申请/专利权人：浙江泛亚生物医药股份有限公司

申请日：2018-03-23

公开（公告）日：2023-05-23

公开（公告）号：CN110295245B

主分类号：C12Q1/6895

分类号：C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/645

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.23#授权;2019.11.01#实质审查的生效;2019.10.01#公开

摘要：本发明提供一种蝉花单17‑7‑1菌株的鉴定方法，包括提取待检测菌株的DNA；对待检测菌株DNA采用引物S11‑2‑F3和S11‑2‑R3或S11‑2‑F4和S11‑2‑R4进行PCR扩增；获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的SCAR条带图谱；将获得的待检测菌株SCAR图谱进行分析获得判定结果。采用本发明鉴定方法，可快速、准确的鉴定蝉花单17‑7‑1菌株。

主权项：1.一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1，提取待检测菌株的DNA；步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增：SEQIDNO：1：GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；SEQIDNO：2：GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT；步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的电泳条带图谱；步骤4，将步骤3获得的待检测菌株图谱进行分析获得判定结果；所述蝉花单17-7-1菌株的保藏号为CGMCCNo.3453。

全文数据：一种蝉花菌株的SCAR分子标记鉴定方法技术领域本发明涉及一种蝉花菌株的鉴定方法，属于分子生物学技术领域。背景技术蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉花寄生后的产物，是一种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isariacicadae。此后出现多种同物异名，如蝉草Cordycepscicadae，辛克莱球壳孢Sphaeriasinclairii，辛克莱虫草Cordycepssinclairii，辛克莱棒束孢Isariasinclairii，基生棒束孢Isariabasili，丛生虫壳菌Torrubiacaespitosa，哈里棒束孢Isariahariottii，小蝉茸Cordycepssobolifera，蒙克苏棒束孢Isariamokanshawii和多枝棒束孢Isariaarbuscula等等。常采到的是蝉花及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉花寄生后的虫菌复合体。蝉花属半知菌类真菌，其子实体自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长1.5～8.0cm，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。该蝉花采用如下方法进行培养：从液氮中取出蝉花单17-7-1和其他不同地域蝉花的保藏样品，在超净工作台上将其接到PSA斜面培养基上，22℃-25℃培养10d，然后在超净工作台将PSA斜面培养基中长好的蝉花接到SAAY液体培养基中，22℃-25℃摇菌24h，收集菌丝并液氮速冻，-80℃保存备用。蝉花单17-7-1的主要形态特征为：在PDA培养基上25℃培养10d，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，直径5～6cm。菌丝无色，分枝，具有隔膜，宽1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，宽3.0～5.5μm，由每轮2～5个个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6.5～8.8～11.0×2.5～3.5μm。蝉花单17-7-1经实验验证，其培养物具有易于培养、产量高的特点，具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的工业化应用价值。由于地理来源不同、寄主不同的蝉花，其次生代谢产物方面具有较大的变异性。本专利的目的是利用SCAR分子标记技术鉴定蝉花单17-7-1菌株和其他不同地域蝉花的区别。发明内容本发明的目的在于提供蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，该方法包括如下步骤：步骤1，提取待检测菌株的DNA；步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增，S11-2-F3：GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；S11-2-R3：GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT；步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的电泳条带图谱；步骤4，将步骤3获得的待检测菌株图谱进行分析获得判定结果。其中，步骤2的引物还可以是：S11-2-F4：CCTCCCGTCGCTCATTGTT；S11-2-R4：TCGGGCAAATTTCAAGCGCCA；进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系如下：进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃30秒，55℃30秒，72℃2.5分钟，共循环35次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。进一步的，所述步骤4中，将步骤3获得的SCAR条带图谱进行分析，发现单17-7-1具有特异条带，而其他不同地域蝉花没有该特异条带，则鉴定出蝉花菌株单17-7-1。本发明涉及的蝉花菌株为浙江泛亚生物医药股份有限公司所有，编号为单17-7-1已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC注册保藏，保藏号为CGMCCNo.3453。本发明有益效果：本发明通过筛选大量的随机引物最终获得本发明引物，该引物具有非常高的特异性，具有唯一的特异性条带片段长度分别为2414bp和2222bp，能很好的区分生产菌株单17-7-1和其他不同地域蝉花。由于目前其他菌株并未进行过全基因组测序，如果要从整个基因组区分不同地域蝉花分子水平的不同，则需要对其他不同地域蝉花进行重测序每个样至少还需要三次重复，再进行个体差异性分析，需要消耗大量的金钱，大量的时间。相对于以往的蝉花全基因组测序结果，本发明SCAR分子标记技术只需通过PCR和电泳就能得到结果，具有耗时短，价格低，操作简便的特点。附图说明图1为引物S11-2-F1和S11-2-R1对应的SCAR条带图谱。图2为引物S11-2-F2和S11-2-R2对应的SCAR条带图谱。图3为引物S11-10-F1和S11-10-R1对应的SCAR条带图谱。图4为引物S11-10-F2和S11-10-R2对应的SCAR条带图谱。图5为引物S11-7-F2和S11-7-R2对应的SCAR条带图谱。