申请/专利权人：南昌大学第二附属医院

申请日：2019-04-29

公开（公告）日：2023-05-16

公开（公告）号：CN110408696B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12N15/867;G01N33/68;G01N33/574

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.16#授权;2019.11.29#实质审查的生效;2019.11.05#公开

摘要：一种ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用。1首先采用荧光定量PCR、westernblot及免疫组化分析骨肉瘤标本及癌旁组织中ROCK2的表达，然后分析其与预后的关系；2采用干扰技术，将阴性对照及干扰ROCK2的质粒分别导入骨肉瘤细胞U2‑OS及MG‑63，加入TRAIL，随后将阴性对照及上调ROCK2的慢病毒导入骨肉瘤细胞系U2‑OS，然后采用westernblot、免疫荧光、CCK8、Edu、流式细胞术分析了骨肉瘤细胞中TRAIL的敏感性，通过以上实验，明确干扰ROCK2后抑制ROCK2激酶的活性能增强TRAIL的敏感性，从而为揭示新的治疗靶点，更有效的增强TRAIL的敏感性提供科学依据。具有逆转骨肉瘤细胞对TRAIL的耐药，为骨肉瘤治疗提供新的靶点，为更加有效地对抗TRAIL耐药提供科学依据的优点。

主权项：1.ROCK2的抑制剂Y27632与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL的组合或ROCK2的干扰RNA与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL组合在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。

