申请/专利权人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

申请日：2017-12-20

公开（公告）日：2023-05-26

公开（公告）号：CN108118055B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/85;C12N15/86;C12N5/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.26#授权;2019.09.17#实质审查的生效;2018.06.05#公开

摘要：本发明涉及一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用，属于分子生物学技术领域。编码所述shRNA的DNA序列，如SEQIDNO1～3所示。所述的抑制牛FABP4基因表达的shRNA构建于载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有所述shRNA的重组载体作用于细胞，达到抑制牛FABP4基因表达的目的。该shRNA能有效抑制牛FABP4基因在mRNA及蛋白水平的表达。

主权项：1.一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

全文数据：一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用，属于分子生物学技术领域。背景技术[0002]脂肪酸结合蛋白4Fattyacidbindingprotein4，FABP4亦称aP2或A-FABP，属于脂肪酸结合蛋白超家族，编码132个氨基酸，相对分子质量约14.6kDa。它在脂肪组织中高表达，是成熟脂肪细胞中主要的胞质蛋白，约占细胞总蛋白的6%。研究表明FABP4能够可逆性地结合饱和及不饱和长链脂肪酸，促进脂肪酸的代谢和转运，调控脂类生成及降解，在介导胞内脂肪酸转运和能量代谢过程中起重要作用。猪和鸡的FABP4基因已被证实是肌内脂肪含量IMF的候选基因。[0003]随着RNA干扰技术的不断深入发展，将设计合成的ShRNA构建到慢病毒表达系统，进而感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。shRNA慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的SiRNA转染效率低、持续时间短等不足，已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能的有效途径之一。针对牛FABP4基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的载体，为今后深入研究牛FABP4基因的功能奠定了基础，可广泛应用于牛FABP4基因相关的细胞及动物模型，具有重要的应用前景和经济价值。发明内容[0004]本发明的目的是:提供一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用。[0005]技术方案是：[0006]本发明的第一个方面，提供了:[0007]一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1〜3所示。[0008]在一个实施例中，所述的shRNA优选核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。[0009]本发明的第二个方面，提供了:[0010]含有SEQIDNO.1〜3所示核苷酸序列的表达载体。[0011]所述的表达载体是质粒或者病毒。[0012]所述的表达载体，是指在HindIII和BamHl之间插入上述shRNA的pSilencer4.1-CMV0[0013]本发明的第三个方面，提供了:[0014]上述的表达载体的构建方法，包括如下步骤:将编码SEQIDNO.1〜3所示核苷酸序列DNA连接到载体中，构建表达载体。[0015]本发明的第四个方面，提供了:[0016]包含有上述表达载体的宿主细胞。[0017]本发明的第五个方面，提供了:[0018]上述的表达载体在制备抑制牛FABP4基因表达的试剂中的应用。[0019]有益效果[0020]1本发明提供了两对能有效抑制牛FABP4基因表达的DNA序列。[0021]⑵本发明构建了能稳定表达含有编码牛FABP4基因的shRNA序列的DNA序列的载体。附图说明[0022]图1是ACTB内参基因扩增曲线；[0023]图2是FABP4基因扩增曲线；[0024]图3是ACTB内参基因熔解曲线；[0025]图4是FABP4基因熔解曲线；[0026]图5是FABP4表达量的对比图；[0027]图6是细胞存活率对比图。具体实施方式[0028]下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0029]实施例IShRNA载体构建[0030]根据pSilencer4.1-CMV市售质粒）的多克隆位点，结合FABP4基因全序列，在FABP4基因的编码区（CodingSequence，CDS中寻找靶序列，利用在线SiRNA设计软件WhiteHead，参考小干扰RNA设计原则，进行初步设计挑选，并与NCBIgenebank中进行BLASTBasicLocalAlignmentSearchTool比对，去除与其他物种基因片段同源性高的序列;并查找相关文献原则，这样设计出来的成功率高。[0031]根据以上步骤初步设计出如下三条shRNA序列：[0033]本发明以pSilencer4.1-CMV质粒作为载体，利用了pSilencer4.1-CMV质粒中的多克隆位点上的HindIII和BamHl这2种限制性内切酶。