒Lorf5基因，再经细胞内自发同源重组方法缺失MiniF元件，首次完成了无外源碱基和MiniF元件残留的鸭瘟病毒无痕缺失株的构建。本发明技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基的问题并缺失了MiniF元件，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。附图说明图1为pEPkan-S质粒图谱。图2为利用Red-Based修饰技术在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上进行Lorf5基因缺失的操作流程图。图3为利用Red-Based修饰技术和细胞内自发同源重组技术对MiniF元件进行缺失的操作流程图。图4为缺失lorf5基因相关PCR图片其中a为I_SceI-kana片段扩增结果图，b为打靶菌落鉴定结果图，c为去除I_SceI-kana片段后pcr菌落鉴定结果图。图5为在缺失lorf5基因基础上缺失MiniF相关PCR图片其中a为kana+UL23融合片段制备结果图，b为打靶菌落鉴定结果图，c为去除I_SceI-kana片段后PCR菌落鉴定结果图。图6为DPVCHv-ΔLorf5无痕缺失病毒株病毒拯救后接种于鸭胚成纤维细胞上造成细胞病变的图片。具体实施方式鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5，构建过程所用材料及试剂如下：1、实验材料1细胞、菌株、病毒毒株、质粒原代鸭胚成纤维细胞由10-11日龄非免疫受精鸭胚按常规方法制备；GS1783菌株由四川农业大学实验室保存；pBAC-DPV质粒由四川农业大学实验室构建并保存；pEPkan-S质粒由四川农业大学实验室保存。2、分子生物学试剂质粒小提试剂盒购自TIANLORF5N公司；QIALORF5NPlasmidMidiKit购自QIALORF5N公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANLORF5N公司；MaxDNAPolymerase购自Takara公司；TaKaRaMiniBESTViralRNADNAExtractionKitVer.5.0购自TaKaRa公司；Lipofectamine3000购自InvitroLorf5n公司；即用型SABC免疫组化染色试剂盒兔IgG购自博士德公司；DAB显色试剂盒黄购自博士德公司。3、实验所用溶液及其配制LB液体培养基：称取Tryptone10g、YeastExtract5g、氯化钠10g溶于800mL去离子水中，充分搅拌，定容至lL，高温高压灭菌。LB固体培养基：在定容至1L的LB液体培养基中加入15g琼脂粉，高温高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入1.5mL氯霉素储存浓度25mgml或1.5mL卡那霉素储存浓度50mgmL，铺制平板，待凝固后，4℃保存。MEM：将9.6gMEM干粉和2.2g碳酸氢钠溶于800mL去离子水，充分搅拌，调节pH值至7.4，定容至lL，过滤除菌，4℃保存。实施例1制备鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5，其构建方法包括以下步骤：1、制备GS1783电转感受态，电转化pBAC-DPV质粒1复苏带pBAC-DPV质粒的大肠杆菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜；挑单菌落接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；2按照QIALORF5NPlasmidMidiKit操作说明提取pBAC-DPV质粒；3复苏GS1783冻存菌于LB固体培养基中，30℃培养过夜；4挑取GS1783单菌落接种于5mLLB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；5将5mL种子液加入100mLLB液体培养基中，30℃摇至OD600值在0.5～0.7之间；6将步骤5所得菌液立即放入冰水混合物中冷却20min；7取步骤6所得菌液，4℃、4500×g离心10min去上清；8用预冷超纯水在冰上反复清洗步骤7菌体沉淀；9向步骤8所得菌体中加入超纯水将菌液定容至500μl，每管100μl分装至预冷EP管，获得GS1783电转感受态；10在100μlGS1783电转感受态中加入20ngpBAC-DPV质粒，混匀后将感受态和质粒一起加入2mm预冷的电击杯底部，15kVcm条件下进行电击；11加入100μlLB液体培养基重悬电击后菌体，30℃摇菌1h后，4500×g离心菌体2min，弃上清，采用200μlLB液体培养基悬浮沉淀，涂布在含有氯霉素的LB固体培养基上，30℃培养24h，获得GS1783-pBAC-DPV菌株。2、扩增I_SceI-Kana-Lorf5打靶片段1复苏带有pEPkan-S质粒的大肠杆菌于含有卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜；挑单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，采用质粒小提试剂盒提取pEPkan-S质粒pEPkan-S质粒图谱见图1；2以pEPkan-S质粒为模板，GS1783-BAC-ΔLorf5-F和GS1783-BAC-ΔLorf5-R为引物，扩增I_SceI-Kana-Lorf5打靶片段，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增片段；GS1783-BAC-ΔLorf5-F:5’-CGTACTAACTGAAGTTGAATCTGATCTAGTAACCGGGGCCtagggataacagggtaatcgattt-3’SEQIDNO：1；GS1783-BAC-ΔLorf5-R:5’-ATGTGAAAGACGTCAAAAGTTAAAACCGGTATATTAAATGGGCCCCGGTTACTAGATCAGATTCAACTTCAGTTAGTACGgccagtgttacaaccaat-3’SEQIDNO：2。PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物GS1783-BAC-ΔLorf5-F1μl、下游引物GS1783-BAC-ΔLorf5-R1μl、模板pEPkan-S质粒1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。利用Red-Based修饰技术在人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上进行基因缺失的操作流程图见图2，具体过程包括如下的3和4两个过程。