申请/专利权人：康姆普根有限公司

申请日：2016-02-19

公开（公告）日：2023-05-30

公开（公告）号：CN107580500B

主分类号：A61K39/395

分类号：A61K39/395;A61P35/00;G01N33/574;C07K16/28;C12N15/13

优先权：["20150219 US 62/118,208","20150331 US 62/141,120","20151001 US 62/235,823"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.30#授权;2018.03.23#实质审查的生效;2018.01.12#公开

摘要：本发明针对抗PVRIG抗体和其使用方法。

主权项：1.一种抗PVRIG抗体，其包含：SEQIDNO:885所示的vhCDR1、SEQIDNO:886所示的vhCDR2、SEQIDNO:887所示的vhCDR3；和SEQIDNO:889所示的vlCDR1、SEQIDNO:890所示的vlCDR2以及SEQIDNO:891所示的vlCDR3。

全文数据：抗PVRIG抗体和使用方法[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请根据35U.S.C.§119要求2015年2月19日提交的USSN62118,208和2015年3月31日提交的USSN62141，120以及2015年10月1日提交的USSN62235,823的优先权，这些专利全部明确地以全文引用的方式并入本文中。背景技术[0003]初始T细胞ttaifveTcel1为了被高产地活化必须从抗原呈递细胞APC接收两个独立信号。第一信号1是抗原特异性的，并且出现在T细胞抗原受体遇到APC上的恰当抗原-MHC复合体时。免疫反应的结局由第二抗原独立信号信号2决定，该信号通过T细胞共刺激分子结合其APC表达的配体来传递。这个第二信号可以是刺激性的（正性共刺激或抑制性的（负性共刺激或共抑制）。在不存在共刺激信号的情况下或在存在共抑制信号的情况下，T细胞活化被削弱或失败，这可能导致抗原特异性无反应状态称为T细胞无反应性），或可能弓丨起T细胞细胞凋亡性死亡。[0004]共刺激分子对通常由在APC上表达的配体和其在T细胞上表达的同源受体组成。共刺激分子的原型配体受体对是B7CD28和CD^CD^Lj?家族由在结构上相关的细胞表面蛋白质配体组成，它们可以向免疫反应提供刺激性或抑制性输入。B7家族的成员在结构上是相关的，其中胞外结构域含有至少一个免疫球蛋白可变结构域或恒定结构域。[0005]正性和负性共刺激信号在细胞介导的免疫反应的调节中均起重要作用，并且介导这些信号的分子已被证明是进行免疫调节的有效靶标。基于此认识，已经研发出了若干涉及共刺激分子的靶向的治疗途径，并且这些治疗途径显示为适用于通过在癌症患者中开启免疫反应或防止免疫反应关闭来预防和治疗癌症，并且适用于预防和治疗自身免疫疾病和炎症性疾病以及同种异体移植的排斥反应，各自通过关闭不受控制的免疫反应，或通过负性共刺激或共抑制在具有这些病理学病况的受试者体内诱导“关闭信号offsignal”。[0006]操控由B7配体传递的信号已经显示出治疗自身免疫性、炎症性疾病以及移植排斥反应的潜能。治疗策略包括使用针对共刺激对的配体或受体的单克隆抗体或使用由可以结合和阻断其恰当配体的共刺激性受体组成的可溶性融合蛋白来阻断共刺激。另一种途径是使用抑制性配体的可溶性融合蛋白诱导共抑制。这些途径至少部分地依赖于自身反应性或同种异体反应性T细胞它们分别是造成自身免疫疾病或移植中的致病过程的原因）的最终缺失，可能是因为在不存在共刺激其诱导细胞存活基因）的情况下，T细胞变得非常容易诱导细胞凋亡。因此，能够在不损害免疫系统防御病原体的能力的情况下调节共刺激信号的新颖药剂对治疗和预防这类病理学病况非常有利。[0007]共刺激通路在肿瘤发展中起重要作用。有趣的是，已经显示出，肿瘤通过抑制B7-CD28和TNF家族中的共刺激因子来阻碍T细胞活化以及通过吸引抑制抗肿瘤T细胞反应的调节性T细胞避开了免疫破坏参见Wang2006，“在癌症中通过肿瘤特异性CD4+调节性T细胞实现的免疫抑制（ImmuneSuppressionbyTumorSpecificCD4+RegulatoryTcellsinCancer”，《癌症生物学研讨会（Semin·Cancer.Biol·》16:73-79;Greenwald等人（2005，“B7家族再论TheB7FamilyRevisited”，《免疫学年鉴Ann.Rev.Immunol.》23:515_48;Watts2005，“T细胞反应的共刺激中的TNFTNFR家族成员（TNFTNFRFamilyMembersinCo-stimulationofTCellResponses”，《免疫学年鉴》23:23_68;Sadum等人，（2007“鼠类和人类癌症的免疫特征揭示了独特的肿瘤逃避机制和新的癌症免疫疗法靶标ImmuneSignaturesofMurineandHumanCancersRevealUniqueMechanismsofTumorEscapeandNewTargetsforCancerImmunotherapy”，《临床癌症石开究Clin.Canc.Res.》1313:4016-4025。这类肿瘤表达的共刺激分子已经变成了引人注目的癌症生物标志物并且可以充当肿瘤相关抗原TAA。此外，共刺激通路已被鉴别为是在起始水平和效应子功能上减弱肿瘤转移内的T细胞依赖性免疫反应的免疫检查点。随着经过工程改造的癌症疫苗继续改良，渐渐明白，这类免疫检查点是疫苗诱导治疗性抗肿瘤反应的能力的主要障碍。为此，共刺激分子可以充当主动疫苗接种和被动抗体介导）癌症免疫疗法的佐剂，提供打击免疫耐受性和刺激免疫系统的策略。[0008]在过去的十年内，已经研发出针对各种共刺激蛋白质的激动剂和或拮抗剂来治疗自身免疫疾病、移植物排斥反应、过敏以及癌症。举例来说，CTLA4-Ig阿巴西普Abatacept，Orencia®被批准用于治疗RA，经过突变的CTLA4-Ig贝拉西普Belatacept，Niil〇jix®用于预防急性肾脏移植排斥反应，以及抗CTLA4抗体伊匹单抗Ipilimumab，Yervoy®最近被批准用于治疗黑素瘤。还批准了其它共刺激调节剂，如默克公司MerckKeytmtia®和BMSΟρίϋνο®^^；ΐΗ-1抗体，它们已被批准用于癌症治疗并且同时还在病毒感染测试中。[0009]因此，本发明的目标是提供PVRIG免疫调节抗体。发明内容[00Ί0]因此，本发明的目标是提供活化患者的细胞毒性T细胞CTL的方法，包含向患者投予抗PVRIG抗体，其中患者的CTL的亚组被活化。[0011]本发明的另一个目标是提供活化患者的NK细胞的方法，包含向患者投予抗PVRIG抗体，其中患者的NK细胞的亚组被活化。[0012]本发明的额外目标是提供活化患者的γδΤ细胞的方法，包含向患者投予抗PVRIG抗体，其中患者的γδτ细胞的亚组被活化。[0013]本发明的另一个目标是提供活化患者的Th1细胞的方法，包含向患者投予抗PVRIG抗体，其中患者的Th1细胞的亚组被活化。[0014]本发明的额外目标是提供抑制患有与PVRIG和PVLR2的相互作用相关的病况的患者体内的这种相互作用的方法，包含向患者投予抗PVRIG抗体。[0015]本发明的另一个目标是提供治疗患者的癌症的方法，包含向患者投予抗PVRIG抗体，其中所述癌症被治疗。[0016]本发明的额外目标是提供如以上所概述的方法，其中抗PVRIG抗体包含选自以下组成的组的抗体的vhCDRl、vhCDR2、vhCDR3、vlCDRl、vlCDR2和vlCDR3序列：CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、〇?八.7.040、〇?厶.7.046、〇?厶.7.047、〇?厶.7.049以及〇卩厶.7.050。[0017]本发明的额外目标是提供如以上所概述的方法，其中抗PVRIG抗体与包含选自以下组成的组的抗体的vhCDRl、vhCDR2、vhCDR3、vlCDRl、vlCDR2和vlCDR3序列的抗体竞争结合：CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、〇?八.7.036、〇?厶.7.040、〇?厶.7.046、〇?厶.7.047、〇?厶.7.049以及〇卩厶.7.050。[0018]本发明的另一个目标是提供如以上所概述的方法，其中抗PVRIG抗体选自以下组成的组：CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、〇?八.7.036、〇?厶.7.040、〇?厶.7.046、〇?厶.7.047、〇?厶.7.049以及〇卩厶.7.050。[0019]本发明的额外目标是提供如以上所概述的方法，其中抗PVRIG抗体与选自以下组成的组的抗体竞争结合：CPA·7·001、CPA·7·003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、〇卩八.7.033、〇?八.7.034、〇?八.7.036、〇?八.7.040、〇?八.7.046、〇?八.7.047、〇卩八.7.049以及CPA.7·050〇[0020]本发明的另一个目标是提供如以上所概述的方法，其中抗PVRIG抗体包含选自以下组成的组的抗体的vhCDRl^1^01?2、¥11〇1?3、¥1001?1、¥101?2和¥101?3序列：0^.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.UCHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA·7·550、CPA·7·001、CPA·7·003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、〇?八.7.034、〇?厶.7.036、〇?厶.7.040、〇?厶.7.046、〇?厶.7.047、〇?厶.7.049以及〇卩厶.7.050。[0021]本发明的额外目标是提供如以上所概述的方法，其中PVRIG抗体与选自包含¥11〇01?1、¥11〇1?2、¥11〇1«、¥1001?1、¥1〇1?2和¥1〇1«序列的抗?¥1?16抗体组成的组的抗体竞争结合，所述序列来自选自以下组成的组的抗体：CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、〇?八.7.040、〇?厶.7.046、〇?厶.7.047、〇?厶.7.049以及〇卩厶.7.050。[0022]本发明的另一个目标是提供诊断癌症的方法，包含a使来自患者的组织与抗PVRIG抗体接触;和b判定组织中PVRIG的过表达的存在作为癌症存在的指示。抗PVRIG抗体可以如此处所描述和如上文所概述。[0023]本发明的额外目标是提供抗原结合结构域，包括抗体，是抗PVRIG抗体，包含选自以下组成的组的抗体的vhCDRI、vhCDR2、vhCDR3、VICDRI、VICDR2和VICDR3序列：CPA·7·001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、〇?八.7.040、〇?厶.7.046、〇?厶.7.047、〇?厶.7.049以及〇卩厶.7.050。[0024]本发明的另一个目标是提供抗PVRIG抗原结合结构域包括抗体组合物，它们是抗PVRIG抗体，选自以下组成的组：CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA·7·013、CPA·7·014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049以及CPA.7.050。[0025]本发明的另一个目标是提供抗PVRIG抗原结合结构域包括抗体组合物，它们是抗PVRIG抗体，选自以下组成的组:11518-1、11518-2、11518-3、11518-4、11518-5、11524-1、11524-2、h524-3、h524-4、h530-l、h530-2、h530-3、h530-4、h530-5、h538.1-l、h538.1-2、h538.1-3、h538·l-4、h538·2-1、h538·2-2以及h538·2-3如图90中所描绘）。[0026]本发明的额外目标是提供抗原结合结构域，包括抗体，是抗PVRIG抗体，包含选自以下组成的组的·抗体的¥1^01?1、¥1^01?2、¥1^01?3、¥1001?1、¥1001?2和¥1001?3序列：CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA·7·549、CHA·7·550、CPA·7·001、CPA·7·003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、〇卩八.7.033、〇?八.7.034、〇?八.7.036、〇?八.7.040、〇?八.7.046、〇?八.7.047、〇卩八.7.049以及CPA.7·050〇[0027]本发明的另一个目标是提供核酸组合物，包含:a第一核酸，编码包含来自抗体的vhCDRl、vh⑶R2和vh⑶R3的重链可变结构域;和b第二核酸，编码包含来自抗体的vl⑶Rl、vlCDR2和和vlCDR3的轻链可变结构域。