申请/专利权人：浙江万里学院

申请日：2020-01-10

公开（公告）日：2023-05-23

公开（公告）号：CN111073954B

主分类号：C12Q1/6806

分类号：C12Q1/6806

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.23#授权;2020.05.22#实质审查的生效;2020.04.28#公开

摘要：本发明公开了一种缢蛏鳃组织miRNA提取方法，主要针对实验室Trizol法和试剂盒提取组织miRNA的纯度和浓度低进行优化，包括核酸和蛋白的分离、小RNA的纯化和小RNA的富集。优化后的方法操作步骤简单、成本较低、效果以及稳定性佳，所得的miRNA纯度高、产率高，检测的miRNACt值低且稳定，表明该方法提取的鳃miRNA完全符合实验要求，且方法简单，具有较高的推广价值。

主权项：1.一种缢蛏鳃组织miRNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1将缢蛏鳃组织取出，并迅速用磷酸缓冲盐溶液洗净，放入液氮使其完全冻结；2取出100-200mg鳃组织，加入1mL以质量比8:2比例配置的Trizol试剂以及无水乙醇的混合试剂，匀浆3次，每次匀浆后进行液体冰浴5s，静置10min后得到匀浆液；3吸取步骤2所得匀浆液的上清液900uL，并加入上清液体积比为13的氯仿混合，摇动2min，冰浴5min，离心后得到分层液体，miRNA存在于最上层液体中；4将步骤3中上层液体加入至miRNA分离柱中静置后进行离心；5将步骤4液体与同体积DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液混合，置于温度为-20℃冰箱中10-60min；6将步骤5所得混合液离心得到miRNA沉淀，弃净液体，用乙醇清洗，离心重复；7将步骤6离心后所得沉淀进行乙醇清洗，再次离心；8将步骤7离心后的产物去掉液体，进行离心，并吸去剩余液体，晾干；9用DEPC水溶解沉淀，最后得到缢蛏鳃组织miRNA;所述步骤1中，磷酸缓冲盐溶液的具体制备方法为以质量配比为8：0.2:1.44:0.24的氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以pH为7.2混合定容1L然后高压蒸汽灭菌，室温保存后所得；所述步骤5中，DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液的具体制备方法为以氯化钠0.3506g，柠檬酸钠2.3528g，余量为DEPC水的配方配成10mL的高盐缓冲液，之后加入质量为1％的DNaseI酶以及3mL的异丙醇得到DNaseI酶-异丙醇-高盐缓冲液。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 浙江万里学院 一种缢蛏鳃组织miRNA快速提取方法

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