3、制备GS1783-pBAC-DPV电转感受态进行打靶片段打靶1复苏GS1783-pBAC-DPV冻存菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，30℃培养过夜；2挑取GS1783-pBAC-DPV单菌落接种于5mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；3将5mL种子液加入100mL含氯霉素的LB液体培养基中，置于30℃摇至OD600值在0.5～0.7之间；4将步骤3所得菌液于42℃培养15min后立即放入冰水混合物中冷却20min；5取50mL步骤4所得菌液，于4℃4500×g离心10min，去上清；6用预冷超纯水在冰上反复清洗步骤5菌体沉淀；7向步骤6所得菌体中加入超纯水将菌液定容至500μl，每管100μl分装至预冷EP管，获得GS1783-pBAC-DPV电转感受态；8在100μl电转感受态中加入200ngI_SceI-Kana-Lorf5打靶片段，混匀后将感受态和打靶片段一起加入2mm预冷的电击杯底部，15kVcm条件下进行电击；9取100μlLB液体培养基重悬电击后菌体，30℃摇菌1h后，于4500×g离心菌体2min，弃上清，200μlLB液体培养基悬浮沉淀，涂布于含有卡那霉素和氯霉素双抗生素抗性的LB固体培养基，于30℃培养48h；10以步骤9中生长的单菌落重悬液为模板，利用扩增I_SceI-Kana-Lorf5打靶片段上游引物GS1783-BAC-ΔLorf5-F和鉴定Lorf5基因下游引物Lorf5-R鉴定阳性菌落，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana；GS1783-BAC-ΔLorf5-F:5’-CGTACTAACTGAAGTTGAATCTGATCTAGTAACCGGGGCCtagggataacagggtaatcgattt-3’SEQIDNO：1Lorf5-R:5’-GACACGGTAAACAATGAAGG-3’SEQIDNO：3PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物GS1783-BAC-ΔLorf5-F1μl、下游引物Lorf5-R1μl、模板为步骤9单菌落重悬液1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。4、去掉I_SceI-Kana片段1挑取GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana单菌落接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；2取10μl步骤1所得种子液接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养2h至菌液呈现轻微云雾状；3向步骤2所得菌液中加入1mL含氯霉素的LB液体培养基和5M终浓度为2％的L-阿拉伯糖，30℃培养1h；4将步骤3所得菌液立即放入42℃水浴中培养30min；5将步骤4所得菌液置于30℃培养2h后，取1μl菌液加入200μlLB液体培养基中混匀后涂布到含有氯霉素的LB固体培养基，30℃培养24h～48h；6挑取步骤5中所得单菌落在含氯霉素和卡那霉素双抗性LB固体培养基和氯霉素单抗性LB固体培养基上进行平行筛选，将氯霉素和卡那霉素双抗性LB固体培养基不生长，氯霉素单抗性LB固体培养基生长的菌落通过PCR方法利用Lorf5基因鉴定引物鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5。Lorf5-F:5’-GCCAACGGTAGGGACTG-3’SEQIDNO：4Lorf5-R:5’-GACACGGTAAACAATGAAGG-3’SEQIDNO：3PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物Lorf5-F1μl、下游引物Lorf5-R1μl、模板为步骤6单菌落重悬液1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。5、扩增I_SceI-Kana-MiniF片段1复苏带有pEPkan-S质粒的大肠杆菌于含有卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜；挑单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，质粒小提试剂盒提取pEPkan-S质粒；2以pEPkan-S质粒为模板，GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R为引物，扩增I_SceI-Kana-MiniF打靶片段，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增片段；GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’SEQIDNO：5GS1783-MiniF-R:5’-ATCGTTTTCGTTACCGCTTGCAGGCATCATGACAGAACACTACTTCCTATtagggataacagggtaatcgat-3’SEQIDNO：6PCR扩增体系为ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物GS1783-MiniF-F1μl、下游引物GS1783-MiniF-R1μl、模板pEPkan-S质粒1μl；PCR扩增条件为98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。6、扩增UL23-MiniF片段1制备鸭胚成纤维细胞DEF并接种于25T细胞瓶，37℃，5％CO2培养24h后，接种5MOIDPVCHv，37℃，5％CO2培养48h后收获病毒，反复冻融2次后，按照TaKaRaMiniBESTViralRNADNAExtractionKitVer.5.0说明书提取DPVCHv基因组；2DPVCHv基因组为模板，CHv-UL23-F和CHv-UL23-R为引物，扩增UL23-MiniF打靶片段，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增片段；CHv-UL23-F:5’-GCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtcaattaattgtcatctcgg-3’SEQIDNO：7CHv-UL23-R:5’-CCGCTCCACTTCAACGTAACACCGCACGAAGATTTCTATTGTTCCTGAAGGCATATTCAACGGACATATTAAAAATTGA-3’SEQIDNO：8PCR扩增体系为ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物CHv-UL23-F1μl、下游引物CHv-UL23-R1μl、模板DPVCHv基因组1μl；PCR扩增条件为98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。