抗体选自以下组成的组：CPA.7.001、CPA.7.003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA·7·046、CPA·7·047、CPA·7·049、CPA·7·050、CHA·7·502、CHA·7·503、CHA·7·506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CPA.7.OOI、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、〇?八.7.040、〇?厶.7.046、〇?厶.7.047、〇?厶.7.049以及〇卩厶.7.050。[0028]本发明的额外目标是提供表达载体组合物，包含如此处和上文所概述的第一和第二核酸。[0029]本发明的另一个目标是提供宿主细胞，包含呈单一表达载体或两个表达载体的形式的表达载体组合物。[0030]本发明的额外目标是提供制造抗PVRIG抗体的方法，包含a在产生抗体的条件下培养本发明的宿主细胞与表达载体;和b回收抗体。附图说明[0031]图1是本发明的作用机制的示意图。[0032]图2示出了PVRIG在各种正常人类组织中的mRNA表达。[0033]图3示出了PVRIG在源自外周血和骨髓的各种免疫群体中的mRNA表达（基于GSE49910。[0034]图4示出了PVRIG在各种⑶3+淋巴细胞群体中的mRNA表达基于GSE47855。[0035]图5A、图5B和图5C示出了PVRIG在特异性细胞群体中的mRNA表达。图5A示出了PVRIG在通过激光捕获显微镜获得的特异性细胞群体中的mRNA表达基于GSE39397。图5B示出了PVRIG在来自正常患者和癌症患者的⑶4T细胞中的mRNA表达以及来自引流淋巴结和TIL形式乳腺癌患者的表达形式⑶4T细胞表达基于GSE36765。图5C示出了PVRIG在源自滤泡性淋巴瘤肿瘤和扁桃体的⑶8和⑶4T细胞中的mRNA表达基于GSE27928。[0036]图6示出了基于GTEx的正常组织中的PVRIG表达。表达水平以log2RPKM值每一百万个读数每千碱基所鉴别到的片段示出。超过1的值视为高表达。组织按照中位值表达从上到下排列。图上的每个点表示单一样品。[0037]图7示出了基于TCGA的癌组织中的PVRIG表达。表达水平以log2RPKM值每一百万个读数每千碱基所鉴别到的片段示出。超过1的值视为高表达。组织按照中位值表达从上到下排列。图上的每个点表示单一样品。[0038]图8显示三个类别的富集分析结果的热图表示:蛋白质相互作用、通路以及疾病相关性。结果按照每行的平均P值从上到下排列。每个类别仅显示前10个结果。灰色正方形指示P值0.55,使用至少50个样品）。如热图中所示，PVRIG与T细胞基因表达特征相关，T细胞基因表达特征与免疫反应和免疫疾病非常相关。[0039]图9示出了正常皮肤对比黑素瘤中的PVRIG表达GTEx和TCGA分析）。这类过表达在额外的实体肿瘤中观察到了并且是由肿瘤微环境中的浸润性淋巴细胞和NK细胞造成的。在正常情况下，不存在浸润免疫细胞并且因此PVRIG表达水平非常低。[0040]图10示出了来自TCGA样品的黑素瘤中的PVRIG和roi与肺腺癌、结肠腺癌和黑素瘤中的若干T细胞标志物的相关性。标志物⑶3是T细胞的通用标志物并且也在NKT细胞上表达。⑶4和⑶8标志物用于表征T细胞亚群。[0041]图11显示了PVRIG在人类PBL上的表达。评估了源自两个供体的人类PBL的PVRIG表达。供体61和供体40均显示由抗PVRIG特异性抗体显著染色。[0042]图12显示，PVRIG-Ig与所测试的所有四个人类黑素瘤细胞系MEL-23、Mel-624和Mel-624.38以及mel-888全部展现强结合。结合不受与经过工程改造的黑素瘤特异性T细胞共培养的影响。灰线对应于同种型对照，黑色实线对应于PVRIG-E⑶-Ig。[0043]图13是PVRIG与T细胞和T细胞亚群的相关性。CD3G是T细胞受体复合体的组分，CD4是T辅助细胞的标志物并且CD8A是用于鉴别细胞毒性T细胞的CD8蛋白质的组分。PVRIG与许多类型的肿瘤中的T细胞非常相关，所述肿瘤包括本文所示的肺腺癌、结肠腺癌和黑素瘤。[0044]图14示出了确认特异性筛选的代表性图像。来自初步筛选和EGFR表达载体阴性对照）的所有命中一式两份地重新排列表达并且用20ygmlPVRIG探测。高强度的特异性命中用绿色显示PVRL2。非特异性命中用黑色显示。另一个弱命中（MAG后来显示也结合其它配体，由此表明它不是特异性的。[0045]图15A到图15E示出了各种PVRIG-ECD-IgM:M蛋白质对小鼠CD4T细胞活化的影响。如材料和方法中所述，在存在lOygmlPVRIG-ECDIg批次#198或对照mIgG2a的情况下，用抗⑶3mAb2ygmL包被培养板。在存在2ygml可溶性抗⑶28的情况下，用每孔IXIO5个CD4+CD25-小鼠T细胞对孔进行涂铺。（A在刺激后48小时通过流式细胞仪分析CD69的表达，显示代表性直方图。每个条柱是一式两份培养的平均值，误差棒指示标准偏差。（B-C在刺激后48h收集培养上清液并且通过ELISA分析小鼠IL-2和IFNy水平。结果显示为一式两份样品的平均值土标准误差。⑶示出了固定的PVRIG-E⑶Ig图92BB对表面⑶69⑶和IFNγ分泌E的剂量反应效应。每个条柱是一式三份培养的平均值，误差棒指示标准误差。[0046]图16示出了使用特异性抗体对PVRIG转导的PBL的FACS分析。提供蛋白质染色阳性细胞的百分比（相对于空载体转导）。[0047]图17示出了使用特异性抗体对PVRIG与F4TCR共表达或呈含有F4TCR和NGFR的双顺反子载体形式转导的PBL的FACS分析。提供蛋白质染色阳性细胞的百分比（相对于空载体转导）。[0048]图18Α到图18Β示出了实验1图18Α和实验2图18Β中使用特异性单克隆抗体对TCR转导刺激的PBL进行的FACS分析，所述特异性单克隆抗体识别所转导的特异性TCR的β链的胞外结构域。提供染色阳性细胞的百分比。[0049]图19显示，PVRIG在表达F4的PBL上的表达引起在与SK-MEL23、MEL-624和MEL-624.38共培养后相比于空载体的表达来说IFNγ分泌减少。[0050]图20Α到图20Β显示，PVRIG和F4在PBL中通过共转导的表达（图20Α不影响与黑素瘤细胞系共培养时的IFNy分泌。PVRIG和F4在I3BL中使用双顺反子载体的表达（图20Β引起在与SK-MEL23、MEL-624和MEL-624.38共培养后相比于空载体的表达来说IFNγ分泌减少。[0051]图21显示，PVRIG和F4在PBL中使用双顺反子载体的表达引起在与黑素瘤细胞系共培养后T细胞介导的细胞毒性降低。[0052]图22显示，低水平、无变化和高水平耗竭T细胞的3个亚组中的PVRIG表达。耗竭T细胞基于4种标志物的高水平表达来选择:CD8A、PD-l、IlM-3和TIGIT。低表达样品未示出，因为没有任何可检测水平的PVRIG。[0053]图23A到图23B:异位表达的人类PVRIG蛋白质的蛋白质印迹分析Westernblotanalysis。使用抗flag抗体（23A或抗PVRIG抗体（23B，通过WB分析预先用编码人类PVRIG-flag的表达构建体泳道2或用空载体泳道1转染的HEK293细胞池的全细胞提取物。[0054]图24:通过FACS分析，HEK293细胞的细胞表面表达异位表达了人类PVRIG-flag蛋白质。使用抗PVRIGpAb亚诺法Abnova来分析稳定地表达人类PVRIG-flag蛋白质的HEK293细胞。表达空载体的细胞用作阴性对照。通过山羊抗小鼠PE结合的第二抗体进行检测并且通过FACS分析。[0055]图25描绘了实例中所用的人类PVRIG显示了两个不同的甲硫氨酸起始点）和PVRIGFc融合蛋白的全长序列。信号肽加下划线，ECD加双下划线，并且Fc结构域加下划虚线。[0056]图26描绘了如实例5中所示的PVRIG的结合伴侣bindingpartner人脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2PVLR2，也被称作nectin-2、CDl12或疱疹病毒侵入介质BHVEB的序列。PVLR2是人质膜糖蛋白。[0057]图27是PVRIG抗体对经过工程改造以过表达PVRIG的HEK细胞的特异性。数据显示，绝对几何MFIgMFI测量值随抗体浓度增加而增加。含有正方形的黑色虚线显示代表性抗人类PVRIG抗体CPA.7.021对HEKhPVRIG细胞的染色，并且含有圆形的黑色实线显示相同抗体对HEK亲本细胞的染色。[0058]图28通过qPCR评定各种癌细胞系中的PVRIGRNA。所示数据是PVRIGRNA在细胞系中相对于在expi细胞中的水平的倍数变化的相对表达，如通过2MAet法所评定。[0059]图29通过qPCR评定经过分选的PBMC亚组中的PVRIGRNA。所示数据是PVRIGRNA在每个亚组中相对于在HEKGFP细胞中的水平的倍数变化的相对表达，如通过2^AGt法所评定。D47到D49表示三个单独的供体。CD4表示⑶4T细胞，CD8表示⑶8T细胞，CD14表示单核细胞，并且⑶56表示NK细胞。[0060]图30A到图30B.图30A:在初始条件和活化条件下通过qPCR评定经过分选的CD4T细胞CD4和NK细胞NK中的PVRIGRNA。用人类T细胞刺激物戴诺磁珠dynabead和50UmlIL-2刺激⑶4T细胞3天。使NK细胞在50UmlIL-2中刺激3天。所示数据是PVRIGRNA在每个亚组中相对于在expi细胞中的水平的倍数变化的相对表达，如通过2「AAet法所评定。包括Jurkat作为阳性对照。D47到D49表示三个单独的供体。图30B在初始条件和活化条件下通过qPCR评定经过分选的⑶8T细胞中的PVRIGRNA。用人类T细胞刺激物戴诺磁珠和100UmlIL-2刺激CD8T细胞3天。所示数据是PVRIGRNA在每个亚组中相对于在expi细胞中的水平的倍数变化的相对表达，如通过2_AAet法所评定。包括Jurkat作为阳性对照。D49、70和71指示三个单独的供体。[0061]图31A到图31B是PVRIG与HEKhPVRIG工程改造的细胞系、HEK亲本细胞、CA46细胞以及Jurkat细胞的结合特征。HEKOE表示HEKhPVRIG细胞，HEKpar表示HEK亲本细胞。关于Jurkat和CA46数据，gMFIr指示PVRIG抗体染色的几何MFI相对于其对照的倍数差异。浓度指示计算gMFIr时的浓度。非可靠拟合指示抗体结合特征确实满足恰当的数学拟合要求。一些抗体因为不良的结合特征、特异性或可制造性，所以在一些条件下并没有测试。[0062]图32A到图32B是PVRIG与原代人类PBMC、cyno瞬时过表达细胞以及cyno原代PBMC的结合特征。ExpicynoOE表示经过cPVRIG瞬时转染的expi细胞，expipar表示expi亲本细胞。gMFIr指示PVRIG抗体染色的几何MFI相对于其对照的倍数差异。浓度指示计算gMFIr时的浓度。如图31中一样，一些抗体因为不良的结合特征、特异性或可制造性，所以在一些条件下并没有测试。另外，对选择抗体基于其结合cPVRIG瞬时细胞的能力或功能性进行鉴别分类triage以筛选出cynoPBMC亚组。PVRIG在⑶4T细胞上的表达类似于表中关于⑶8T细胞所述的表达。[0063]图33是PVRIG抗体对CA46和Jurkat细胞的特异性。数据显示，通过FACS得到的绝对几何MFIgMFI测量值随抗体浓度增加而增加。含有三角形的黑色实线显示抗人类PVRIG抗体CPA.7.021对CA46细胞的染色并且含有正方形的黑色实线显示Jurkat细胞的染色。OV-90含有倒三角形的虚线和NCI-H4411含有菱形的虚线）显示为阴性对照。[0064]图34A到图34D是PVRIG抗体与cPVRIG瞬时细胞的交叉反应性。数据显示了作为cPVRIG瞬时细胞上的负结合剂a-b，CPA.7.021和正结合剂c-d，CPA.7.024的抗体的实例。实心灰色直方图指示对照抗体，空心黑色直方图指示所关注的抗体。细胞用每种抗体按5ygml的浓度染色。[0065]图35通过qPCR评定经过分选的cynoI3BMC亚组中的cPVRIGRNA。所示数据是如通过定向于cPVRIG基因的两个独特区域的两组引物从三个cyno供体检测到的平均Ct值。[0066]图36A到图36C通过FACS评定aCD16+淋巴细胞NK细胞）、bCD14+CD56+骨髓细胞单核细胞）以及c⑶3+淋巴细胞T细胞上的cPVRIG蛋白质。数据显示为绝对几何MFI，其中黑色实线指示背景荧光水平。数据代表了在三个cyno供体中测试的我们的抗人类PVRIG抗体组的样品。[0067]图37A到图37B显示如实例5中所述，确定可成功阻断PVRIG与其对应物PVRL2的相互作用的Fab的⑶R序列。[0068]图38A到图38AA显示结合PVRIG并且阻断PVRIG和PVLR2的结合的本发明所列举的人类CPA抗PVRIG序列的重链可变结构域和轻链可变结构域、全长重链和轻链以及重链可变⑶R和轻链可变⑶R的氨基酸序列。[0069]图39A到图39H描绘了结合PVRIG但不阻断PVRIG和PVLR2的结合的本发明的八个人类CPA抗PVRIG序列的重链可变结构域和轻链可变结构域、全长重链和轻链以及重链可变⑶R和轻链可变⑶R的氨基酸序列。[0070]图40A到图40D描绘了所有产生的结合PVRIG的CPA抗PVRIG抗体序列的CDR，包括不阻断PVRIG和PVLR2的结合的那些。[0071]图41A到图41DD描绘了以下所列举的本发明CHA抗体中的每一个的可变重链和轻链以及¥11〇«1、¥1^01?2、¥11〇1?3、¥1〇01?1、¥101?2和¥101?3序列：0^.7.502、0^.7.503、CHA·7·506、CHA·7·508、CHA·7·510、CHA·7·512、CHA·7·514、CHA·7·516、CHA·7·518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、〇^.7.544、〇^.7.545、〇^.7.546、〇^.7.547、〇^.7.548、〇^.7.549以及〇^.7.550这些序列包括来自小鼠序列来自融合瘤的可变重链和轻链序列）。