该质粒转化细菌扩大培养时为氨苄抗性，筛选细胞时含潮霉素抗性。[0034]上述三组DNA序列均由公司合成，呈粉末状，分别加适量去核酸酶的水nuclease-freewater稀释，并使用紫外分光光度计测DNA浓度，均稀释至浓度为lygyl。并按以下量以及程序进行退火反应：[0035]退火体系：[0036]正义链2μ1[0037]反义链2μ1[0038]IXDNAAnnealingSolution补足至50μ1[0039]反应条件:90°C，3min，然后在37°C孵箱孵育I小时，即得退火产物，用去核酸酶的水将退火产物稀释至浓度为8ngyl，备用。[0040]1.酶切载体体系及反应条件[0041]反应体系：[0043]反应条件:37°C酶切过夜。[0044]2.琼脂糖凝胶电泳[0045]1配胶:根据DNA分子量选择琼脂糖凝胶的浓度，pSilenCer4.1-CMV质粒分子量约5000bp，故选用1%琼脂糖凝胶，S卩0.5g固体琼脂粉+50mlIXTAE;[0046]2加热凝胶溶液约2min，使之沸腾，变清亮透明，为使琼脂粉充分溶解，可加热两次，电泳效果较好，拖尾少；[0047]3待凝胶溶液冷却后60°C左右），加入3μIEB混匀；[0048]⑷在凝胶板上插好梳子，灌胶；[0049]5约半小时凝胶凝固后，放入电泳槽，倒入IΧΤΑΕ，液面超过凝胶表面；[0050]6上样，BM5000DNAMarker5ul，酶切后的质粒加入10μ16XIoadingbuffer混匀，每孔上样20μ1;[0051]⑺电泳120V，15-20min;[0052]⑻紫外照相，若需要回收质粒则在紫外长波长UV360nm下直接切胶，为防止紫外线对DNA的损伤，应尽量缩短暴露于紫外线的时间；[0053]⑼将酶切后的质粒切胶回收，按试剂盒说明书进行。[0054]3.接载体与目的片段[0056]24。：1_2小时，16。：连接过夜。[0057]4.转化及扩大培养[0058]1从-80°C冰箱中取出XLl-BlueMRF’感受态细胞冰浴融化约5min;[0059]2向感受态细胞悬液中加入连接产物10μ1混匀，冰浴中静置30min;[0060]3将EP管置于42°C水浴中热激90秒；[0061]⑷冰浴中冷却3min;[0062]5向每个EP管中加入700μ1无抗LB培养液，37°C摇床上震荡培养45min150rpmmin；[0063]⑹5000rpm离心3min，弃上清，保留ΙΟΟμΙ，重悬感受态细胞；[0064]7吸取ΙΟΟμΙ已转化的感受态细胞滴在含氨苄抗性的LB固体琼脂培养基上，将细胞均匀涂开，待平板上的液体被吸收后，倒置平板37°C培养12-16小时；[0065]⑻挑选3-4个大小合适的单克隆菌落扩大培养，加入适量含氨苄抗性的LB培养液37°C摇床震荡培养16小时。[0066]5.提取质粒[0067]质粒的提取按照市售的高纯度质粒小提中量试剂盒说明书进行;对提取的质粒使用紫外分光光度计检测浓度与纯度，得到的质粒的㈤260㈤280比值为1.7-1.9。[0068]6.酶切鉴定[0069]将该质粒经HindIII和BamHl双酶切后，酶切产物得到pSiIencer4.1-CMV酶切片段约5100bp和FABP4shRNA基因片段55bp，酶切后的琼脂糖凝胶电泳使用BM2000DNAMarker结果表明目的基因片段已成功并且正确插入pSiIencer4.1-CMV表达载体中。[0070]7.测序[0071]将提取的质粒10μ1送往中美泰和公司进行DNA测序，使用DNAStar软件将测序结果与所设计的革EshRNA进行比对，质粒构建成功。[0072]实施例2质粒转染[0073]实验材料[0074]1洁净工作台、2生物安全柜、3研究级倒置显微镜、4冷冻离心机、5二氧化碳孵箱、6体视镜、7DMEM完全培养基、8IXI3BS、9Trypsin-EDTA、104个shRNA慢病毒载体和空载对照慢病毒载体、11FABP4的过表达载体、12转染试剂、13293T细胞。[0075]1.铺板[0076]将293T细胞铺到IOcm培养皿，待细胞贴壁，转染前细胞密度60%-70%为宜，换上新鲜的培养基DMEM+10%FBS。[0077]2.转染[0078]2.1.质粒和转染试剂的混合:准备6个EP管，每个加入500yL生理盐水，分别对应加入过表达质粒、4个shRNA插入的质粒和1个空载质粒，每个质粒7-8yg，静止IOmin后，每管加入转染试剂FG18yL每Iyg质粒加2.5μ1转染试剂），静止15min。[0079]2.2.转染:将上一步准备的质粒转染试剂混合物，分别加到步骤1中的4个培养皿。6h后换上新鲜培养基。[0080]3.荧光观察[0081]转染48h后，293T的细胞荧光率有80%以上;可收集细胞。消化离心，pbs洗一遍，放入-80°C冰箱。[0082]实施例3[0083]实验材料[0084]1ABI7500荧光定量PCR仪（lifetechnology公司）、2TGL-16M低温冷冻离心机湘仪）、3SW-CJ-ID单人净化工作台（沪净净化）、4HR40-IIA2生物安全柜（Haier、5SMA4000超微量分光光度计Merinton、696孔板（美国lifetechnology、75个细胞样本、8引物（lifetechnology公司合成）、9BestarTMqPCRRTKit德国DBI货号：081-2220、10Bes:tar®SybrGreenqPCRmastermix德国DBI货号：DBI-2043。[0085]I.RNA的抽提[0086]RNA的提取按lifetechnology公司提供的Triozol使用说明进行。