图6为引物S11-10-F3和S11-10-R3对应的SCAR条带图谱。图7为引物S11-11-F2和S11-11-R2对应的SCAR条带图谱。图8为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱。图9为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱。以上图1-7中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ8的PCR结果，泳道3为15JJ10的PCR结果，泳道4为15JJ14的PCR结果，泳道5为15JJ18的PCR结果，泳道6为15AX27的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15AX30的PCR结果，泳道10为15AX36的PCR结果，泳道11为15AX39的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果；以上图8-9中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果。图10为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱；泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp；泳道2为15JJ5的条带大小估算为无；泳道3为15JJ7的条带大小估算为无；泳道4为15JJ8的条带大小估算为无；泳道5为15JJ10的条带大小估算为无；泳道6为15JJ14的条带大小估算为3000bp左右；泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp；泳道9为15JJ17的条带大小估算为无；泳道10为15JJ18的条带大小估算为无；泳道11为15AX22的条带大小估算为无；泳道12为15AX27的条带大小估算为无；泳道13为15AX30的条带大小估算为无。图11为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱；泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp；泳道2为15AX33的条带大小估算为无；泳道3为15AX34的条带大小估算为无；泳道4为15AX36的条带大小估算为无；泳道5为15AX38的条带大小估算为无；泳道6为15AX39的条带大小估算为无；泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp；泳道9为15JGS2的条带大小估算为无；泳道10为15JGS4的条带大小估算为无；泳道11为15JGS11的条带大小估算为无；泳道12为15JGS35的条带大小估算为无；泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。图12为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱；泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道2为单17-7-1的条带大小为2414bp；泳道3为15FY8的条带大小估算为无；泳道4为15FY13的条带大小估算为无；泳道5为15FY14的条带大小估算为无；泳道6为14DBS50的条带大小估算为无；泳道7为15LQ4的条带大小估算为无；泳道8为阴性对照，无条带。图13为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱；泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp；泳道2为15JJ5的条带大小估算为无；泳道3为15JJ7的条带大小估算为无；泳道4为15JJ8的条带大小估算为无；泳道5为15JJ10的条带大小估算为无；泳道6为15JJ14的条带大小估算为无；泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp；泳道9为15JJ17的条带大小估算为无；泳道10为15JJ18的条带大小估算为无；泳道11为15AX22的条带大小估算为无；泳道12为15AX27的条带大小估算为无；泳道13为15AX30的条带大小估算为无。图14为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱；泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp；泳道2为15AX33的条带大小估算为无；泳道3为15AX34的条带大小估算为无；泳道4为15AX36的条带大小估算为无；泳道5为15AX38的条带大小估算为无；泳道6为15AX39的条带大小估算为无；泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp；泳道9为15JGS2的条带大小估算为无；泳道10为15JGS4的条带大小估算为无；泳道11为15JGS11的条带大小估算为无；泳道12为15JGS35的条带大小估算为无；泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。图15为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱；泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道2为单17-7-1的条带大小为2222bp；泳道3为15FY8的条带大小估算为无；泳道4为15FY13的条带大小估算为无；泳道5为15FY14的条带大小估算为无；泳道6为14DBS50的条带大小估算为无；泳道7为15LQ4的条带大小估算为无；泳道8为阴性对照，无条带。图16为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp。泳道2为15JJ5的条带大小估算为无。泳道3为15JJ7的条带大小估算为无。泳道4为15JJ8的条带大小估算为无。泳道5为15JJ10的条带大小估算为无。泳道6为15JJ14的条带大小估算为3000bp左右。泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp。泳道9为15JJ17的条带大小估算为无。泳道10为15JJ18的条带大小估算为无。泳道11为15AX22的条带大小估算为无。泳道12为15AX27的条带大小估算为无。泳道13为15AX30的条带大小估算为无。图17为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道1为单17-7-1的条带大小为2414bp。泳道2为15AX33的条带大小估算为无。泳道3为15AX34的条带大小估算为无。泳道4为15AX36的条带大小估算为无。泳道5为15AX38的条带大小估算为无。泳道6为15AX39的条带大小估算为无。泳道8为单17-7-1的条带大小为2414bp。泳道9为15JGS2的条带大小估算为无。泳道10为15JGS4的条带大小估算为无。泳道11为15JGS11的条带大小估算为无。泳道12为15JGS35的条带大小估算为无。泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。图18为引物S11-2-F3和S11-2-R3对应的SCAR条带图谱泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道2为单17-7-1的条带大小为2414bp。