[0072]图42描绘了实例11的分库binning结果。不分库:CPA.7.029和CPA.7.026不与抗原结合）。[0073]图43是35种抗PVRIGmAb对抗原的成对阻断（“0”，红色方框或夹心（“Γ，绿色方框）的二元矩阵。矩阵左侧竖直列出的mAb是共价固定到ProteOn阵列上的mAb。矩阵顶部水平列出的mAb是注射了预混合抗原的分析物。克隆CPA.7.041仅作为分析物进行研究。黑色方框根据mAb的竖直阻断模式勾画了四个表位库epitopebin的轮廓。[0074]图44是图43的二元矩阵中的每个mAb的竖直结合模式的层次聚类Hierarchicalclustering树状图。每组内存在四个具有相同的表位阻断模式的mAb库。库1与2之间的唯一区别是库1中的mAb阻断抗原与克隆CPA.7.039的结合，而库2中的mAb能够与CPA.7.039—起对抗原进行夹心。克隆CPA.7.050能够与所有其它克隆一起对抗原进行夹心。[0075]图45A到图45JJ是指示CPA.7.036与所有其它固定的mAb的抗原阻断模式的传感图Sensorgram，这些是1号库的代表性数据。每个图代表具有不同的固定mAb的不同ProteOn芯片阵列点。蓝色反应是只有抗原的对照。黑色反应是CPA.7.036在摩尔浓度过量的抗原中的预混合溶液。灰色反应是只有mAb的对照注射液。CPA.7.36阻断抗原与除了CPA.7.050JJ以外的所有其它mAb的结合。[0076]图46A到图46JJ是指示CPA.7.034与所有其它固定的mAb的抗原阻断模式的传感图，这些是2号库的代表性数据。每个图代表具有不同的固定mAb的不同ProteOn芯片阵列点。蓝色反应是只有抗原的对照。黑色反应是CPA.7.34在摩尔浓度过量的抗原中的预混合溶液。灰色反应是只有mAb的对照注射液。CPA.7.34阻断抗原与除了CPA.7.039DD和CPA.7.050JJ以外的所有其它mAb的结合。[0077]图47A到图47JJ是指示CPA.7.039与所有其它固定的mAb的抗原阻断模式的传感图。CPA.7.039是3号库中的唯一mAb。每个图代表具有不同的固定mAb的不同ProteOn芯片阵列点。蓝色反应是只有抗原的对照。黑色反应是CPA.7.039在摩尔浓度过量的抗原中的预混合溶液。灰色反应是只有mAb的对照注射液。图C、F、H、J、L、N、R、S、Z、EE、GG、HH、II和JJ显示抗原的夹心。[0078]图48A到图48JJ是指示CPA.7.050与所有其它固定的mAb的抗原阻断模式的传感图。CPA.7.050是4号库中的唯一mAb。每个图代表具有不同的固定mAb的不同ProteOn芯片阵列点。蓝色反应是只有抗原的对照。黑色反应是CPA.7.50在摩尔浓度过量的抗原中的预混合溶液。灰色反应是只有mAb的对照注射液。只有图JJ显示了这样的抗原阻断，其中CPA.7.050本身被注射了w抗原。[0079]图49显示了实例12的SPR实验的结果。[0080]图50A到图50Q是多种浓度的抗PVRIGfab在注射到所捕获的人类PVRIG融合蛋白黑线）上的上清液中的SPR传感图数据。红线显示与多种浓度的fab的1:1球形动力学拟合，用于评估相互作用的kjPkd。字母指示表1中列出的克隆，表1还列了所得速率常数和所计算的KD。[0081]图5IA到图5IC是克隆CPA·7·009㈧、CPA丄003⑶和CPA·7·014C与所捕获的人类PVRIG融合蛋白的结合的SPR传感图。这些是实例，其中传感图显示了复杂的多相动力学，并且因此无法可靠地估计速率常数。[0082]图52A到图52B显示了实例5中的“额外验证研究4”的阻断研究的结果。[0083]图53显示，在同种异体活化之后，PVRIG在⑶4+T细胞上以及在⑶8+T细胞和双阴性γδτ细胞上的表达上调。在所测试的两个供体中的一个的PBMC中观察到了这种上调。[0084]图54显示实例IG中所测试的人细胞系。[0085]图55显示实例IG中所测试的小鼠细胞系。[0086]图56Α到图56C.人类PVRIG在各种人癌细胞系中的转录物表达。通过qRT-PCR，使用TaqMan探针验证若干细胞系中的人转录物。直方图表示使用TaqMan探针Hs04189293_gl观察到的数据。Ct值详细列于表中。分析指示Jurkat、HUT78和HL60中的高转录以及THPl和RPMI8226细胞系中的低水平。[0087]图57A到图57B是小鼠PVRIG在各种小鼠细胞系中的转录物表达。通过qRT-PCR，使用TaqMan探针验证若干细胞系中的小鼠转录物。直方图表示使用TaqMan探针CC70L8H观察到的数据。Ct值详细列于表中。分析指示NIH3T3、Renca、SaIN和J774A.1中的高转录以及CT26和B104-1-1细胞系中的低水平。[0088]图58使用各种细胞系的全细胞提取物，用商业抗人类PVRIG兔多克隆抗体西格玛Sigma，目录号HPA047497通过WB分析PVRIG蛋白质的内源性表达。异位过表达人PVRIG的HEK293细胞泳道2或用空载体转染的细胞泳道1的提取物分别用作阳性对照和阴性对照。[0089]图59是用PVRIGsiRNA转染的Jurkat细胞系中的人PVRIG转录物的qRT-PCR分析。使用人PVRIGTaqMan探针#Hs04189293_gl，通过qRT-PCR分析经过人PVRIGsiRNA或乱序scrambledsiRNA转染的Jurkat人癌细胞系，并且用上表中所指出的两个管家基因housekeepinggene的几何平均值进行归一化。Ct值详细列于表中。指出PCR反应的技术性一式三份的标准偏差。[0090]图60是人PVRIG蛋白质在经过人PVRIGSiRNA转染的Jurkat人细胞系中的膜表达。用单克隆抗PVRIG抗体包括CPA.7.021左图，绿线）或IgG2同种型对照抗体左图，蓝线）和西格玛抗体右图，红线）或IgG右图，蓝线）对经过人PVRIGsiRNA转染的Jurkat细胞进行染色。用相同的抗PVRIG橙色或同种型对照左图红线是mAb染色;右图绿线是西格玛抗体对经过乱序siRNA转染的细胞进行染色。在细胞洗涤之后，向单独的西格玛抗体中添加PE-山羊抗小鼠结合的第二抗体。[0091]图61指示本报告中所述的结果的汇总，突出了在qPCR与FACS之间显示出相关性的细胞系，通过敲低knockdown来确认，HSKG-管家基因，+-阳性，NT-未测试，X-阴性，KD-敲低。[0092]图62指示本报告中所述的结果的汇总，突出了在qPCR与FACS之间显示出相关性的细胞系，通过敲低来确认。HSKG-管家基因，+-阳性，NT-未测试，X-阴性，KD-敲低。[0093]图63A到图63D描绘了所列举的本发明CPA抗体CPA.7.001到CPA.7.050中的每一个的¥11〇1?1、¥11〇1?2、¥11〇1?3、¥101?1、¥101?2和¥101?3序列是人类序列（来自噬菌体展示）。[0094]图64A到图64B显示了实例IB中的筛选的结果。[0095]图65是实例II中所用的抗体细节和染色浓度。[0096]图66A到图66C描绘了人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的序列。[0097]图67描绘了许多的人PVRIGECD片段。[0098]图68描绘了如实例13中所示的CPA.7.021的结合曲线。[0099]图69A到图69C是CD137和ro-Ι表面表达的检测。活化CD8+T细胞、CD4+T细胞和TIL并且随时间推移在如MM中所述的4个时间点进行监测。静息细胞或活化细胞首先针对淋巴细胞进行设门（gateFSC-A对比SSC-A，接着是活细胞设门，进一步针对单线FSCMKiKFSC-A、CD4CD8阳性细胞进行设门，并且进一步针对⑶137和HH进行设门。将PD-I左）和CD137右在活化时程内的不同时间点在ACD8+T细胞、⑶CD4+T细胞和CTIL上的表面表达针对同种型对照进行归一化。[0100]图70A到图70C是PVRIG在静息的和活化的⑶4+T细胞和⑶8+T细胞上的表达。活化CD4+和CD8+T细胞并且随时间推移在如MM中所述的4个时间点进行监测。将细胞用活力染料viabilitydye进行染色，接着与抗PVRIG和同种型对照7.5gml—起孵育，并且通过流式细胞仪评估。㈧在CD4+T细胞上的表达。在单一设门24h、48h、72h和144h之后，PVRIG相比于同种型对照在活的静息的（时间0和活化的⑶4+细胞上的表达。（B在⑶8+T细胞上的表达。在单一设门24h、48h、72h和144h之后，PVRIG相比于同种型对照在活的静息的（时间0和活化的CD8+细胞上的表达。示出了所获得的荧光强度值的几何平均值。（C在活化时程内用抗PVRIG-CPA.7.021抗体相比于人类IgG2同种型进行的倍数诱导染色的归一化。[0101]图71A到图71C是PVRIG在静息的和活化的TIL上的表达。活化TILMarti和209并且随时间推移在如MM中所述的4个时间点进行监测。将细胞用活力染料进行染色，接着与抗PVRIG和同种型对照7.5gml—起孵育，并且通过流式细胞仪评估。㈧在TILMarti上的表达。在单一设门24h、48h、72h和144h之后，PVRIG相比于同种型对照在活的静息的（时间0和活化的TIL上的表达。⑶在TIL209上的表达。在单一设门24h、48h、72h和144h之后，PVRIG相比于同种型对照在活的静息的（时间0和活化的TIL上的表达。示出了所获得的荧光强度值的几何平均值。（C在活化时程内用抗PVRIG-CPA.7.021抗体相比于人类IgG2同种型对照进行的倍数诱导染色的归一化。[0102]图72是PVRL2在单核细胞衍生的DC上的表达。示出了PVRL2随时间（天而变的表达含三角形的虚线相对于同种型对照含圆形的实线）。分化后的天数指示向单核细胞中添加GM-CSF和IL-4后的时间。[0103]图73A到图73B是PVRIG在MLR中在⑶4和⑶8T细胞上的表达。示出了PVRIG在增殖性CFSE低和非增殖性T细胞CFSE高上的表达。数据源自三个单独的⑶3T细胞供体和一系列PVRIG抗体。在X轴上度量CFSE并且在Y轴上度量PVRIG表达。前3个系列的散点图指示PVRIG在⑶4T细胞上的表达，并且后3个系列指示在⑶8T细胞上的表达。[0104]图74A到图74B是PVRIG在MLR中在⑶4和⑶8T细胞上的归一化表达。在所分析的所有抗体中，示出了来自三个单独的⑶3T细胞供体的PVRIG相对于mlgGl同种型对照的表达。[0105]图75A到图75BPVRIG抗体增加了MLR中的T细胞增殖。示出了来自用所指示的PVRIG抗体处理过的MLR分析的CFSE低细胞的百分比。每个图表示一个单独的⑶3T细胞供体。[0106]图76是PVRIG抗体在T细胞上的基于FACS的表位分析。在T细胞与源自我们的融合瘤操作的未结合的PVRIG抗体预孵育之后指示结合的CPA.7.021源自噬菌体周期（phagecampaign以及相关对照的结合水平。对源自MLR的CFSE低T细胞进行分析。[0107]图77是PVRIG抗体对经过工程改造以过表达PVRIG的HEK细胞的特异性。数据显示，绝对几何MFIgMFI测量值随抗体浓度增加而增加。含有正方形的黑色虚线显示代表性抗人类PVRIG抗体CPA.7.518对HEKhPVRIG细胞的染色，并且含有圆形的黑色实线显示相同抗体对HEK亲本细胞的染色。[0108]图78PVRIG抗体显示出对Jurkat细胞的特异性。数据显示，通过FACS得到的绝对几何MFIgMFI测量值随抗体浓度增加而增加。含有正方形的黑色虚线显示抗人类PVRIG抗体CPA.7.518对Jurkat细胞的染色，并且含有圆形的黑色实线显示用mlgGl对照抗体进行的染色。[0109]图79Ailj图79B是PVRIG融合瘤抗体与HEKhPVRIG工程改造的细胞系、HEK亲本细胞以及Jurkat细胞的结合特征。HEKOE表示HEKhPVRIG细胞，HEKpar表示HEK亲本细胞。关于Jurkat数据，gMFIr指示PVRIG抗体染色的几何MFI相对于其对照的倍数差异。浓度指示计算gMFIr时的浓度。无结合指示抗体不结合到所测试的细胞系。突出显示的抗体是‘前四名’所关注的抗体。[0110]图80A到图80B是PVRIG融合瘤抗体与原代人类roMC、cyno过表达细胞以及cyno原代PBMC的结合特征。ExpicynoOE表示经过cPVRIG瞬时转染的expi细胞，expipar表示expi亲本细胞。gMFIr指示PVRIG抗体染色的几何MFI相对于其对照的倍数差异。浓度指示计算gMFIr时的浓度。未测试指示因为缺少与人类HEKhPVRIG、expicPVRIG细胞的结合或不符合PBMC亚组的结合要求而未进行测试的抗体。突出显示的抗体是‘前四名’所关注的抗体。[0111]图81A到图81B是PVRIG抗体在基于FACS的竞争分析中的阻断能力的汇总。指出了抑制的IC5Q。无IC5Q指示这些抗体是非阻断剂。突出显示的抗体是‘前四名’所关注的抗体。[0112]图82是在用siRNA电穿孔24h后在TIL中进行的KD验证。TIL用抗PVRIG或抗PD-I进行染色，通过FACS分析。计算KD群体相对于用相关抗体染色的SCR的百分比。[0113]图83A到图83C将KDTILMART-1特异性与黑素瘤细胞624在1:1E:T中共培养18h，并且用抗⑶8a抗体以及抗⑶137抗体染色，通过FACS分析。