程序如下：[0087]1往细胞培养板中加入ImlTRIzol，反复吹打几次后吸出，置于1.5ml离心管；[0088]2加入0.2mL氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀60s请勿涡漩激烈振荡），室温静置3min，12，OOOg，4°C离心15min，置于冰上；[0089]3溶液分为三层，RNA溶解在水相中，小心吸取500yL水相至另一个新的RNasefree的EP管中；[0090]⑷加入500yL异丙醇，-20度放置Ih，12，OOOg，4°C离心IOmin，离心后管底出现RNA沉淀，弃上清；[0091]⑸加入Iml75%乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；[0092]⑹超净工作台上吹干样品10min，加入40yLRnaseFree水溶解沉淀。[0093]2.去基因组DNA和cDNA的合成[0094]将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10，OOOg离心Imin，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA0[0095]把RNA在65°C条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却2min。[0096]逆转录反应：[0098]反应条件：[0099]37〇C,15min.[0100]98〇C,5min.[0101]4°C,hold[0102]反应结束后，用灭菌去离子水将cDNA稀释5倍，-20°C保存。[0103]3.RNA质量检测[0104]紫外分光光度计测定RNA浓度。[0106]4·实时荧光定量PCR[0107]每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20yL，根据表1配置。反应条件为：[0109]循环结束后从60°C升高到98°C获取熔解曲线。[0110]20μ1荧光定量PCR反应体系[0112]使用的引物[0114]在不同样本中，为了检测待测基因的表达差异，需要将样本量，实验误差等因素均一化，这就需要通过内参基因（表达量均一的基因）的CT值来平衡这些实验差异，获得-ACT值。对于一个样本待测基因的-ACT，计算如下：[0115]-ACT=-【Mean检测基因CT值）-Mean内参基因CT值】[0116]S卩：检测基因CT值的平均数-内参基因CT值的平均数。[0117]对于两个样本间同一个检测基因表达量差异的计算公式为：[0118]-AACT=-ACT样本I-ACT样本2=-【样本1检测基因CT-内参基因CT】-【样本2检测基因CT-内参基因CT】。[0119]如果提供对照组，则对照组相对表达量为1。各样本相对表达量F计算公式如下：[0121]注:如果不提供对照组，我们把对照样品的目的基因的CT值的平均一对照样本的看家基因的CT的平均作为零来计算。此时待测组相对表达量F则为：[0123]名词解释：[0124]CT:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数[0125]CTMean:平均CT值[0126]Qty:绝对定量拷贝数[0127]QtyMean:绝对定量平均拷贝数[0128]-ACT:-样本平均CT值-内参平均CT值）[0129]2—2的-ACT指数次方[0130]ACTB内参和FABP4基因扩增曲线图1和图2所示，ACTB内参和FABP4基因熔解曲线如图3和图4所示，各组试验中FABP4表达量的抑制率对比如图5所示。[0131]抑制率如下表所示：[0133]实施例4细胞存活率[0134]将实施例2中转染了4个shRNA慢病毒载体和空载对照慢病毒载体的细胞消化下来接种于96孔板中，每孔8000个细胞，加入TRAIL蛋白至终浓度100ngml，刺激24h，去掉培养基，每孔加入11〇μ1含CCK-8的培养基（ΙΟΟμΙ培养基加10ylCCK-8，37°C温育，每隔一小时于MDSPECTRAMAX340分光光度仪上读取450nm处光吸收值，计算细胞成活率细胞成活率=实验组光吸收值对照组光吸收值X100%。每一组设定五个样品孔，每组实验重复三次。[0135]结果如图6所示，上述各个慢病毒对细胞的存活率影响较小，其中FABP4shRNAl构建的质粒具有较高的细胞存活率。

权利要求：1.一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1〜3所示。2.根据权利要求1所述的抑制牛FABP4基因表达的shRNA，其特征在于，所述的shRNA优选核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有SEQIDNO.1〜3所示核苷酸序列的表达载体。4.权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体是质粒或者病毒。5.权利要求3所述的表达载体，其特征在于，是指在HindIII和BamHl之间插入上述shRNA的pSilencer4.1-CMV。6.权利要求3〜5任一项所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：将编码SEQIDNO.1〜3所示核苷酸序列DNA连接到载体中，构建表达载体。7.包含权利要求3〜5任一项所述的表达载体的宿主细胞。8.权利要求3〜5任一项所述的表达载体在制备抑制牛FABP4基因表达的试剂中的应用。

百度查询： 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD