申请/专利权人：普纳思细胞(厦门)生物科技有限公司

申请日：2022-08-01

公开（公告）日：2023-05-02

公开（公告）号：CN116042681A

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C12N15/12;C07K14/50

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.05.19#实质审查的生效;2023.05.02#公开

摘要：本发明属于成纤维细胞生长因子的技术领域，公开了一种bFGF热稳定性改造的方法，包括以下步骤：S1.目的基因合成；选取bFGF蛋白，将四个肝素结合位点从K突变为N，得到bFGFK突变体；S2.引物设计和合成；以bFGFK突变体的基因序列为模板，设计引物；在引物的两端分别插入2个酶切点；引物包括上游引物、下游引物；S3.目的基因扩增；以bFGFK突变体的基因序列为DNA模板进行PCR扩增，再经过纯化，备用；S4.重组质粒载体的构建S5.重组bFGFK蛋白的表达及纯化。本发明通过在特定位点进行氨基酸置换的方法，将bFGF的肝素结合位点128、134、138和144位赖氨酸K突变为天冬酰胺N，获得热稳定性提升的bFGFK128134138144N重组蛋白，同时其生物活性没有改变。

主权项：1.一种bFGF热稳定性改造的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.目的基因合成选取bFGF蛋白，将四个肝素结合位点从K突变为N，得到bFGFK突变体；S2.引物设计和合成以bFGFK突变体的基因序列为模板，设计引物；在引物的两端分别插入2个酶切点；引物包括上游引物、下游引物；S3.目的基因扩增以bFGFK突变体的基因序列为DNA模板进行PCR扩增，再经过纯化，备用；S4.重组质粒载体的构建用NdeI和EcoRI分别对扩增纯化的PCR产物和pET22B质粒进行双酶切，酶切后的bFGFK目的基因与pET22B质粒，用连接酶进行连接，连接产物转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α或BL21；S5.重组bFGFK蛋白的表达及纯化将测序验证正确的pET22B-bFGFK表达载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α或BL21，进行亲和层析纯化，得到bFGFK重组蛋白产物；将bFGFK重组蛋白产物做成冻干粉，低温下保存备用。

全文数据：

权利要求：

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