绘制了几何平均荧光强度㈧。还收集了共培养上清液并且在ThlTh2Thl7细胞微珠阵列分析中进行测试以检测所分泌的细胞因子。检测IFNγ和TNF水平B、C。通过比较每种处理与SCR对照来计算处理效果的百分比。图显示了2个独立实验的代表性数据。通过一式三份样品的学生t检验Student'st-test*P彡0·05，**Ρ彡0.01比较各处理。[0114]图84Α到图84Β将KDTILF4gplOO特异性）与黑素瘤细胞624在1:3Ε:Τ中共培养18h，并且用抗⑶8a抗体以及抗⑶137抗体染色，通过FACS分析。绘制了几何平均荧光强度A。还收集了共培养上清液并且在ThlTh2Thl7细胞微珠阵列分析中进行测试以检测所分泌的细胞因子。检测IFNy水平B。通过比较每种处理与SCR对照来计算处理效果的百分比。图显示了2个独立实验的代表性数据。通过一式三份样品的学生t检验0.01比较各处理。[0115]图85A到图85B将TIL与黑素瘤细胞624在1:IE:T下在存在抗PVRIG抗体CPA.7.021;10ygml、抗TIGIT10A7克隆；10ygml或其组合的情况下共培养18h。收集上清液并且在ThlTh2Thl7细胞微珠阵列分析中进行测试以检测所分泌的细胞因子。检测IFNγA和TNF⑶水平。通过一式三份样品的学生t检验比较各处理。[0116]图86A到图86F将MART-I或209TIL与黑素瘤细胞624在1:1E:T下在存在抗PVRIG抗体CPA.7.021;10ygml、抗DNAMlDXll克隆；10ygml或其组合的情况下共培养18h。收集上清液并且在ThlTh2Thl7细胞微珠阵列分析中进行测试以检测所分泌的细胞因子。检测IFNyA、D和TNFB、E水平。针对CD137的表面表达对TIL进行染色C、F。[0117]图87A到图87B将TILF4与黑素瘤细胞624在1:3E:T下在存在抗PVRIG抗体CPA.7.021;10ygml、抗TIGIT10A7克隆；10ygml、抗PDlmAb1B8,默克公司；10ygml或其组合的情况下共培养18h。收集上清液并且在ThlTh2Thl7细胞微珠阵列分析中进行测试以检测所分泌的细胞因子。检测IFNγ㈧和TNF⑶水平。[0118]图88Α到图8811描绘了CHA.7.518、CHA.7.524、CHA.7.530、CHA.7.538_1CHA.7.538_2各自的四个人源化序列。应注意，CHA.7.538_2的轻链与CHA.7.538j相同。各自的“ΗΓ是与人类框架的“CDR交换”，无改变。后续序列改变了用较大的粗体字显示的框架改变。CDR序列用粗体表示。根据网站www.bioinf.org.ukabs，QR定义是AbM。人类生殖系和连接序列来自，即国际|mMunoGene:Tics:SKl!息系统www.imgt.org创建者和管理者:法国蒙彼利埃Montpellier,France的Marie-PauleLefranc。残基编号显示为序列的（seq或根据Chothia，根据网站www.bioinf.org.ukabsAbM90%CD8+解冻24小时。在12ml补充有300Uml的rhIL2Biolegend509129的TIL培养基（MDM+10%人类血清+1%Glutamax+l%丙酮酸钠+1%非必需氨基酸+1%青霉素-链霉素）中解冻细胞。使细胞从冷冻中恢复24小时。[0576]分析条件：在恢复之后，在四种不同条件下测试TIL:1静息，采用300Uml的IL2Biolegend目录号589106;2T细胞的多克隆活化，使用lygml的板结合抗CD3抗体eBioscience克隆0KT3,目录号16-0037-85+2ygml的抗CD28抗体（eBioscience克隆CD28.2目录号16-0289-85+300Uml的几2。3与Mel888LIMSID:CL-216黑素瘤细胞HLA-A2阴性）共培养（1:1和4与Mel624UMSIDCL-218黑素瘤细胞HLA-A2+Martlgp100阳性共培养1:1。[0577]在静息活化共培养12小时之后，通过FACS测试细胞的PVRIG表达以及PVRIG通路的其它成员和其它表面标志物的表达。[0578]染色细胞：12小时后收集细胞并用PBS洗涤两次。在室温下用补充有11000的可固定活力染色efluor450BDhorizon目录号562247的PBS给细胞染色20分钟。在染色之后，用PBS洗涤细胞两次，并在冰上用补充有125的人类TruestainFC阻断液（Biolegend，422302的FACS缓冲液PBS+0.5%BSA+2mMEDTA+0.05%叠氮化物）染色15分钟。在FC阻断之后，在冰上用Ab给细胞染色30分钟并且浓度列于表1中。[0579][0581]在染色之后，将细胞洗涤一次并且再悬浮于FACS缓冲液中进行分析。使用补偿珠粒BD，552843进行补偿校正。用以上抗体给一个珠粒染色30分钟。用与细胞染色相同的浓度进行珠粒染色。在珠粒染色之后，在MacsQuantFACS机器上根据标准程序进行补偿。在MACSQuant分析仪（美天旎）上采集所有样品并且使用TreeStarFlowJo软件vlO.0.8分析数据。[0582]PVRIG在人类静息TIL上表达:将静息TIL与单独的300Uml的IL2培养12小时，针对PVRIG表达进行染色并且通过FACS分析。TIL的设门策略:首先根据FCS:SSC图中的大小和粒度对淋巴细胞设门，然后根据FSC-H和FSC-A对单一细胞设门，然后根据Vioblue:FSC图中的活力染料染色对活细胞设门，然后根据CD8:FSC图中的CD8染色对CD8+细胞设门。然后根据PVRIG染色在直方图中绘制PVRIG的表达水平。[0583]人类TIL上的PVRIG表达在用抗⑶3ab+抗⑶28ab活化后下调:将人类TIL与抗⑶3ab+抗⑶28ab+IL2培养12小时，针对PVRIG表达进行染色并且通过FACS分析。相比于静息TIL，所检查的所有三个TIL的表面上的PVRIG表达都在活化后下调数据未示出）。[0584]人类TIL上的PVRIG表达在与Mel888共培养后略微下调：将人类TIL与Mel888细胞共培养12小时，针对PVRIG表达进行染色并且通过FACS分析。相比于静息TIL，所检查的所有三个TIL的表面上的PVRIG表达都在与Mel888共培养后略微下调。[0585]人类TIL上的PVRIG表达在与Mel624共培养后下调：将人类TIL与Mel624细胞共培养12小时，针对PVRIG表达进行染色并且通过FACS分析。相比于静息TIL，所检查的所有三个TIL的表面上的PVRIG表达都在与Mel624共培养后略微下调。[0586]其它通路成员在静息TIL上的表达：将人类TIL单独与IL2共培养12小时，针对CD96、PVR、PVRL2、TIGIT和DNAMl的表达进行染色并且通过FACS分析。CD96、TIGIT和DNAMl在所检查的所有三个TIL上表达。PVR也在所有三个TIL的表面上表达，但是表达水平相对较低。未在任何TIL上检测到PVRL2。[0587]其它通路成员在经过抗⑶3ab和抗⑶28ab活化的TIL上的表达:将人类TIL与抗CD3ab和抗CD28ab培养12小时，针对〇96、？¥1?、？¥虬2、1'1611'和0祖11的表达进行染色并且通过FACS分析。在用抗CD3ab+抗CD28ab活化后，CD96下调，PVR略微上调，TIGIT略微上调并且DNAMl也上调。[0588]其它通路成员在与Mel888共培养的TIL上的表达:将人类TIL与Mel888细胞共培养12小时，针对〇96、？¥1?、？¥1^2、1'1611'和0财11的表达进行染色并且通过?403分析。在与Mel888共培养后，CD96下调，PVR高度上调，TIGIT和DNAMl下调，PVRL2也略微被诱导。[0589]其它通路成员在与Mel624共培养的TIL上的表达:将人类TIL与Mel624细胞共培养12小时，针对〇96、？¥1?、？¥此2、1'1611'和0祖11的表达进行染色并且通过?403分析。根据图1执行设门策略。在与Mel624共培养后，CD96下调，PVR高度上调，TIGIT稳定或略微上调，DNAMl下调并且PVRL2略微被诱导。[0590]PDl在TIL上的表达:将人类TIL单独与IL2培养12小时或用抗⑶3ab+抗CD28ab活化或与Mel888或与Mel624细胞共培养，针对PDl的表达进行染色并且通过FACS分析。如在图16和图17中可以看出，PDl仅在静息TIL412上表达。发现在与Mel888共培养后HH表达无变化。但是，在与Mel624共培养后或在用抗⑶3ab+抗⑶28ab活化后，所有三个TIL中的PDl皆上调。[0591]总结和结论:针对所测试的所有TIL:[0592]•抗卩¥1?16-〇?八.7.02113染色1'1“高达2.6倍）[0593]•在用抗CD3ab+抗CD28ab活化12小时后或在与Mel624共培养后，PVRIG表达下调几乎下调到背景水平）。[0594]•静息TIL表达CD96、TIGIT和DNAMl分别高达35、12和79倍）[0595]•在活化或与不相关的HLA-A2-黑素瘤共培养后，CD96表达下调从高达35倍到约11倍）[0596]•在用aCD3CD28ab活化后，DNAMl表达上调（从高达79倍到102倍），但是在TIL与Mel共培养后剧烈下调低至8倍）。[0597]•在TIL与mel888细胞系共培养后，TIGIT表达略微下调，并且在与Mel624共培养或用抗⑶3ab+抗⑶28ab活化后，稳定且略微上调。[0598]·PDl表达在活化后上调从0到18倍）[0599]•在TIL与黑素瘤共培养后检测到高水平的PVR从90%CD8+解冻24小时。在12ml补充有300Uml的rhIL2Biolegend509129的TIL培养基（niDM+lO%人类血清+l%Glutamax+l%丙酮酸钠+1%非必需氨基酸+1%青霉素-链霉素）中解冻细胞。使细胞恢复24小时。[0610]原代T细胞:在这个系列的实验中，使用两种不同供体：[0611]来自供体#147的CD4+和CD8+[0612]来自供体#186的CD4+和CD8+[0613]在实验开始之前，使人类原代细胞纯度95%解冻24小时。在补充有300Uml的rhIL2Biolegend509129的RPMI完全培养基（RPMI+10%FBS+l%Glutamax+l%丙酮酸钠+1%青霉素-链霉素）中解冻细胞。使细胞恢复24小时。[0614]分析条件:在恢复之后，使用T细胞的多克隆活化，采用lygml的板结合抗CD3抗体BD-pharmingen克隆Ucht-I，目录号555329、2ygml的抗CD28abeBioscience克隆CD28.2目录号16-0289-85和300Uml的IL2活化细胞。[0615]活化进行24h、48h、721^P144h。[0616]给细胞染色:收集细胞并用PBS洗涤。在室温下用补充有11000的可固定活力染色efluor450BDhorizon目录号562247的I3BS给细胞染色10分钟。在染色之后，将细胞用PBS洗涤两次并且用Ab在FACS缓冲液PBS+0.5%BSA+2mMEDTA+0.05%叠氮化物）中按图65中所列的浓度和图65中所列的浓度在冰上染色30分钟。在染色之后，将细胞洗涤一次并且再悬浮于FACS缓冲液中进行分析。[0617]结果:来自两个不同供体的人类T细胞和TIL保持未处理静息或如材料和方法中所述在各个时间点进行多克隆刺激。通过检测CD137和PD-I在每个时间点相比于同种型对照FMO的表面表达来评估细胞活化状态，如关于活化的CD8+、CD4+T细胞和TIL分别是图70A、B和C所示。正如所料，检测到PD-I和⑶137表达并且所述表达在活化后升高（图70A、B和C〇[0618]在静息的⑶4+和⑶8+T细胞上均观察到PVRIG表达，其中在⑶8+细胞上的表达6-8倍高于CD4+细胞3倍），并且在活化后表达减弱（图71A、B和C。在活化的第3到6天，在CD8+4-5倍和⑶4+2-3倍T细胞上的PVRIG表达增加，如在图71中可以看到。[0619]另外，也在Marti和209静息TIL上观察到了PVRIG表达，并且在活化后表达降低（图72A、B和C。在活化的第3到6天，PVRIG表达相比于活化的第1到2天增加，如在图72中可以看到。[0620]实例2:表达PVRIG的稳定转染细胞池的产生和表征[0621]产生过表达PVRIG人类和小鼠蛋白质的重组性稳定细胞系池，将其用于测定PVRIG对免疫的影响、用于PVRIG表征并且用于鉴别基于PVRIG的免疫调节治疗剂。[0622]材料和方法：[0623]试剂:DNA构建体：[0624]人类PVRIGflagpUC57[0625]人类PVRIGflagpCDNA3.1[0626]人类PVRIGflagpMSCV[0627]重组细胞：[0628]HEK293pCDNA3.1人类PVRIGflag[0629]HEK293pMSCV人类PVRIGflag[0630]商业抗体：[0631]抗PVRIG，西格玛目录号HPA047497，兔多克隆[0632]抗PVRIG，亚诺法目录号H00079037，BOl-小鼠多克隆[0633]使用PCR反应并且对PCR产物测序来进行小鼠PVRIG的全长验证。[0634]使用三对引物表3。[0635]表3:用于小鼠全长验证的引物的序列[0637]作为PCR反应的模板，使用NIH3T3细胞系的cDNA或三组商业cDNA的混合物：[0638]1.第I组cDNA，小鼠，Biochain，目录号C8334501心脏、脑、肾脏、肝脏）。[0639]2.第II组cDNA，小鼠，Biochain，目录号C8334502肺、胰腺、脾脏、骨骼肌）。[0640]3.cDNA，Clontech，目录号637301脑、心脏、第7天胚胎、睾丸、脾脏）。