7、融合I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段1以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，融合I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段；融合体系为：ddH2O8μl、MaxDNAPolymerase10μl、模板I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段各1μl；融合条件为：95℃预变性5min、95℃变性15s、55℃退火5s、72℃延伸1min，共5个循环。2向步骤1所得的融合模板中加入引物GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R，扩增I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增片段；GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’SEQIDNO：5CHv-UL23-R:5’-CCGCTCCACTTCAACGTAACACCGCACGAAGATTTCTATTGTTCCTGAAGGCATATTCAACGGACATATTAAAAATTGA-3’SEQIDNO：8PCR扩增体系为：融合模板20μl、上游引物GS1783-MiniF-F0.5μl、下游引物CHv-UL23-R0.5μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。利用Red-Based修饰技术和细胞内自发同源重组技术对MiniF元件进行缺失的操作流程见图3，具体过程包括如下的8、9和10。8、制备GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5电转感受态进行打靶片段打靶1复苏GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5冻存菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，30℃培养过夜；2挑取GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5单菌落接种于5mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；3将5mL种子液加入100mL含氯霉素的LB液体培养基中，于30℃摇至OD600值在0.5～0.7之间；4将步骤3所得菌液于42℃培养15min后立即放入冰水混合物中冷却20min；5取50mL步骤4所得菌液，于4℃4500×g离心10min，去上清；6用预冷超纯水在冰上反复清洗步骤5所得菌体沉淀；7加入超纯水将步骤6所得菌液定容至500ul，每管100ul分装至预冷EP管，获得GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5电转感受态；8在100μl电转感受态中加入200ngI_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段，混匀后将感受态和打靶片段一起加入2mm预冷的电击杯底部，15kVcm条件下进行电击；9加入100μlLB液体培养基重悬电击后菌体，30℃摇菌1h后，4500xg离心菌体2min，弃上清，200μlLB液体培养基悬浮沉淀，涂布含有卡那霉素和氯霉素双抗生素抗性的LB固体培养基，于30℃培养48h；10PCR鉴定步骤9所得单菌落，获得阳性菌落GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana，以步骤9中生长的单菌落重悬液为模板，利用鉴定引物MiniF-F和MiniF-R鉴定阳性菌落；MiniF-F:5’-GTTATCCACTGAGAAGCGAACG-3’SEQIDNO：9MiniF-R：5’-GGCTGTAAAAGGACAGACCACA-3’SEQIDNO：10PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物MiniF-F1μl、下游引物MiniF-R1μl、模板为步骤9单菌落重悬液1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸15s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。9、去掉I_SceI-Kana片段1挑取GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana单菌落接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；2取10μl步骤1所得种子液接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养2h至菌液呈现轻微云雾状；3向步骤2所得菌液中加入1mL含氯霉素的LB液体培养基和5M终浓度为2％的L-阿拉伯糖30℃，培养1h；4将步骤3所得菌液立即放入42℃水浴中培养30min；5将步骤4所得菌液置于30℃培养2h后，取1μl菌液加入200μlLB液体培养基中混匀后涂布到含有氯霉素的LB固体培养基，30℃培养24h～48h；6挑取步骤5中所得单菌落在含氯霉素和卡那霉素双抗性LB固体培养基和氯霉素单抗性LB固体培养基上进行平行筛选，将氯霉素和卡那霉素双抗性LB固体培养基不生长，氯霉素单抗性LB固体培养基生长的菌落通过PCR方法利用MiniF基因鉴定引物鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23。MiniF-F:5’-GTTATCCACTGAGAAGCGAACG-3’SEQIDNO：9MiniF-R：5’-GGCTGTAAAAGGACAGACCACA-3’SEQIDNO：10PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物MiniF-F1μl、下游引物MiniF-R1μl、模板为步骤6单菌落重悬液1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。10、拯救DPVCHv-ΔLorf5病毒1复苏GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23冻存菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，30℃培养过夜；2按照QIALORF5NPlasmidMidiKit操作说明提取pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒；3制备鸭胚成纤维细胞DEF并接种于12孔板，37℃，5％CO2培养24h后，按照Lipofectamine3000操作说明转染pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒，持续观察荧光斑，收集病毒，反复冻融3次后接种于新的DEF；4重复步骤3三次；5步骤4获得的病毒反复冻融2次后，10倍倍比稀释，接种于长满DEF的6孔板中，37℃，5％CO2孵育2h后，弃孵育液，加入1％甲基纤维素固定细胞，37℃，5％CO2培养120h后，挑取无荧光病变细胞，反复冻融2次后重新接种于DEF中，获得DPVCHv-ΔLorf5-Q；6按照TaKaRaMiniBESTViralRNADNAExtractionKitVer.5.0说明书提取DPVCHv-ΔLorf5-Q病毒基因组，利用MiniF鉴定引物MiniF-F和MiniF-R，鉴定缺失的MiniF元件，最终获得无MiniF元件残留，缺失基因处无碱基残留的无痕缺失病毒株DPVCHv-ΔLorf5阳性病毒株。MiniF-F:5’-GTTATCCACTGAGAAGCGAACG-3’SEQIDNO：9MiniF-R：5’-GGCTGTAAAAGGACAGACCACA-3’SEQIDNO：10PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物MiniF-F1μl、下游引物MiniF-R1μl、模板为步骤6提取的DPVCHv-ΔLorf5-Q病毒基因组1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于16℃保存。实施例2无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5生长曲线的测定1、一步生长曲线的测定将亲本病毒DPVCHv和Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5分别以2MOI接种DEF细胞，接毒后6h、12h、18h、24h收集上清和细胞，每个时间点做三次重复。待收集完全后，反复冻融2次，于96孔板检测病毒滴度，结果表明Lorf5基因的缺失不会显著影响DPVCHv病毒的复制。2、多步生长曲线的测定将亲本病毒DPVCHv和Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5分别以0.01MOI接种DEF细胞，接毒后12h、24h、48h、72h收集上清和细胞，每个时间点做三次重复。待收集完全后，反复冻融2次，于96孔板检测病毒滴度，结果表明Lorf5基因的缺失不会显著影响DPVCHv病毒的增殖情况。实施例3无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5空斑形成实验将亲本病毒DPVCHv和Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5分别以0.01MOI接种布满DEF细胞的6孔板，37℃、5％CO2吸附2h后，去上清，加入2mL1％甲基纤维素，37℃、5％CO2培养48h后，去1％甲基纤维素，PBS洗涤3次，4％多聚甲醛4℃固定过夜，PBS洗涤3次，加入H2O2和甲醇以体积比为1：50混合的混合液，室温孵育30min，蒸馏水洗涤3次，加入5％BSA封闭液，室温孵育30min，加入兔抗DPV，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，加入生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min，PBS洗涤3次，滴加SABC底物，37℃孵育30min，PBS洗涤3次，DAB显色液避光显色，封片，结果表明Lorf5基因的缺失可能影响DPVCHv病毒在细胞内增殖及传播情况。此外，本发明还对鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5做了遗传稳定性实验、致病性和免疫原性实验。遗传稳定性：鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5在DEF细胞上传代20代，均出现病变空斑，表明所获得的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5在DEF中稳定遗传。致病性：将15只4周龄DPV抗体阴性和PCR检测阴性鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射DPVCHv-ΔLorf5，第2组肌肉注射亲本病毒DPVCHv，两组中每只注射病毒的毒价相同，第3组注射等剂量的MEM，作为对照组，每组单独隔离饲养，观察，每天记录发病死亡情况。由结果可知，注射有亲本病毒的鸭全部死亡，而注射有DPVCHv-ΔLorf5以及对照组中的鸭无死亡，说明DPVCHv-ΔLorf5致病性降低。免疫原性：将15只2周龄DPV抗体阴性和PCR检测阴性鸭随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射DPVCHv-ΔLorf5，第2组肌肉注射亲本病毒DPVCHv，两组中每只注射病毒的毒价相同，第3组注射等剂量的MEM作为对照组，每组单独隔离饲养，免疫后15天采血分离血清，利用纯化的DPV作为包被抗原，间接ELISA检测鸭血清中的抗体情况。由结果可知，注射有DPVCHv-ΔLorf5的鸭与注射亲本病毒鸭均可检测到DPV抗体，说明DPVCHv-ΔLorf5免疫原性好。序列表四川农业大学鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5及其构建方法10SIPOSequenceListing1.0164DNA人工序列ArtificialSequence1cgtactaactgaagttgaatctgatctagtaaccggggcctagggataacagggtaatcg60attt64298DNA人工序列ArtificialSequence2atgtgaaagacgtcaaaagttaaaaccggtatattaaatgggccccggttactagatcag60attcaacttcagttagtacggccagtgttacaaccaat98320DNA人工序列ArtificialSequence3gacacggtaaacaatgaagg20417DNA人工序列ArtificialSequence4gccaacggtagggactg17598DNA人工序列ArtificialSequence5ttattaatctcaggagcctgtgtagcgtttataggaagtagtgttctgtcatgatgcctg60caagcggtaacgaaaacgattgttacaaccaattaacc98672DNA人工序列ArtificialSequence6atcgttttcgttaccgcttgcaggcatcatgacagaacactacttcctattagggataac60agggtaatcgat72745DNA人工序列ArtificialSequence7gcctgcaagcggtaacgaaaacgattcaattaattgtcatctcgg45879DNA人工序列ArtificialSequence8ccgctccacttcaacgtaacaccgcacgaagatttctattgttcctgaaggcatattcaa60cggacatattaaaaattga79922DNA人工序列ArtificialSequence9gttatccactgagaagcgaacg221022DNA人工序列ArtificialSequence10ggctgtaaaaggacagaccaca22