全文数据：ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用技术领域本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及骨肉瘤细胞对TRAIL耐药影响因素研究技术领域，具体的为一种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用。背景技术骨肉瘤osteosarcoma,OS，系以能够直接成骨和产生骨基质的梭形基质细胞为特征的骨原发性恶性肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，易发生肺等器官转移，预后差，5年生存率约为65％。由于OS的发生严重威胁着青少年的健康，尽管骨肉瘤化疗药物耐药机理的研究已经进行了多年，但仍然没有取得重大突破，化疗耐药的骨肉瘤患者长期生存率仍然不到20％。临床上，骨肉瘤患者亟需传统手术+新辅助化疗之外的新的治疗手段。近年来，一种生物治疗药物——肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TumorNecrosisFactor-RelatedApoptosisInducingLigand，TRAIL在实体恶性肿瘤的临床试验中取得了令人瞩目的研究成果，它是一种能诱导癌细胞凋亡而对机体正常组织无明显损伤的内源性细胞因子，对肺癌、宫颈癌、淋巴瘤等众多肿瘤都有明显疗效。但是，有研究发现骨肉瘤细胞对TRAIL具有耐药性,使TRAIL在骨肉瘤中的临床应用大大受限，然而其机制尚不清楚。研究证实Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2Rhoassociatedcoiledcoilformingproteinkinase2，ROCK2在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。ROCK2位于染色体2p24上，包括33个外显子，可编码1338个氨基酸，ROCK2激酶结构域由氨基末端和羧基端组成，并决定其催化活性。目前认为ROCK2是RhoROCK信号转导通路的关键信号分子，可以调节细胞的收缩、粘附、迁移、增殖和凋亡。研究证实在许多不同肿瘤组织如肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等中均观察到ROCK2呈高表达，我们前期研究也证明ROCK2在肝癌、肾癌、结肠癌等组织中呈高表达；但是ROCK2在骨肉瘤组织中的表达，以及其对骨肉瘤细胞对TRAIL耐药中的影响，目前还没有相关研究和报道。发明内容本发明针对现有技术的上述不足，针对肿瘤治疗药物TRAIL在治疗过程中常产生耐药进而导致化疗失败甚至疾病复发等现象，提供一种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，进而逆转骨肉瘤细胞对TRAIL的耐药，为骨肉瘤治疗提供新的靶点，为更加有效地对抗TRAIL耐药提供科学依据。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用。为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术手段：1首先采用荧光定量PCR、westernblot及免疫组化分析骨肉瘤标本及癌旁组织中ROCK2的表达，然后分析其与预后的关系；2然后采用干扰技术，将阴性对照及干扰ROCK2的质粒分别导入骨肉瘤细胞U2-OS及MG-63，然后加入TRAIL，随后将阴性对照及上调ROCK2的慢病毒导入骨肉瘤细胞系U2-OS，然后采用westernblot、免疫荧光、CCK8、Edu、流式细胞术分析了骨肉瘤细胞中TRAIL的敏感性，通过以上实验，明确干扰ROCK2后抑制ROCK2激酶的活性能增强TRAIL的敏感性，从而为揭示新的治疗靶点，更有效的增强TRAIL的敏感性提供科学依据。具体的，技术手段如下：1ROCK2在骨肉瘤的表达情况收集骨肉瘤标本及癌旁组织并采用免疫组化、westernblot及荧光定量PCR分析ROCK2的表达情况；2分析骨肉瘤中ROCK2的表达与骨肉瘤的预后关系；3采用RNA干扰技术降低ROCK2的表达后分析骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性：3.1提取RNA及细胞总蛋白，应用荧光定量PCR及westernblot检测shNC及shROCK2中ROCK2表达情况；3.2利用稳定干扰ROCK2的骨肉瘤细胞并加入TRAIL，分析其对TRAIL的敏感性；4采用CCK8及Edu分析稳定低表达ROCK2细胞的增殖能力，加入TRAIL后，进一步分析其增殖能力；5采用流式凋亡实验及westernblot检测凋亡相关蛋白表达情况分析骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性；6采用慢病毒转染技术建立稳定高ROCK2骨肉瘤细胞株：6.1提取细胞总蛋白及RNA,荧光定量PCR及westernblot检测ROCK2的表达情况；6.2在此基础上加入TRAIL,分析稳定高表达ROCK2后骨肉瘤对TRAIL的敏感性；7不同剂量的TRAIL处理骨肉瘤细胞，流式技术检测细胞凋亡情况；8加入或者不加TRAIL，加入ROCK2抑制剂Y27632Y-27632，流式技术检测细胞凋亡情况，并检测Caspase3的表达情况。通过上述研究，本发明人发现针对骨肉瘤中高表达的ROCK2基因与TRAIL耐药密切相关；特意的抑制ROCK2基因表达，能够有效的增强TRAIL的敏感性，极大的促进的骨肉瘤细胞的凋亡，从而显著提升TRAIL药物的疗效，降低耐药性。因此，在上述研究的基础上本发明提出ROCK2抑制剂Y27632,及shROCK2,这两种抑制剂可以实现在降低ROCK2蛋白表达水平后，显著提升TRAIL对骨肉瘤细胞的敏感性。在本发明中我们采用的是骨肉瘤细胞系U2-OS及MG-63。相对于现有的技术，本发明的有益效果是：本发明的方法为TRAIL作为肿瘤的靶向治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤提供新的靶向治疗依据，为进一步提高肿瘤的靶向治疗提供新科学依据。附图说明：图1是荧光定量PCR的统计图，表示ROCK2mRNA在骨肉瘤及表达显著高于癌旁组织。图2是westernblot图，表示ROCK2蛋白在骨肉瘤中表达显著高于癌旁组织。图3是免疫组化图，表示在骨肉瘤标本中ROCK2表达显著提升。图4是骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63中，干扰ROCK2后，mRNA及蛋白表达水平提示干扰成功。图5是CCK8图，表示干扰ROCK2及加入TRAIL后增殖显著减弱。图6是Edu图，表示干扰ROCK2及加入TRAIL后增殖显著减弱。图7是流式图，表示降低ROCK2表达后可显著提升TRAIL的敏感性图8是westernblot图，表示减弱ROCK2表达后，TRAIL对骨肉瘤凋亡的影响。图9是U2-OS细胞用不同剂量的TRAIL治疗48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。图10是U2-OS细胞在无TRAIL500ngmL存在或不存在的情况下，用指定浓度的Y-27632处理48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。图11是骨肉瘤细胞U2-OS用Y-27632与TRAIL500ngml联合处理48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。图12是westernblot图，表示Y-27632与TRAIL500ngml联合处理后Caspase3激活。具体实施方案下面通过实施例进一步详细描述本发明，但是本发明不仅仅局限于以下实施例。1.细胞培养人骨肉瘤细胞U2-OS及MG-63在含10胎牛血清含体积百分含量为10％的胎牛血清的DMEM高糖培养基中，并于5％CO2、37℃细胞培养箱中培养。2骨肉瘤中ROCK2的表达为了探讨骨肉瘤ROCK2在骨肉瘤组织中的表达情况，为此我们首先收集了62例骨肉瘤组织及10例正常骨组织，westernblot分析了62例骨肉瘤组织及10例正常骨组织的ROCK2蛋白水平，与10例正常骨组织比较，发现ROCK2高表达有40例、低表达22例，其与临床数据分析见表1.1，通过免疫组化方法检测骨肉瘤组织及骨组织中ROCK2表达情况。免疫组化结果发现，骨肉瘤组织中ROCK2的表达明显高于正常骨组织图1-3，p南昌大学第二附属医院Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用20198PatentInversion3.3150DNAshROCK2-1F1caccgcagctggaatctaacaatagcgaactattgttagattccagctgc50250DNAshROCK2-1R2aaaagcagctggaatctaacaatagttcgctattgttagattccagctgc50350DNAshROCK2-2F3caccgcagaagaaacaggaattacacgaatgtaattcctgtttcttctgc50450DNAshROCK2-2R4aaaagcagaagaaacaggaattacattcgtgtaattcctgtttcttctgc50550DNAshROCK2-3F5caccgctacatatggagcttaaatccgaagatttaagctccatatgtagc50650DNAshROCK2-3R6aaaagctacatatggagcttaaatcttcggatttaagctccatatgtagc50750DNAshROCK2-4F7caccgccacaagggacatgagtttacgaataaactcatgtcccttgtggc50850DNAshROCK2-4R8aaaagccacaagggacatgagtttattcgtaaactcatgtcccttgtggc50

