申请/专利权人：王叶

申请日：2023-01-04

公开（公告）日：2023-03-21

公开（公告）号：CN115812676A

主分类号：A01K67/027

分类号：A01K67/027;G01N21/84;G01N21/31;A61K49/00;G01N33/68;C12Q1/686

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2023.08.25#发明专利申请公布后的撤回;2023.04.07#实质审查的生效;2023.03.21#公开

摘要：本发明公开了一种利用Wntβ‑catenin为靶向寻找靶点的方法及其步骤，实验动物选取：SD雄性大鼠45只，体重150~180g，清洁级，根据统计学估算所需动物数，每组为15只；实验分组：将大鼠按照随机数字法分为3组，①空白对照组；②模型组；③DKK1中和抗体组；动物模型制备：FSGS大鼠模型具有与人类较相似的临床、组织病理学和免疫学变化特点。本发明通过以Wntβ‑catenin信号为靶向，探讨DKK1拮抗剂调控Wntβ‑catenin信号轴改善FSGS肾损害的分子机制，DKK1拮抗剂负性调控Wntβ‑catenin达到改善肾损伤的作用，阐明FSGS发生发展的过程，寻找治疗的新靶点，以提高用药的针对性，同时认为DKK1阻断剂可能通过抑制Wntβ‑catenin信号及其相关的炎症因子，从而抑制Wntβ‑catenin的表达，达到缓解FSGS及肾损害的作用。

主权项：1.一种利用Wntβ-catenin为靶向寻找靶点的方法，其特征在于，包括如下步骤：实验动物选取：SD雄性大鼠45只，体重150~180g，清洁级，根据统计学估算所需动物数，每组为15只；实验分组：将大鼠按照随机数字法分为3组，①空白对照组；②模型组；③DKK1中和抗体组；动物模型制备：FSGS大鼠模型具有与人类较相似的临床、组织病理学和免疫学变化特点；取SD大鼠，适应性饲养1周后，依体重均衡后随机取15只作为正常组，其余动物手术前12h禁食不禁水，以1.5%戊巴比妥钠按50mgkg腹腔注射麻醉，待角膜反射消失后，固定在手术台上，术区备皮；常规消毒，背部切口1~1.5cm，开腹后暴露左肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管，切除左肾，缝合切口；第4、18天分别从尾静脉注射阿霉素2mgkg；存活的大鼠第2次注射阿霉素后7天时检测尿蛋白，尿蛋白定量100mg24h提示模型复制成功，计入实验，连续观察至12周末；模型成功后大鼠根据尿蛋白定量随机分为模型组、DKK1中和抗体组，每组15只，当日开始干预；干预方式：正常组、模型组均给予蒸馏水按5mlkg灌胃，每日1次；DKK1中和抗体组在腹部皮下注射25mgkg的DKK1中和抗体，隔3天1次，共干预12周；干预12周后处死大鼠，取血分离血清，剖腹取出右肾，剥离肾包膜，剪取右肾上极肾组织，置于4℃，切成1mmx1mmx1mm小块，2%发二醛固定；剩余肾组织自肾门处切成两片，10%中性福尔马林溶液固定；观察指标及检测：光镜观察肾组织病病理变化：10%中性福尔马林溶液固定的肾组织，经脱水、透明、石蜡包埋后，切成3μm切片，作苏木精一伊红（HE）、高碘酸一希夫（PAS）染色，光镜下观察肾小球和肾小管间质病理形态；主要观察指标：肾小球硬化指数、肾小球毛细血管丛管腔开放程度、PAS阳性区面积、毛细血管襻横截面积和肾小球系膜基质相对面积；超微结构观察：取出2%戊二醛固定的肾组织，PBS溶液反复洗涤，用1%锇酸溶液进行后固定，乙醇梯度脱水，丙酮与树脂液浸透，环氧树脂包埋，切片，醋酸铀与柠檬酸铅双染色，电镜下观察肾脏超微结构的变化；ELISA法检测DKK1、GSK-3β、β-catenin表达：将肾组织裂解、匀浆、离心，取上清液置于4℃冰箱保存；酶联免疫吸附试剂盒测定上述指标的表达；取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL：待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL：空白对照孔不加；37℃水浴锅或恒温箱温育30min，洗板5次，每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加，37℃水浴锅或恒温箱温育30min，洗板5次，每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀30s，37℃避光显色15min，每孔加终止液50μL，终止反应；Westernblot检测DKK1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b、GSK-3β、β-catenin、LEF1蛋白表达：将肾组织尽量剪碎充分裂解后，提取液于10000转、94℃离心30分钟，分离上清液，采用BSA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，用5x上样缓冲液调整蛋白浓度至适宜范围，然后100℃煮沸3min，在5%SDS聚丙烯酞胺凝胶中电泳，每孔上样量为100μL，半干法电转移至PVDF膜上，将膜以含5%脱脂奶的TBST缓冲液室温封闭2小时，与一抗体4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次10分钟，加入二抗室温孵育2小时，漂洗3次，每次10分钟，化学发光显色剂显色，拍照，凝胶图像分析系统分析光密度值；RT-PCR检测DKK1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b、GSK-3β、β-catenin、c-myc、cyclinD1、LEF1mRNA表达：采用Trizol提取肾脏组织总mRNA，取1μgRNA按照OneStepRT-PCR试剂盒要求加入试剂，cDNA产物在20μL体系中进行，设定反应条件，取10μLPCR扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，自动凝胶成像分析仪分析。

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百度查询： 王叶 一种利用Wntβ-catenin为靶向寻找靶点的方法及其步骤

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