权利要求：1.鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；2以pEPkan-S为模板，以GS1783-BAC-ΔLorf5-F和GS1783-BAC-ΔLorf5-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及Lorf5基因上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-Lorf5，切胶回收获得I_SceI-Kana-Lorf5片段；3将I_SceI-Kana-Lorf5片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana；4将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-Lorf5-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，制备GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5感受态；5以pEPkan-S为模板，以GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切胶回收获得I_SceI-Kana-MiniF片段；6以CHv基因组为模板，以CHv-UL23-F和CHv-UL23-R作为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收获得UL23-MiniF片段；7以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；8将I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana；9将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23；10从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23中提取pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒，将pBAC-DPV-ΔLorf5-UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5。2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，步骤2、步骤5和步骤6中PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min。3.根据权利要求1或2所述的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，步骤2中引物序列为：GS1783-BAC-ΔLorf5-F:5’-CGTACTAACTGAAGTTGAATCTGATCTAGTAACCGGGGCCtagggataacagggtaatcgattt-3’；GS1783-BAC-ΔLorf5-R:5’-ATGTGAAAGACGTCAAAAGTTAAAACCGGTATATTAAATGGGCCCCGGTTACTAGATCAGATTCAACTTCAGTTAGTACGgccagtgttacaaccaat-3’。4.根据权利要求1或2所述的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，步骤5中引物序列为：GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’；GS1783-MiniF-R:5’-ATCGTTTTCGTTACCGCTTGCAGGCATCATGACAGAACACTACTTCCTATtagggataacagggtaatcgat-3’。5.根据权利要求1或2所述的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，步骤6中引物序列为：CHv-UL23-F:5’-GCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtcaattaattgtcatctcgg-3’；CHv-UL23-R:5’-CCGCTCCACTTCAACGTAACACCGCACGAAGATTTCTATTGTTCCTGAAGGCATATTCAACGGACATATTAAAAATTGA-3’。6.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，步骤7中引物序列为：GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’；CHv-UL23-R:5’-CCGCTCCACTTCAACGTAACACCGCACGAAGATTTCTATTGTTCCTGAAGGCATATTCAACGGACATATTAAAAATTGA-3’。7.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，步骤7中PCR融合体系为：ddH2O8μl、MaxDNAPolymerase10μl、模板I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段各1μl；PCR融合条件为：95℃预变性5min、95℃变性15s、55℃退火5s、72℃延伸1min，共5个循环。8.根据权利要求1或6所述的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5的构建方法，其特征在于，步骤7中PCR扩增体系为：融合模板20μl、上游引物GS1783-MiniF-F0.5μl、下游引物CHv-UL23-R0.5μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min。9.采用权利要求1-8任一项所述的方法构建得到的鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5。

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