[0641]表达构建体[0642]通过基因合成（金斯瑞进行人类和小鼠PVRIG-flag的全长克隆，在pUC57载体中关于人类转录物使用密码子优化序列并且关于小鼠转录物使用非优化的序列，并且亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1或pMSCV中，产生表达质粒。[0643]亚克隆到pcDNA3.1中的人类PVRIG序列从人类PVRIG蛋白质的第二甲硫氨酸开始，而亚克隆到PMSCV中的人类PVRIG序列从人类PVRIG蛋白质的第一甲硫氨酸开始。[0644]-编码人类PVRIG-flag的构建体·[0645]使用pcDNA3.1，使用BamI和NheI限制酶，对金斯瑞合成的全长人类PVRIG基因进行亚克隆。[0646]编码小鼠PVRIG蛋白质的构建体：[0647]通过金斯瑞按以下合成编码小鼠序列的四个构建体：[0648]1.无标签的第一甲硫氨酸[0649]2.含有Flag的第一甲硫氨酸[0650]3.无标签的第二甲硫氨酸[0651]4.含有Flag的第二甲硫氨酸[0652]将合成基因亚克隆到p⑶NA3.1中。[0653]产生过表达PVRIG蛋白质的稳定转染子[0654]通过序列验证所得表达构建体并且随后将其用于如下所述的转染和产生稳定的池。由表达构建体编码的蛋白质序列如图103中所阐述。[0655]表达人类PVRIG-flag蛋白质的稳定转染子池的产生[0656]使用FUGENE6试剂（Roch，目录号11-988-387，用pCDNA3.1+人类PVRIG-flag质粒或用空载体PCDNA3.1+作为阴性对照转染HEK293ATCC，目录号:CRL-1573细胞。选择耐遗传霉素G418®ibco,目录号：11811-031的群体产生稳定池。[0657]使用脂质转染胺（Lipofectamine2000转染试剂（英杰（Invitrogen，目录号11668019，用pMSCV-人类PVRIG或用pMSCV空载体转染GP2-293包装细胞系（Clontech目录号631458。转染48小时后，收集含有病毒粒子的上清液，并且直接用于如下感染人类细胞系：[0658]用表达人类PVRIG的病毒粒子或用pMSCV空载体病毒粒子作为阴性对照感染册1-293ATCC，CRL-CRL-1573细胞。选择耐遗传霉素（Invivogen，目录号：58-58-2的群体产生稳定池。[0659]表达验证[0660]通过蛋白质印迹进行表达验证[0661]通过蛋白质印迹分析细胞池的全细胞提取物（30yg总蛋白质）。作为阴性对照，使用经过空载体转染的稳定细胞池的全细胞提取物。关于人类PVRIG-flag检测，如下使用抗flag和抗PVRIG抗体：[0662]•小鼠抗FlagM2-过氧化物酶，西格玛，目录号A8592,在TTBS5%BSA中1:1000稀释；[0663]•抗PVRIG，西格玛目录号HPA047497,兔多克隆，在TTBS5%BSA中1:200稀释。然后是山羊抗兔-HRP，Jackson，目录号：111-035-003，在5%乳TTBS溶液中1:20，000稀释。[0664]通过流式细胞仪FACS进行表达验证[0665]为了验证人类PVRIG蛋白质在重组性稳定池中的细胞表面表达，用在PBS中1:1000稀释过的可固定的活力染色450BD，562247将IXIO5个细胞在室温下染色10分钟。然后向细胞中添加经过1:200稀释的小鼠多克隆抗PVRIG亚诺法，目录号H00079037-B01或小鼠IgGl同种型对照生命技术公司），然后用山羊抗小鼠-PEJackson，目录号115-116-146染色。[0666]过表达人类PVRIG-Flag蛋白质的HEK293稳定池细胞的表达验证结果[0667]为了证实PVRIG蛋白质在稳定转染的HEK293细胞池中的表达，如材料和方法中所述，使用抗flag抗体或抗PVRIG抗体亚诺法），通过蛋白质印迹分析全细胞提取物。图24中所示的结果展示了对应于表达人类PVRIG的HEK293细胞池的提取物中预期约33kDa的蛋白质大小的条带，但在经过空载体转染的细胞中没有。[0668]为了证实PVRIG蛋白质的细胞表面表达，如材料和方法中所述，使用小鼠抗PVRIGpAb亚诺法），通过FACS分析过表达PVRIG-flagpCDNA3.1载体的经过稳定转染的HEK293细胞。图25中所呈现的结果显示，小鼠抗PVRIGpAb与稳定地表达人类PVRIG-flag的细胞灰色）的结合高于经过空载体转染的细胞浅灰色所观察到的。[0669]实例3:PVRIG-ECDIg融合蛋白产生[0670]PVRIGmECD-mlg融合蛋白（参见图103由小鼠PVRIG的ECD融合小鼠IgG2a的Fc组成，在ProBioGen德国）在CH0-DG44细胞中通过培养稳定细胞池12天，然后对所收集的细胞进行蛋白A纯化和制备型SEC纯化以去除聚集体而产生。在5mM柠檬酸钠、5mM磷酸钠钾、140mMNaCl、0·01%吐温（TweenpH5.5中配制最终产物。[0671]所用表达载体是ProBioGen的PBG-GPEX6。先后通过CMVEF1混合启动子、多腺苷酸化信号pA-1驱动PVRIG基因。载体含有允许使用嘌呤霉素选择转染后细胞的嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶基因，以及允许使用甲氨蝶呤methotrexateMTX选择转染后细胞的二氢叶酸还原酶基因。[0672]PVRIGhECD-hlg融合蛋白（参见图103由人类PVRIG的ECD融合人类IgGl的Fe组成，在铰链处含C220、C226和C229的S突变，在金斯瑞（中国）通过在CH0-3E7细胞中瞬时转染，培养6天，然后对所收集的细胞进行蛋白A纯化而产生。在PBSpH7.2中配制最终产物。[0673]所用表达载体是哺乳动物表达载体pTT5，其中由CMV启动子驱动PVRIG基因。[0674]实例4:PVRIG在人类PBL上的表达和PVRIG-Fc与黑素瘤细胞系的结合[0675]PVRIG是一种新颖的免疫检查点蛋白质，不希望因为单一的理论功能将它限制为T细胞上的⑶28样受体。在本研究中，评估了PVRIG在人类外周血淋巴细胞上的表达和PVRIG-ECD-Ig由人类PVRIG的胞外结构域融合人类IgGl组成与黑素瘤细胞系的结合。[0676]材料和方法[0677]使用在HLA-A2情况下呈递MART-I抗原的三个人类黑素瘤细胞系（SK-MEL-23、Mel-624和Mel-624.38作为CTL的靶标。不表达HLA-A2的Mel-888充当阴性对照。[0678]从TelHashomer血库获得来自健康的人类供体的血块黄层buffycoat。用PHA刺激外周血单核细胞并且培养3天，并且随后用基于MSCV的反转录病毒载体pMSGVl转导。在转导之后，使细胞在淋巴细胞培养基生物靶向（Biotarget培养基，胎牛血清（10%、L谷氨酰胺青霉素链霉素100个单位毫升）、IL-2300IU中再另外生长5天。[0679]为了评估I3BL上的PVRIG表达，用5ygmlPVRIG特异性抗体小鼠多克隆）在4度下给细胞染色30分钟。在洗涤之后，用FACS缓冲液中的FITC结合的山羊抗小鼠mAb1:250英杰，目录号A10667在暗处在4度下给细胞染色30分钟。在FACS缓冲液中洗涤两次之后，在带有CytekHTS的BD生物科学FACSCalibur上读取样品。[0680]为了评估PVRIG-Ig与黑素瘤细胞系的结合，将31-1^1^-23、161-624、161-624.38和mel-888细胞与经过F4转导或未经过转导表示为wo的PBL共培养，并且随后用20ygml的融合蛋白PVRIG-IgHH批号125染色。在FACS缓冲液中洗涤两次之后，用第二山羊抗人类PEJackson，目录号109-116-098给样品染色。[0681]结果[0682]为了评估PVRIG在原代人类白细胞上的内源性表达，用PHA刺激I3BL并且随后用空载体转导，并用抗PVRIG特异性抗体染色。如图11中所示，在两个不同供体中，相对于同种型匹配对照观察到抗PVRIG的染色。[0683]为了评估PVRIG在黑素瘤细胞系上的内源性表达和判定内源性表达是否受与抗原特异性T细胞共培养的影响，将4个不同的黑素瘤细胞系（SK-MEL-23、Mel-624、Mel-624.38和mel-888与表达或不表达F4gplOO特异性TCR的PBL共培养。随后用融合蛋白给细胞染色，融合蛋白由人类PVRIG的胞外结构域融合人类IgGl的Fc部分组成。如图12中所示，所测试的所有4个人类黑素瘤细胞系都展现与PVRIG-Ig的结合。在与黑素瘤反应性工程改造T细胞共培养之后，结合强度不受T细胞依赖性活化的影响。[0684]总结:本文中呈现的结果表明，PVRIG在PHA活化的人类原代外周血白细胞PBL上表达。另外，在本研究中测试的4个黑素瘤细胞系与由人类PVRIG的胞外结构域融合人类IgGl的Fc部分组成的融合蛋白结合，表明这些细胞系表达PVRIG的对应物。[0685]实例5:受体配体鉴别和验证[0686]使用细胞微阵列技术进行第一验证研究，细胞微阵列技术是用于筛选PVRIG与3559个分别在人类HEK293细胞中表达的全长人类质膜蛋白的相互作用。[0687]使人类HEK293细胞在用编码3559个全长人类膜蛋白的表达载体点样的载玻片上生长。将表达载体pIRES-hEGFR-IRES-ZsGreenl—式四份地点样在每一个载玻片上，并且用于确保在每一个载玻片上实现或超过转染效率的最小阈值。人类HEK293细胞用于反向转染表达。在细胞固定之后，将由PVRIG的E⑶融合人类IgGl组成的融合蛋白以20ygml添加到每个载玻片上。通过使用恰当的荧光第二抗体进行结合检测。筛选两个重复的载玻片组。使用ImageQuant软件®E分析和定量针对转染效率荧光图像。[0688]蛋白质‘命中（hit’定义为相比于背景水平显示出增加的信号的一式两份的点。这使用在ImageQuant软件上网格化的图像通过目视检查实现。取决于一式两份点的强度，命中分为‘强、中等、弱或非常弱’。为了确认命中，将所有编码在初步筛选中鉴别的命中的载体排列在新载片上。除了还用恰当的阴性对照探测相同载片之外，像初步筛选每样品η=2个复制载片）一样进行确认特异性筛选和分析。另外，对所有编码命中的载体进行测序。编码每一个初步命中的载体经过测序确认其同一性。[0689]背景筛选显示在2、5和20ygml下与未转染的ΗΕΚ293细胞的结合可忽略（图13。基于背景数据，选择20ygml用于完全图谱分析。初步筛选产生多个一式两份命中（克隆），大部分的强度是弱的或非常弱。将所鉴别的所有初步命中和对照EGFR-ZsGreenl载体一式两份地点样和重新表达，并且用20ygmlPVRIG探测以进行确认特异性筛选。[0690]鉴别到强度很强的单一特异性命中PVRL2图14。另一个弱命中MAG稍后显示也结合所测试的其它融合蛋白（数据未示出），由此说明它不是特异性的。这些结果与G·Quinones最近在《新技术和新领域（NewTechnologiesFrontIers》中公开的摘要https:www.yumpu.comendocumentview7263720sunday-december-4_late-abstracts-1-molecular-biology-〇f-the-l33一致。已知PVRL2是用作TIGIT和DNAMl的配体，TIGIT和DNAMl是T细胞和NK细胞活化的调节因子。最近报导TIGIT在针对肿瘤细胞的免疫反应的抑制中起关键作用NoaStanietsky，《免疫学杂志journalofimmunology》，第106卷第42期，17858-17863;RobertJJohnston，《癌细胞（Cancercell》，第26卷，第6期，第923-937页，2014年12月8日）。实例5中呈现的结果显示PVRIG与和TIGIT相同的对应物的相互作用，表明PVRIG参与了调节癌症免疫监视的重要调节通路并且因此确定了PVRIG作为潜在的癌症治疗靶标。[0691]额外验证研究2[0692]材料和方法[0693]材料[0694]Fc融合蛋白、His标记的蛋白质和对照Ig:使用Fc融合蛋白PVRIG-FcM:M进行结合研究。使用小鼠IgG2a作为同种型对照。研究中所用的其它商业小鼠蛋白质是PVRL2-hisRD，3869-N2和PVRL2-his北京义翘神州生物科技有限公司（SinoBiological，50318-M08H。[0695]细胞:产生HEK293过表达OX小鼠PVRIG和PVRIG-FLAG分别是RC-287和RC-286，并且比较PVRL2与这些细胞和表达空载体EV的HEK293细胞RC-83的结合。产生HEK293OX小鼠PVRL2剪接变异体1和2svl和sv2分别是RC-334和RC-335，并且比较PVRIG与这些细胞和表达EV的HEK293细胞的结合。还使用了B16-F10细胞CL-161，内源性表达mPVRL2的小鼠皮肤黑素瘤细胞来研究PVRIG与PVRL2之间的相互作用。[0696]抗体:使用抗小鼠PVRL2-PEAbRD，FAB3869P，25ygml，1:100检测PVRL2。使用大鼠IgG2A-PERD，IC006P，25ygml，1:100作为同种型对照。使用抗小鼠PEJacksonImmunoresearch，115-115-206，0·5mgml，1:200和抗hisAb艾碧康（Abeam，ab72467，0·lmgml，1:300检测重组蛋白的结合。使用抗DYKDDDDKTag抗FLAGAbBioLegend，637302，0·5mgml，1:300检测HEK293OX小鼠PVRIG-FLAG上的PVRIG表达。关于PVRIG标记，根据制造商的方案使用AlexaFluor®647抗体标记试剂盒（分子探针公司（MolecularProbes，A-20186。关于PVRIG的生物素化，根据制造商的方案使用DSB-X™生物素蛋白质标记试剂盒（分子探针公司，D-20655。通过抗生蛋白链菌素-PESA-PEJacksonImmunoresearch，016-110-084,0·5mgml，1:300检测生物素标记的PVRIG。[0697]方法[0698]与过表达OX小鼠PVRL2的稳定HEK293细胞或与B16-F10细胞结合的小鼠PVRIG-Fc的FACS分析:将HEK293细胞OXPVRL2svl或sv2或B16-F10细胞按IO6个细胞毫升悬浮于PBS中。关于每Iml细胞，添加Ιμΐ的活力染色储备溶液BDHorizon可固定的活力染色450,目录号562247，BD生物科学）。将细胞在室温下避光孵育10分钟。然后将细胞用PBS洗涤两次，并且在室温下，在存在1:50人类TruStainFcXTMBioLegend422302的情况下，在卩八〇3缓冲液补充有2%?83和0.5111]\^0了4的？83中按3\106个细胞毫升悬浮15分钟以阻断Fcγ-受体。然后不经过洗涤就在96孔V形板Costar#3357中涂铺IXIO5个细胞孔。通过抗PVRL2抗体检查PVRL2的表达参见上文）。用各个批次参见上文检查PVRIG-Fc与细胞的结合，一般是按60μ8πι1或若干浓度。将细胞与抗体或PVRIG-Fc—起在室温下孵育40分钟，然后洗涤一次。在室温下经15分钟添加第二抗体抗小鼠PE，将细胞洗涤两次并且用于通过14八€8^皿扯@?403分析仪美天旎生物技术公司）分析，然后使用？1〇«-加10软件进行数据分析。[0699]与稳定HEK293细胞OX小鼠PVRIG结合的小鼠PVRL2-his的FACS分析：用抗FLAG抗体检查PVRIG水平。通过抗his抗体监测PVRL2-his结合。如上所述进行FACS分析。[0700]通过Biacore进行小鼠PVRIGPVRL2相互作用的生物物理学SPR分析：在巴伊兰大学Bar-IlanUniversity用BiacoreT100SPR生物分子相互作用分析仪分析小鼠PVRIG与PVRL2之间的相互作用。将蛋白质在pH4.0的乙酸盐缓冲液中稀释到IOOnM，并且使用标准的胺偶联化学共价偶联到CM5系列SBiacore芯片的独特流动池。用EDC-NHS活化表面，并且稍后通过注射IM乙醇胺（pH8.5阻断。操作缓冲液是IOmMHepespH7.3、150mMNaCU3mMEDTA和0.05%吐温-20HBS-EP+。最终固定水平是约1000RU。将用作分析物的蛋白质稀释到2500nM、500nM和100nM。在每次操作时，一根管仅含操作缓冲液作为参考。在每次操作之后，用4MMgCl2按20ylsec进行30秒再生步骤。[0701]结果[0702]小鼠PVRIG与HEK293细胞OXPVRL2svl的结合：为了验证小鼠PVRIG与小鼠PVRL2之间的相互作用，我们首先测试了PVRIG-Fc与过表达OXPVRL2的细胞的结合。使用特异性抗小鼠PVRL2抗体测定在HEK293OXPVRL2svl上的PVRL2表达水平。小鼠PVRL2表达比表达空载体的HEK293细胞高10倍数据未示出）。检查四批PVRIG-Fc与PVRL2OX细胞的结合。相比于空载体细胞，所有PVRIG-Fc批次都显示出6-11倍的与细胞OXPVRL2的结合数据未示出）。还使用生物素标记和荧光标记AlexaFluor647的PVRIG蛋白质检查了PVRIG-Fc与PVRL2OX细胞的结合。虽然生物素标记的蛋白质展现出与未标记的PVRIG-Fc相比略强的与PVRL2OX细胞的结合数据未示出），但是荧光标记的PVRIG却显示低得多的结合数据未示出）。这些结果显示，在HEK293细胞OCPVRL2的膜上检测PVLR2;通过抗小鼠IgG2A抗体检测小鼠PVRIG-Fc与PVLR2OX细胞的结合；通过抗生蛋白链菌素-PE检测生物素标记的小鼠PVRIG-Fc与PVLR2OX细胞的结合和AlexaFluor647标记的PVRIG-Fc与PVLR2OX细胞的结合。[0703]小鼠PVRL2与HEK293细胞OXPVRIG的结合：为了进一步验证小鼠PVRIG与小鼠PVRL2之间的相互作用，我们测试了PVRL2与含或不含FLAG标签的细胞OXPVRIG的结合。使用抗FLAG抗体确认小鼠PVRIG在含FLAG标签的HEK293细胞OXPVRIG上的膜表达数据未示出）。正如所料，使用抗FLAG抗体，不含FLAG标签的HEK293细胞OXPVRIG显示无表达。使用抗PVRIG上清液Aldeveron，这些细胞显示比含FLAG标签的细胞OXPVRIG低的PVRIG表达。可获得的商业小鼠PVRL2重组蛋白仅作为His标记的蛋白质。因此，需要广泛校正来获得恰当的抗His抗体和检测条件。测试来自两个不同来源的His标记的PVRL2与60ygml的PVRIGOX细胞的结合并且相比于表达空载体的HEK293细胞，显示出2倍数据未示出）和3-4倍数据未示出）结合。也就是说，his标记的小鼠PVLR2结合HEK293OX小鼠PVRIG，并且小鼠PVRIG在HEK293细胞OXPVRIG的膜上表达。[0704]使用SPR-Biacore研究小鼠PVRIG和小鼠PVRL2的相互作用：为了评定小鼠PVRIG-Fc与小鼠His标记的PVRL2之间的相互作用，将两种蛋白质均固定到Biacore芯片。在固定之后，两种蛋白质以及PVRIG-Fc数据未示出）作为分析物按以下三个浓度操作：2500、500和IOOnMPVRIG批号480和PVRL2作为分析物操作两次）。在两个方向上并且用两批PVRIG检测两个蛋白质之间的相互作用数据未示出）。因为复杂的动力学，所以可能无法从Biacore结果确定准确的KD。[0705]小鼠PVRIG与HEK293细胞OXPVRL2sv2和B16-F10细胞的剂量反应结合:如上文所示，小鼠PVRL2与小鼠PVRIGOX细胞的结合相对较低。为了建立能够阻断小鼠PVRIG与小鼠PVRL2之间的相互作用的抗小鼠PVRIG抗体的筛选方法，选择PVRIG-Fc与PVRL2OX细胞的结合。首先，产生小鼠IgG2A和小鼠PVRIG-Fc与细胞OX小鼠PVRL2的剂量反应结合曲线，并且与表达空载体EV的细胞进行比较。在从50ygml到0.lygml的两倍连续稀释液（1:2中进行剂量反应。虽然未观察到小鼠IgG2A结合差异数据未示出），但是PVRIG-Fc显示在12.5ygml下结合饱和并且结合减少与蛋白质浓度降低相关数据未示出）。在PVRIG-Fc的情况下也获得了类似的结果数据未示出）。这些结果表明，可以考虑这个结合分析用于筛选阻断抗体。[0706]为了还考虑到用于筛选抗小鼠PVRIG抗体的内源性系统，使用抗PVRL2抗体评定PVRL2在B16-F10细胞上的表达。结果显示，PVRL2在B16-F10细胞上高度表达数据未示出）。因此，关于小鼠IgG2A和小鼠PVRIG-Fc与B16-F10细胞的结合，也产生了类似的剂量反应结合曲线。类似于用HEK293细胞OXPVRL2获得的结果，小鼠PVRIG-Fc显示与B16-F10细胞的剂量反应结合，在12.5ygml下达到饱和，但是未检测到小鼠IgG2A的结合变化数据未示出）。[0707]讨论和结论:在Retrogenix使用细胞微阵列技术鉴别人类PVRIG与人类PVRL2的相互作用。为了验证小鼠中也有这种相互作用，采取若干途径。这些途径包括使用PVRIG或PVRL2OX细胞，和使用SPR-Biacore进行生物物理学测量。所有途径都指示，小鼠PVRIG与小鼠PVRL2相互作用。然而，相比于PVRIG与细胞OXPVRL2的结合，小鼠PVRL2与细胞OXPVRIG的结合相对较低。其原因可能是以下事实：商业PVRL2仅可作为单体His标记的蛋白质而不是作为Fc融合的蛋白质（如用于PVRIG获得。为此目的，在金斯瑞产生定制的Fc融合的小鼠PVRL2。然而，根据初始数据，用这种蛋白质仅观察到微小的结合增加约5倍，相比于PVRL2-his的2-3倍）。因此，一些其它因素可能影响这相对较低的结合。[0708]因为PVRL2与细胞OXPVRIG的结合低，所以决定使用与细胞OXPVRL2结合的PVRIG-Fc建立抗PVRIG抗体阻断分析。根据所观察到的剂量反应曲线，我们建议三种工作浓度:0.1、0.2和0.4ygml。根据用PVRIG与内源性表达B16-F10细胞的PVRL2的结合获得的类似结果，我们建议还按以下浓度对这些细胞进行抗体阻断分析:〇.2、0.4、0.8ygml。[0709]PVRIG是假定受体，因此，抗体阻断分析优选应该采用PVRL2作为可溶性蛋白质并采用在细胞上表达的PVRIG进行。因此，应该考虑检查在当前形式下也在这个体系中展现阻断活性的抗小鼠PVRIG抗体。[0710]额外验证研究3[0711]本研究的目标是证实配偶体PVRIG的结合伴侣，一种新颖的免疫肿瘤学靶标。初步研究指示，这些配体之一是PVRL2。在本研究中，已通过ELISA研究了重组性PVRIG蛋白质与PVRIG轴中若干潜在配体的结合。[0712]方案[0713]试剂列表:关于PVRIG蛋白质的当前文献指出，存在三种潜在的配体:PVRCD155、PVRL2CD112和PVRL3CD113。为了研究其结合PVRIG受体的能力，如下从商业上获得这三种配体:PVR和PVRL3来自北京义翘神州生物科技有限公司，并且PVRL2来自安迪生物科技公司和北京义翘神州生物科技有限公司。在Compugen按PVRIG胞外结构域ECD融合人类IgGlFc结构域PVRIGHH产生人类PVRIG重组蛋白。[0714]用于测定受体-配体相互作用的ELISA:将从商业上获得的His标记的配体PVR、PVRL2和PVRL3涂布在高结合EIARIA板Costar9018的孔中，在4°C下过夜。包括不相关的His标记的蛋白质作为阴性对照。将涂布后的板孔用PBS冲洗两次并且与300yL阻断缓冲液5%脱脂奶粉，于PBS中，pH7.4—起在室温RT下孵育1小时。去除阻断缓冲液并且再用PBS冲洗培养板两次。将板结合的配体与不同浓度的PVRIGHH溶液线性范围是0.lygmL到4ygmL，体积是50yL孔一起在室温下孵育1小时。将培养板用I3BS-TPBS7.4，0.05%吐温20洗涤三次，接着用PBS洗涤三次，并且添加50yL孔的HRP结合的第二抗体人类IgGFc结构域特异性，JacksonImmunoResearch。将此在室温下孵育1小时并再次洗涤培养板。通过添加50yL的SureblueTMB底物KPL公司）并且孵育5-20分钟，在所有孔中产生ELISA信号。通过添加50yL2NH2SO4VWR停止HRP反应并且在SpectraMax分子仪器公司（MolecularDevices或EnVision¾金埃尔默PerkinElmer分光光度计上读取450nm下的吸光度信号。将数据导出到Excel微软Microsoft中并在GraphPadPrismGraphPad软件公司）中绘成图。[0715]结果:PVRIG优选结合到PVRL2:分析人类PVRIGFc-融合蛋白与固定在EIARIA板上的PVR、PVRL2和PVRL3的结合。将溶液相中不同浓度的受体PVRIG与固定的配体一起孵育。数据清楚地示出了PVRIGHH与PVRL2的剂量依赖性结合，但不与配体PVR、PVRL3或阴性对照蛋白质结合数据未示出）。使用一个位点结合方程，绘制ELISAA450信号随受体浓度而变的图，显示平衡结合常数KD是13±InM。[0716]总结和结论:PVRIG是生物学尚未充分了解的新颖的免疫肿瘤学靶标。在致力于弄清此生物学的过程中，我们检查了其与若干潜在配体的结合。清楚地鉴别到PVRL2为PVRIG的结合伴侣。定量分析表明这种相互作用非常强，KD是13±lnM。我们的结果还表明，人类PVRIG不结合人类PVR和PVRL3，或所述结合太弱以致于ELISA检测不到。[0717]额外验证研究4:[0718]在本实例中，评估了在同种异体活化前后在PBMC细胞亚组上的PVRIG表达。在同种异体活化之后，PVRIG在⑶4+T细胞上以及在⑶8+T细胞和双阴性γδΤ细胞上的表达上调。在所测试的两个供体中的一个的PBMC中观察到了这种上调参见图52。[0719]实例6与PVRIG、DNAM和TIGIT结合的PVR、PVRL2和PVRL3的表面等离子共振研究[0720]材料和方法[0721]所有实验全都使用ProteOnXPR36仪器在22°C下进行。[0722]步骤1:使用ProteOnXPR36生物传感器，在GLC芯片的所有六个泳道上制备高密度山羊抗人类fc多克隆抗体表面（英杰H10500。抗人类fc表面的活化步骤发生在水平流向，而高密度PAb的固定步骤发生在竖直流向。阻断步骤发生在竖直位置和水平位置，以使得水平“中间点”可以用作参考表面。平均约4400RU的山羊抗人类pAb被固定在每个泳道上。[0723]步骤2:关于每个循环，在2ygmL的浓度下，在不同的竖直泳道上各自捕获三个不同批次的人类PVRIG融合蛋白（人类fc，金斯瑞批次451、448、125、人类DNAM-I融合蛋白（人类fc，安迪生物科技公司）、人类TIGIT融合蛋白（人类fc，安迪生物科技公司）以及对照人类IgG西那吉斯），持续两分钟。在不同的配体捕获循环下，将PVR、两个批次的PVRL2以及PVRL3按六种不同浓度各自注射到水平流向中的所有六个被捕获的配体上。注射两分钟，然后在50yLmin的流动速率下解离10分钟。PVR浓度范围是1.4nM到332nM，呈3倍稀释系列，两个批次的PVRL2以1.3nM到322nM的浓度范围按3倍稀释系列注射，并且PVRL3以1.4nM到334nM的浓度范围按3倍稀释系列注射。所有蛋白质试剂都是在操作缓冲液中制备的，操作缓冲液是经过脱气的I3BS缓冲液，添加了0.05%吐温20和0.01%BSA。抗人类fc捕获表面在每个循环之后用两个30秒脉冲的146mM磷酸再生。[0724]步骤3:利用孔间参考interspotreferencing和与分析物注射液相同的预空白注射液，使用3.1.0.6版ProteOnManager处理并双参考double-reference与每个被捕获配体结合的分析物的传感图数据。[0725]结果[0726]aPVR:与被捕获的DNAM-I和TIGIT弱结合并且未显示与所有三个批次的PVRIG和对照IgG的结合。还未得到足够的信息来评估PVR与DNAM-I和TIGIT相互作用的Kd数据未示出）。[0727]bPVRL2:两个批次的PVRL2均显示与所有三个批次的PVRIG和与DNAM-I的结合，但与TIGIT结合极少或没有并且不与对照IgG结合。传感图显示了复杂的动力学，因而无法估算结合常数数据未示出）。[0728]cPVRL3:显示了与TIGIT的极少结合并且不结合其它蛋白质数据未示出）。[0729]实例7:PVRIGE⑶-IG对小鼠T细胞的体外免疫调节活性[0730]在这些实验中，研究了重组性融合的蛋白质PVRIG-ECD-Ig对小鼠T细胞活化的免疫调节活性。使用许多体外T细胞活化读出来研究PVRIG-ECD-Ig对小鼠CD4T细胞的活化的影响:细胞活化标志物、细胞因子分泌和增殖。[0731]为了评估pvrig蛋白质活化t细胞的活性，产生重组蛋白，它包含小鼠pvrig的小鼠胞外结构域6〇1与小鼠18823的;^融合命名为口¥1^8-6〇118111:1118691111〇:29。研究了与抗CD3共固定的fc融合蛋白对小鼠cd4t细胞功能的影响，如由活化标志物和细胞因子分泌所体现。[0732]材料和方法[0733]Fc融合蛋白和对照Ig:测试Fc融合蛋白PVRIG-ECD-Ig批次#198。使用小鼠IgG2a克隆M0PC-173;Biolegend或Cl·18.4;BioXcell作为同种型对照。[0734]小鼠CD4T细胞分离:使用T细胞分离试剂盒美天旎目录号130-093-227根据制造商的说明书，从BALBC小鼠的脾脏池中分离未接触的CD4+CD25-T细胞。所获得的纯度是90%〇[0735]小鼠⑶4T细胞的活化:将2ugml的抗小鼠⑶3-emAb克隆145-2C11;BD生物科学）连同各种浓度（1、3或10gml的PVRIG-E⑶-Ig蛋白质或对照Ig—起在37°C下在96孔平底组织培养板西格玛，目录号Z707910上共固定3小时。为了使每孔的总蛋白质浓度达到12ygml，向每个孔中添加对照Ig。将孔用PBS洗涤3次并且每孔涂铺IXIO5个经过纯化的CD4+⑶25-T细胞，并且留在5%⑶2，37°C下的加湿孵育箱中。在一些实验中，添加可溶性抗⑶28克隆：37.51;eBioscience;lygml。在刺激后的指定时间收集培养上清液并且通过ELISA试剂盒安迪生物科技公司）分析小鼠IFNγ或IL-2分泌。通过流式细胞仪分析PVRIG-Ero-Ig蛋白质（参见图103对活化标志物CD69在小鼠CD4+T细胞上的表达的影响。在刺激48小时后，在存在用于阻断Fcy-受体的抗CD1632克隆2.4g2;BD生物科学）的情况下，用抗体鸡尾酒给细胞染色，抗体鸡尾酒包括PerCP抗CD4克隆G41.5;Biolegend、FITC或PE抗CD69克隆Hl.2F3;Biolegend。使用MACSQuant分析仪9美天旎）评估细胞并且使用BDCelIQuest或通过MACSQuantifyTM软件分析数据。使用Excel或Prism4软件分析数据。[0736]结果和总结[0737]PVRIG-ECDIgM:N参见图103对小鼠CD4+T细胞功能的影响：图15显示了PVRIG-E⑶-Ig参见图103对分离后的小鼠脾脏T细胞CD4+，纯度95%的体外免疫调节活性，所述分离后的小鼠脾脏T细胞经过微量培养板刺激，仅与抗CD32ygml共固定或与对照IgmIgG2a或PVRIG-ECD-Ig参见图10310ygml在存在可溶性抗CD28lygml的情况下共固定。PVRIG-ECD-Ig参见图103按剂量依赖性方式抑制小鼠CD4T细胞活化，如由降低的CD69上调（图15A、D和TCR诱导的细胞因子（IL-2和IFNy分泌减少（图15B-C、E所体现。PVRIG-ECD-Ig渗见图103的抑制作用的量值在30%到100%的范围内。在低至3ygml的浓度下观察到了PVRIG-ECD-Ig参见图103对IFNγ分泌的抑制作用对比对照Ig约60%抑制）。[0738]当Fc融合蛋白与抗CD3共固定在培养板上时，PVRIG-ECD-Ig参见图103按浓度依赖性方式抑制T细胞活化。在10ygml的PVRIG-ECD-Ig下观察到最大抑制作用渗见图103。[0739]结果证明了PVRIG-ECD-Ig对小鼠T细胞活化的抑制作用，由减少的细胞因子分泌和活化标志物CD69上调被抑制所体现。T细胞活化的这种抑制支持根据本发明的免疫抑制性PVRIG蛋白质（PVRIG多肽和融合蛋白）在以下方面的治疗潜能：治疗T细胞驱动的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣和发炎性肠病；以及用于其它免疫相关疾病和或用于减少在基因疗法之后不合需要的免疫活化。另外，这些结果还支持免疫刺激性PVRIG蛋白质PVRIG多肽和融合蛋白）的以下治疗潜能：降低PVRIG的抑制活性以治疗可受益于增强的免疫反应，尤其是增强的CTL免疫和促炎性细胞因子的病况，如癌症、传染病，尤其是慢性感染，以及脓毒症，其中T细胞介导的病变细胞耗竭在治疗上是有利的。[0740]实例8:PVRIG对人类细胞毒性T细胞CTL的体外免疫调节活性[0741]本实例中所述的实验评估了人类PVRIG在不同黑素瘤细胞系上的异位表达对其活化CTL细胞毒性T淋巴细胞和充当被这些细胞杀死的靶标的能力的影响。[0742]材料和方法：[0743]使用在HLA-A2情况下呈递MART-I抗原的三个人类黑素瘤细胞系（SK-MEL-23、Mel-624和Mel-624.38作为CTL的靶标。不表达HLA-A2的Mel-888充当阴性对照。[0744]人类PVRIG在细胞毒性T淋巴细胞（CTL上的异位表达：为了表达外周血白细胞PBL培养物中的人类PVRIG，使用特异性引物扩增编码PVRIG的cDNA并将其克隆到基于MSCV的反转录病毒载体pMSGVl或三联载体（tripartitevector中：CD8依赖性F4TCR-和-链与P2A序列相连并被克隆到pMSGVl载体中，然后是内部核糖体进入位点（IRES和PVRIG。作为阴性对照的编码NGFRl的反转录病毒载体或三联载体:CD8依赖性F4TCR-和-链与P2A序列相连并被克隆到pMSGVl载体中，然后是内部核糖体进入位点（IRES和NGFR。首先使用限制酶消化并且然后通过测序来进行克隆验证。在序列确认后，产生大量反转录病毒载体Maxi-prep以供后续使用。[0745]用编码PVRIG的反转录病毒构建体或用编码NGFRl的反转录病毒载体或作为阴性对照的空载体转导健康人类供体的外周血白细胞。使用基于retronectin的方案进行转导；简单来说，在用反转录病毒载体和双嗜性包膜基因（VSV-G转染之后，在293GP细胞反转录病毒包装细胞系）中产生反转录病毒上清液。在转导之前，将反转录病毒上清液涂铺在涂有retronectin的培养板上以使得病毒粒子能够与板结合，并且向培养中添加PBL，持续6小时。在那之后，在新的培养容器中补充细胞。通过用商业PVRIG特异性兔多克隆抗体或用商业抗NGFR目录号345108;Bi〇Legend给经过转导的PBL染色来测定蛋白质的转导效率和表达。使用兔IgG西格玛，目录号15006作为同种型对照，并且至于第二抗体，我们使用APC结合的抗兔IgGJackson，目录号711-136-152〇[0746]F4T细胞受体在细胞毒性T淋巴细胞CTL上的异位表达:为了获得表达特异性识别MART-126-35-HLA-A2肽-MHC复合体的MART-I-特异性F4TCR的效应淋巴细胞，用PHA刺激预先经过PVRIG、NGFR或空载体转导以表达的新鲜分离的人类I3BL，并培养5到10天，并且随后用编码MART-I-特异性F4TCR的α链和β链的体外转录的mRNA转导。在淋巴细胞培养基生物靶向培养基，胎牛血清（10%、L谷氨酰胺青霉素链霉素（100个单位毫升）、IL-2300IU中培养经过转导的淋巴细胞，每2-3天补充培养基。通过FACS染色，使用识别所转导的特异性TCR的β链的胞外结构域的特异性单克隆抗体验证F4TCR表达水平。（TCR-Vbl2-PE，目录号頂2291;贝克曼库尔特公司（BeckmanCoulter。[0747]经过PVRIG、NGFR或空载体和F4-TCR转导的淋巴细胞在与黑素瘤细胞共培养后的细胞因子分泌:将与F4-TCR—起表达PVRIG或NGFR的PBL与未被操控的黑素瘤细胞共培养。将IO5个经过转导的I3BL与IO5个黑素瘤靶细胞共培养16小时。为了评定效应CD8T细胞对不同肿瘤细胞系的反应，通过ELISA测量培养上清液（IFNy目录号DY285E、IL-2目录号DY202E、TNF-a目录号DY210E，安迪生物科技公司）中的细胞因子分泌（IFNy、IL-2和TNF-a，所述培养上清液经过稀释以便在ELISA分析的线性范围内。[0748]细胞介导的细胞毒性分析:进行此分析是为了评定共培养后的靶细胞杀死。使用双顺反子载体使PVRIG和F4在PBL中表达并且与经过CFSE标记的黑素瘤靶细胞（用2mMCFSEeBioscience标记6分钟）按3:1的E:T比在37°C下共培养18小时。18小时后收集细胞并且并且添加ImM碘化丙啶（西格玛-阿尔德里奇（Sigma-Aldrich以分配细胞死亡比率。在CyAn-ADP流式细胞仪贝克曼库尔特公司）上走样。[0749]结果：[0750]实验系统的一般设计:在本文所述的实验系统中，PVRIG在人类PBL上过表达，接着操控人类PBL表达MARTI特异性和HLA-A2限制的F4TCR。然后将过表达细胞与HLA-A2阳性名称和HLA-A2阴性名称黑素瘤细胞系参考共培养。最近在临床试验中在病入膏肓的黑素瘤患者中使用F4TCR，通过使用编码TCR的反转录病毒，由来自外周血的自体淋巴细胞赋予特异性肿瘤识别Morgan等人，2006《科学》，314:126-129。通过细胞因子分泌评定通过与同源黑素瘤细胞共培养，PVRIG表达对CD8T细胞的抗原特异性活化的影响。[0751]PVRIG在人类PBL上的过表达-实验1:如材料和方法中所述，用编码PVRIG的反转录病毒载体或作为阴性对照的空载体转导人类PBL。在转导48小时后，通过流式细胞仪评定PVRIG的水平，并与用空载体转导的细胞进行比较。如图16中所示，转基因表达细胞的百分比是62.4%。[0752]PVRIG在人类PBL上的过表达-实验2:如材料和方法中所述，用编码PVRIG或NGFR的反转录病毒载体或作为阴性对照的空载体转导人类PBL。在转导48小时后，通过流式细胞仪评定PVRIG的水平，并与用空载体转导的细胞进行比较。PVRIG表达细胞的百分比在20%的范围内。如图17中所示，NGFR的表达是63%。另外几个在I3BL上过表达PVRIG的尝试未成功。一种可能性是，难以在原代PBL中表达PVRIG是出于这些细胞中的基础内源性表达水平。[0753]F4TCR在人类PBL上的过表达:为了对人类CTL进行功能分析，如材料和方法中所述，我们使用经过工程改造以表达识别HLA-A2+MART1+黑素瘤细胞的F4TCR的TOL。图18A显示在实验1中所用的白细胞的TCR转导之后获得的F4TCR表达水平，图18B显示在实验2中所用的白细胞的TCR转导之后获得的F4TCR表达水平。[0754]PVRIG表达对IFNγ分泌的影响-实验1:将经过PVRIG或空载体和F4转导的PBL与黑素瘤细胞系共培养。在共培养16小时时测量IFNy分泌水平。如图19中所示，IFNγ分泌的抑制量值因为PVRIG过表达而大于90%。与充当阴性对照的HLA-A2阴性细胞系Mel-888共培养仅引起F4转导的淋巴细胞少量的活化依赖性IFNγ分泌。不表达F4TCR的PBL命名为W0充当额外阴性对照。[0755]PVRIG表达对IFNγ分泌的影响-实验2:采用共转导图20Α或使用双顺反子载体图20Β将PVRIG、NGFR或空载体和F4转导到PBL中。将经过转导的PBL与黑素瘤细胞系共培养。在共培养16小时时测量IFNy分泌水平。如图20A中所示，细胞因子分泌的抑制量值因为PVRIG过表达而在30%的范围内。与充当阴性对照的HLA-A2阴性细胞系Mel-888共培养仅引起F4转导的淋巴细胞少量的活化依赖性IFNγ分泌。不表达F4TCR的I3BL命名为W0充当额外阴性对照。如图20Β中所示，当PVRIG与F4TCR共转导时，未观察到IFNγ抑制。[0756]PVRIG对CTL介导的杀死活性的影响-实验2:使用双顺反子载体用PVRIG或NGFR和F4转导PBL并且与CFSE标记的黑素瘤细胞系共培养。如图21中所示，碘化丙啶阳性事件的百分比（反映杀死活性的强度）因为PVRIG的表达而相对于阴性对照NGFR转导的细胞降低了约50%WVRIG表达细胞的杀死活性类似于在黑素瘤与不表达F4TCR的I3BL命名为W0之间共培养的杀死活性。[0757]总结:不希望受单一假设的限制，本文中呈现的结果指示，在原代淋巴细胞上的过表达导致CTL的细胞因子分泌减少，表明PVRIG对CTL具有抑制作用。[0758]实例9:人类抗PVRIG抗体[0759]本研究的目标是为了分离以高亲和力和特异性结合PVRIG免疫肿瘤学靶标并且阻断PVRIG与其结合伴侣PVRL2的相互作用的人类抗体。