泳道3为15FY8的条带大小估算为无。泳道4为15FY13的条带大小估算为无。泳道5为15FY14的条带大小估算为无。泳道6为14DBS50的条带大小估算为无。泳道7为15LQ4的条带大小估算为无。泳道8为阴性对照，无条带。图19为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp。泳道2为15JJ5的条带大小估算为无。泳道3为15JJ7的条带大小估算为无。泳道4为15JJ8的条带大小估算为无。泳道5为15JJ10的条带大小估算为无。泳道6为15JJ14的条带大小估算为无。泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp。泳道9为15JJ17的条带大小估算为无。泳道10为15JJ18的条带大小估算为无。泳道11为15AX22的条带大小估算为无。泳道12为15AX27的条带大小估算为无。泳道13为15AX30的条带大小估算为无。图20为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道1为单17-7-1的条带大小为2222bp。泳道2为15AX33的条带大小估算为无。泳道3为15AX34的条带大小估算为无。泳道4为15AX36的条带大小估算为无。泳道5为15AX38的条带大小估算为无。泳道6为15AX39的条带大小估算为无。泳道8为单17-7-1的条带大小为2222bp。泳道9为15JGS2的条带大小估算为无。泳道10为15JGS4的条带大小估算为无。泳道11为15JGS11的条带大小估算为无。泳道12为15JGS35的条带大小估算为无。泳道13为15JGS38的条带大小估算为无。图21为引物S11-2-F4和S11-2-R4对应的SCAR条带图谱泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为14DBS50的PCR结果，泳道7为15LQ4的PCR结果，泳道8为阴性对照，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道2为单17-7-1的条带大小为2222bp。泳道3为15FY8的条带大小估算为无。泳道4为15FY13的条带大小估算为无。泳道5为15FY14的条带大小估算为无。泳道6为14DBS50的条带大小估算为无。泳道7为15LQ4的条带大小估算为无。泳道8为阴性对照，无条带。具体实施方式以下实施例所用蝉花单17-7-1菌株于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC注册保藏，保藏号为CGMCCNo.3453；其他不同地域蝉花分别采集自安溪编号分别为：15AX22，15AX27，15AX30，15AX33，15AX34，15AX36，15AX38，15AX39、九江编号分别为：15JJ5，15JJ7，15JJ8，15JJ10，15JJ14，15JJ17，15JJ18、井冈山编号分别为：15JGS2，15JGS4，15JGS11，15JGS35，15JGS38、富阳编号分别为：15FY8，15FY13，15FY14、大别山编号为：14DBS50、乐清编号为：15LQ4。上菌株均为蝉棒束孢。实施例1基于SCAR分子标记技术，先人工合成多个随机多态核苷酸序列作为引物，所述引物序列见表1。表1引物序列编号引物名称序列5'到3'SEQIDNO：1S11-2-F3GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACTSEQIDNO：2S11-2-R3GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGATSEQIDNO：3S11-2-F4CCTCCCGTCGCTCATTGTTSEQIDNO：4S11-2-R4TCGGGCAAATTTCAAGCGCCASEQIDNO：5S11-2-F1GCCCACAAGCCTCCTCAAGATSEQIDNO：6S11-2-R1GGACACCCATACTGGCACGASEQIDNO：7S11-2-F2CCCACAAGCCTCCTCAAGATSEQIDNO：8S11-2-R2TCGCCAGAGGGTCATACATTTTSEQIDNO：9S11-7-F1GGCTCAGAACAACTCGGGAATGSEQIDNO：10S11-7-R1TACGAGACGACGGAAGAAGGATSEQIDNO：11S11-10-F1CATAGGTGAAACCTGCGGACTGTSEQIDNO：12S11-10-R1TGGAACATTGGGAGAAGGGCTASEQIDNO：13S11-10-F2GTCAACTGGCTCACCAATGTCASEQIDNO：14S11-10-R2AATTCAACAGCCTCATACGATGTCTSEQIDNO：15S11-11-F1GAAGACGAAATCGACGAACAGTSEQIDNO：16S11-11-R1GTAAATGCGGCTCAGAACAACTSEQIDNO：17S11-7-F2GTAGACCCGTTGCAGAATACTAATGSEQIDNO：18S11-7-R2GTAGACCCGTCGATATTGATGAAGATSEQIDNO：19S11-10-F3CTGGGGGTCAATTCGGCTCATSEQIDNO：20S11-10-R3GTAGACCCGTTGTTAAGTTGGAGATTSEQIDNO：21S11-11-F2GCTCGGACGCTCAAGGTATCSEQIDNO：22S11-11-R2GTAGACCCGTTGCAGAATACTAATG采用CTAB法提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用上述引物进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测电泳条带。PCR反应条件如下：PCR反应程序：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min30sec，共循环35次；72℃10min，4℃保存。1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V40min；凝胶成像仪Alphamager拍摄。检测结果见图1-9。由电泳图可以看出，除引物S11-2-F3和S11-2-R3图8、S11-2-F4和S11-2-R4外图9，其他引物的电泳图中不同地域蝉花与单17-7-1菌株都具有一条或者多条相同的电泳条带，其中S11-7-F1和S11-7-R1、S11-11-F1和S11-11-R1PCR结果无条带；只有引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4的电泳图中，蝉花单17-7-1具有一条特异的条带，其片段长度分别为2414bp和2222bp，而其他不同地域的蝉花并不具有，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花。实施例2以实施例1筛选得到的引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4对蝉花单17-7-1建立对蝉花单17-7-1的鉴定方法。SCAR分子标记稳定性实验1：试验操作：1.CTAB法提取同一批次蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测电泳条带。2.PCR反应条件如下：PCR反应程序：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min30sec，共循环35次；72℃10min，4℃保存。3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V40min。4.凝胶成像仪Alphamager拍摄。实验结果：以S11-2-F3和S11-2-R3为引物，对同一批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱图10、图11、图12所示。以S11-2-F4和S11-2-R4为引物，对同一批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱图13、图14、图15所示。从电泳图谱上看，以同一批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段是一致的。从以上试验结果可以得出，SCAR标记检测同一批次的DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。SCAR分子标记稳定性实验2：试验操作：1.CTAB法提取不同批次蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测电泳条带。2.PCR反应条件如下：PCR反应程序：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min30sec，共循环35次；72℃10min，4℃保存。3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V40min。4.凝胶成像仪Alphamager拍摄。实验结果：以S11-2-F3和S11-2-R3为引物，对不同批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱图16、图17、图18所示。以S11-2-F4和S11-2-R4为引物，对不同批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱图19、图20、图21所示。从电泳图谱上看，以不同批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段基本是一致的。从以上试验结果可以得出，SCAR标记检测不同样本DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。从中可见采用引物S11-2-F3和S11-2-R3、S11-2-F4和S11-2-R4，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花的不同，因此利用SCAR分子标记技术并以引物S11作为鉴定蝉花单17-7-1的方法非常可行。序列表浙江泛亚生物医药股份有限公司一种蝉花菌株的SCAR分子标记鉴定方法22SIPOSequenceListing1.0125DNA人工序列ArtificialSequence1gtagacccgtgttgtatgacaaact25225DNA人工序列ArtificialSequence2gtagacccgtaaggagacggaggat25319DNA人工序列ArtificialSequence3cctcccgtcgctcattgtt19421DNA人工序列ArtificialSequence4tcgggcaaatttcaagcgcca21521DNA人工序列ArtificialSequence5gcccacaagcctcctcaagat21620DNA人工序列ArtificialSequence6ggacacccatactggcacga20720DNA人工序列ArtificialSequence7cccacaagcctcctcaagat20822DNA人工序列ArtificialSequence8tcgccagagggtcatacatttt22922DNA人工序列ArtificialSequence9ggctcagaacaactcgggaatg221022DNA人工序列ArtificialSequence10tacgagacgacggaagaaggat221123DNA人工序列ArtificialSequence11cataggtgaaacctgcggactgt231222DNA人工序列ArtificialSequence12tggaacattgggagaagggcta221322DNA人工序列ArtificialSequence13gtcaactggctcaccaatgtca221425DNA人工序列ArtificialSequence14aattcaacagcctcatacgatgtct251522DNA人工序列ArtificialSequence15gaagacgaaatcgacgaacagt221622DNA人工序列ArtificialSequence16gtaaatgcggctcagaacaact221725DNA人工序列ArtificialSequence17gtagacccgttgcagaatactaatg251826DNA人工序列ArtificialSequence18gtagacccgtcgatattgatgaagat261921DNA人工序列ArtificialSequence19ctgggggtcaattcggctcat212026DNA人工序列ArtificialSequence20gtagacccgttgttaagttggagatt262120DNA人工序列ArtificialSequence21gctcggacgctcaaggtatc202225DNA人工序列ArtificialSequence22gtagacccgttgcagaatactaatg25

权利要求：1.一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1，提取待检测菌株的DNA；步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增：SEQIDNO：1：GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；SEQIDNO：2：GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT；步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的电泳条带图谱；步骤4，将步骤3获得的待检测菌株图谱进行分析获得判定结果。2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤2的引物为：SEQIDNO：3：CCTCCCGTCGCTCATTGTT；SEQIDNO：4：TCGGGCAAATTTCAAGCGCCA。3.如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系为：4.如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃30秒，55℃30秒，72℃2.5分钟，共循环35次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。5.如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4中，将步骤3获得的SCAR条带图谱进行分析，待检测菌株在3000bp～2000bp之间具有一条条带，鉴定待检测菌株为蝉花菌株单17-7-1菌株。

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