权利要求：1.一种ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用。2.根据权利要求1所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：技术手段为：1首先采用荧光定量PCR、westernblot及免疫组化分析骨肉瘤标本及癌旁组织中ROCK2的表达，然后分析其与预后的关系；2然后采用干扰技术，将阴性对照及干扰ROCK2的质粒分别导入骨肉瘤细胞U2-OS及MG-63，然后加入TRAIL，随后我们又将阴性对照及上调ROCK2的慢病毒导入骨肉瘤细胞系U2-OS，然后采用westernblot、免疫荧光、CCK8、Edu、流式细胞术分析了骨肉瘤细胞中TRAIL的敏感性，通过以上实验，明确干扰ROCK2后抑制ROCK2激酶的活性能增强TRAIL的敏感性，从而为揭示新的治疗靶点，更有效的增强TRAIL的敏感性提供科学依据。3.根据权利要求2所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：具体的技术手段如下：1ROCK2在骨肉瘤的表达情况收集骨肉瘤标本及癌旁组织并采用免疫组化、westernblot及荧光定量PCR分析ROCK2的表达情况；2分析骨肉瘤中ROCK2的表达与骨肉瘤的预后关系；3采用RNA干扰技术降低ROCK2的表达后分析骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性：3.1提取RNA及细胞总蛋白，应用荧光定量PCR及westernblot检测shNC及shROCK2中ROCK2表达情况；3.2利用稳定干扰ROCK2的骨肉瘤细胞并加入TRAIL，分析其对TRAIL的敏感性；4采用CCK8及Edu分析稳定低表达ROCK2细胞的增殖能力，加入TRAIL后，进一步分析其增殖能力；5采用流式凋亡实验及westernblot检测凋亡相关蛋白表达情况分析骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性；6采用慢病毒转染技术建立稳定高ROCK2骨肉瘤细胞株：6.1提取细胞总蛋白及RNA,荧光定量PCR及westernblot检测ROCK2的表达情况；6.2在此基础上加入TRAIL,分析稳定高表达ROCK2后骨肉瘤对TRAIL的敏感性；7不同剂量的TRAIL处理骨肉瘤细胞，流式技术检测细胞凋亡情况；8加入或者不加TRAIL，加入ROCK2抑制剂Y27632，流式技术检测细胞凋亡情况，并检测Caspase3的表达情况。4.根据权利要求3所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：所述的ROCK2采用的抑制剂为Y27632，干扰ROCK2的为shROCK2。5.根据权利要求4所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：所述的shROCK2设计有4对oligos退火到pSIREN-RetroQ-TetH中的序列：shROCK2-1F5'-CACCGCAGCTGGAATCTAACAATAGCGAACTATTGTTAGATTCCAGCTGC-3'shROCK2-1R5'-AAAAGCAGCTGGAATCTAACAATAGTTCGCTATTGTTAGATTCCAGCTGC-3'；shROCK2-2F5'-CACCGCAGAAGAAACAGGAATTACACGAATGTAATTCCTGTTTCTTCTGC-3'shROCK2-2R5'-AAAAGCAGAAGAAACAGGAATTACATTCGTGTAATTCCTGTTTCTTCTGC-3'；shROCK2-3F5'-CACCGCTACATATGGAGCTTAAATCCGAAGATTTAAGCTCCATATGTAGC-3'shROCK2-3R5'-AAAAGCTACATATGGAGCTTAAATCTTCGGATTTAAGCTCCATATGTAGC-3'；shROCK2-4F5'-CACCGCCACAAGGGACATGAGTTTACGAATAAACTCATGTCCCTTGTGGC-3'shROCK2-4R5'-AAAAGCCACAAGGGACATGAGTTTATTCGTAAACTCATGTCCCTTGTGGC-3'。

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