这通过以下来实现:淘选针对包含人类PVRIG胞外结构域ECD融合人类IgGlFc区的重组蛋白的人类fab片段噬菌体展示库，并且针对所得抗体阻断PVRIG与PVRL2的相互作用的能力对其进行筛选。[0760]方案[0761]试剂的功能性QC:通过微流控毛细管电泳，使用LabChip系统珀金埃尔默测定淘选试剂PVRIGE⑶融合人类IgGlFc结构域PVRIGHH的纯度。通过淘选试剂结合其配体PVRL2的能力验证其活性。[0762]用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的ELISA:将His标记的PVRL2重组蛋白在磷酸盐缓冲盐水PBS中稀释到2ygmL并且在高结合EIARIA板Costar的孔上涂布50yL等分试样，在4tC下过夜。将涂布后的板孔用PBS冲洗两次并且与300yL阻断缓冲液5%脱脂奶粉，于I3BS中，pH7.4—起在室温RT下孵育1小时。去除阻断缓冲液并且再用PBS冲洗培养板两次。将板结合的PVRL2与不同浓度的PVRIGHH溶液线性范围是0.lygmL到4ygmL，体积是50μ!7孔一起在室温下孵育1小时。将培养板用I3BS-TPBS7.4，0.05%吐温20洗涤三次，然后用PBS洗涤三次，并且添加50μ!7孔的HRP结合的第二抗体人类IgGFc结构域特异性）。将此在室温下孵育1小时并再次洗涤培养板。通过添加50yL的SureblueTMB底物KPL公司）并且孵育5-20分钟，在所有孔中产生ELISA信号。通过添加50yL2NH2S〇4VWR停止HRP反应并且在SpectraMax分子仪器公司）或EnVision¾金埃尔默分光光度计上读取450nm下的吸光度信号。[0763]制备生物素标记的PVRIG:*了推动用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠在溶液中进行噬菌体淘选，使用Lightning-Link®生物素试剂盒（InnovaBiosciences用生物素标记PVRIGHH和不相关的人类IgGlFc同种型对照。根据制造商的方案进行生物素化反应并且将生物素标记的试剂储存在4°C下用于进一步QC和生物淘选。如部分2.1中所述，通过LabChip和功能性ELISA评定生物素标记的蛋白质的纯度和活性。另外，通过ELISA使用两种途径评定生物素化程度：1将生物素标记的试剂吸附到高结合EIARIA板上并使用HRP结合的抗生蛋白链菌素检测蛋白质，和2在预涂有抗生蛋白链菌素的EIARIA板上孵育生物素标记的蛋白质并使用HRP结合的人类IgGFc结构域特异性第二抗体检测结合。[0764]人类抗体库的噬菌体淘选:使用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠捕获生物素标记的抗原，在溶液中进行淘选反应。应注意，所有的洗涤和洗脱步骤都使用用于捕获珠粒的磁力架普洛麦格Promega进行。所有孵育步骤都是在室温下在管旋转器BioExpress上温和混合下进行。进行四个淘选亚周期（sub-campaign，各自采用抗原浓度、洗涤和Fc结合剂耗竭步骤的不同组合表1。[0765]所有淘选亚周期都使用生物素标记的PVRIGHH抗原进行。关于每一轮淘选，在两个连续步骤中针对IOOpmol的不相关的人类IgGlFc蛋白质耗竭噬菌体库。在耗竭之后，亚周期A和B的每一轮涉及分别在低严格性和高严格性洗涤条件下针对50nM抗原的淘选。除了在周期C中，在第2轮和第3轮淘选中用10倍过量的不相关的IgGlFc蛋白质阻断库之外，亚周期C和D与亚周期B相同。亚周期D的不同之处在于，在第3轮中使用5nM抗原。[0766]表1:针对PVRIGHH的噬菌体淘选所用的抗原和洗涤条件.[0768]2.4.制备用于淘选的噬菌体库:所有的噬菌体淘选实验都使用X0MA031人类fab抗体菌体展示库加利福尼亚州伯克利的XOMA公司XOMACorporation，Berkeley，CA。通过与10%脱脂奶粉在PBS中1:1混合最终脱脂奶浓度5%阻断足够用于50倍过表达库的噬菌体并孵育1小时。[0769]2.4.1.抗原与抗生蛋白链菌素珠粒的偶联:关于每个亚周期，通过悬浮在ImL阻断缓冲液5%脱脂奶粉，于PBS中）中来阻断涂有戴诺抗生蛋白链菌素的磁珠生命技术公司）的三个IOOyL等分试样并且孵育30分钟。将一个阻断后的珠粒等分试样与IOOpmol的生物素标记的PVRIGHH混合。其它两个等分试样与IOOpmol的不相关的抗原混合以使仅Fc结合剂耗竭。使生物素标记的抗原与珠粒在室温下偶联30分钟。珠粒悬浮液用PBS洗涤两次以去除游离抗原并再悬浮于IOOyL阻断缓冲液中。[0770]2.4.2.来自噬菌体库的人类IgGlFc和抗生蛋白链菌素珠粒结合剂的耗竭:必需在可以开始噬菌体淘选之前去除对抗生蛋白链菌素珠粒和PVRIGHH的Fe区来说不合需要的结合剂。为了实现这个，将阻断后的噬菌体与解偶联的抗生蛋白链菌素珠粒的一个IOOyL等分试样混合并且孵育45分钟。丢弃珠粒（以及可能不合需要的珠粒和人类IgGlFc结合剂）。将这个步骤重复一次并且保留耗竭的噬菌体库上清液用于淘选。[0771]2.5.噬菌体淘选第1轮:将经过阻断和耗竭的噬菌体库与生物素标记的与以上所述的磁珠偶联的PVRIGHH混合。将此悬浮液在室温下在温和旋转下孵育1小时，以允许PVRIGHH特异性噬菌体的结合。根据表1中的方案，通过洗涤去除非特异性结合剂。在洗涤之后，通过与500uL的IOOmM三乙胺（TEAEMD—起在室温下孵育15分钟洗脱所结合的噬菌体。通过添加500yL的IMTris-HClpH8.0Teknova中和洗脱液。[0772]2.5.1.测定噬菌体滴度:将IOyL的初始噬菌体库输入滴度或淘选洗脱液输出滴度）在PBS中连续稀释（10倍）。将每个噬菌体稀释液的90yL等分试样与500yL生长到在600nm下的光密度0D600nm约0.5的TGl大肠杆菌细胞混合。通过静置孵育30分钟，然后振荡孵育（250rpm30分钟以使噬菌体感染细胞，全在37°C下。将每个被感染的细胞培养物的1^1^等分试样点样在补充有2%葡萄糖和10^811^羧苄青霉素（^461^^11丨112¥1^6，Teknova的2YT琼脂板上。将培养板在30°C下孵育过夜。对从每个IOyL点生长的群体进行计数并用于计算输入和输出滴度。[0773]2·5·2·噬菌体营救Phagerescue:将剩余的噬菌体洗脱液约ImL与IOmL生长至IjOD600nm为0.5的TGl大肠杆菌细胞混合。如部分2.5.1中所详述，将噬菌体感染到细胞中。通过在2500XG下离心使被感染细胞球粒化，将其再悬浮于750yL2YT培养基Teknova中并且展涂在2YTCG琼脂板上。将这些细胞在37°C下孵育过夜并且刮下所得大肠杆菌菌苔，将其再悬浮于约20mL液体2YTCGTeknova中。为了实现0.05的OD600nm，将再悬浮细胞的小份等分试样接种到50mL2YTCG中，并且然后在37°C下在250rpm振荡下生长，直到OD达到0.5为止。所得培养物用Ml3K07辅助噬菌体新英格兰生物实验室NewEnglandBiolabs感染并且在25°C下在振荡下孵育过夜以实现噬菌体包装。通过在2500XG下离心对含有所营救的噬菌体颗粒的培养物上清液进行清洁，并且取ImL用于a后一轮淘选或bfab结合筛选。[0774]噬菌体淘选第2-3轮:除了使用前一轮所营救的噬菌体上清液代替噬菌体库之外，根据以上步骤进行第二轮和第三轮淘选。所用的洗涤条件、耗竭和抗原浓度列于表1中。[0775]2.6.使用由周质提取物制备的fab进行结合筛选[0776]2.6.I.Fab表达载体：X0MA031库是基于也起fab表达载体作用的噬菌粒phagemid构建体。这些载体含有fab重链和轻链表达盒、用于驱动抗体基因的表达的Iac启动子以及耐氨苄青霉素ampicillin基因。抗体链附接有N端信号肽以驱动其分泌到周质空间中。重链的C端携带截短基因III蛋白质序列以便并入到噬菌体颗粒中。重链还携带六组氨酸、c-myc和V5亲和标签。这些载体到大肠杆菌中的转化和异丙基B-D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷IPTG诱导引起可溶性fab分子的周质表达。[0777]2.6.2.FabPPE产生：从第3轮淘选洗脱下来的噬菌体池经过稀释并被感染到TGl大肠杆菌细胞Lucigen中，以使得当展涂在2YTCG琼脂板上时产生单一群体。这使得每个群体携带单一fab克隆。使用Qpix2仪器分子仪器公司将个别克隆接种到96孔深孔阻断液VWR中的ImL2YTCG起子培养物（starterculture中。使这些起子培养物在Multitron3mm孵育箱伊孚森Infors中在37°C与700rpm振荡下生长过夜。关于fab表达，将ImL起子培养物中的20yL转移到第二组含有ImL2YT与0.1%葡萄糖和10^81^氨苄青霉素的深孔板中。使培养物生长，直到平均OD600nm为0.5-1.0为止，并且通过添加IPTGTeknova到最终浓度ImM来诱导蛋白质表达。使表达培养物在Mu11itron仪器中在25°C与700rpm振荡下孵育过夜。[0778]提取分泌到大肠杆菌周质中的Fab蛋白质进行分析。通过在2500XG下离心收集细胞，丢弃上清液并且将球粒再悬浮于75yL冰冷的PI3B缓冲液Teknova中。将提取物在4°C与IOOOrpm振荡下孵育10分钟，并且添加225yL冰冷的ddH20并再孵育1小时。所得周质提取物PPE通过在2500XG下离心进行清洁并且转移到另一个培养板或管子中用于ELISA和FACS分析。所有提取缓冲液都含有不含ΗΤΑ的Complete蛋白酶抑制剂罗氏Otoche。[0779]每板样品还包括一式两份的“空白PPE”孔来充当阴性对照。这些阴性对照通过以下产生:故意留下两个ImL培养物未接种，并且然后按与fabPPE相同的方式对其进行处理，从而产生无细菌生长并且因此无fab表达的样品。[0780]2.6.3.通过ELISA初步筛选:通过ELISA测试每个亚周期两个96孔板的PPE提取物与PVRIGHH的结合。应注意，ELISA筛选中使用非生物素标记版本的蛋白质来避免选择生物素或抗生蛋白链菌素结合剂。将PVRIGHH重组蛋白在磷酸盐缓冲盐水PBS中稀释到2ygmL并将50yL等分试样涂布在高结合EIARIA板Costar的孔上，在4°C下过夜。将涂布后的板孔用PBS冲洗两次并且与300yL阻断缓冲液（5%脱脂奶粉，于PBS中，pH7.4—起在室温RT下孵育1小时。去除阻断缓冲液并且再用PBS冲洗培养板两次。将板结合的PVRIG与用3%脱脂奶预阻断的PPE—起在室温下孵育1小时。将培养板用I3BS-TPBS7.4，0.05%吐温20洗涤三次，然后用PBS洗涤三次，并且按在5%牛奶中在I3BS中1:2000稀释添加50yL孔的HRP结合的抗人类Fab第二抗体JacksonImmunoResearch。将此在室温下孵育1小时并再次洗涤培养板。通过添加50yL的SureblueTMB底物KPL公司）并且孵育5-20分钟，在所有孔中产生ELISA信号。通过添加50yL2NH2S〇4VWR停止HRP反应并且在SpectraMax分子仪器公司）或EnVision珀金埃尔默分光光度计上读取450nm下的吸光度信号。显示信号：背景空白PPE比3的孔被选为阳性命中。[0781]2.6.4.ELISA阳性fab的序列分析:从ELISA筛选中选出阳性命中并将其重新排列到新的96孔板中。使克隆在37°C下生长过夜并且使用重链和轻链特异性引物给质粒DNA测序。使用XabtrackerXOMA软件组装并分析序列。如果重链⑶R3中存在超过一种非保守差异，那么认为克隆是序列单一的。重链相同或类似但是轻链显著不同的克隆被称为初始克隆的同胞sibling。[0782]2.6.5.FACS筛选fab作为PPE:选择序列单一ELISA阳性fab克隆并且通过荧光激活细胞分选FACS分析其结合PVRIG过表达细胞的能力。使用过表达人类PVRIG抗原的HEK293细胞进行分析。在平行实验中，使用未转染的HEK293细胞作为每个fab样品的阴性对照。[0783]如上所述产生用于序列单一ELISA阳性fab克隆的PPE。所有分析都使用FACS缓冲液PBS中的1%BSA和0.1%叠氮化钠进行。收集人类PVRIG和未转染的HEK293细胞，洗涤两次，并以2XIO6个细胞毫升的密度再悬浮。将25μ1细胞等分试样与25μ1的每个PPE样品混合并且在4°C与温和振荡下孵育1小时。分析中还包括两个空白PPE对照。将培养板在200μ1的FACS缓冲液中洗涤一次并且向每个孔中添加50yL的2ygmL小鼠抗C-myc抗体稀释液罗氏）。在4°C下孵育30分钟后，再次洗涤细胞并且向每个PPE和阴性对照孔中添加25μ1的5ygmL山羊抗小鼠fab_AF647稀释液JacksonImmunoresearch。所有第二抗体都在4°C下孵育30分钟。洗涤两次之后，将细胞再悬浮于最终体积50μ1的固定缓冲液FACS缓冲液中的2%多聚甲醛）中。在IntellicytHTFC筛选系统上读取样品，在指定的活门中每孔记录约5000个事件。使用Flowjo美国加利福尼亚州CA，USA的DeNovo软件公司）分析数据并将数据导出到Excel中。使用Xabtracker软件XOMA计算人类PVRIG过表达HEK细胞和未转染的293细胞的平均荧光强度MFI的比率。每个板上的阳性命中被鉴定为是MFI比率比平均空白PPE对照信号大5倍的那些。[0784]fab命中的重新格式化并且作为人类IgG分子产生:将潜在的PVRIG结合fab转换为全长人类IgG用于进一步表征。通过可变重链、λ和κ结构域基因的PCR扩增衍生出蛋白质表达构建体，所述基因分别被亚克隆到pFUSE-CHIg-hGl人类IgGl重链）、pFUSE2-CLIg-hK人类κ轻链或pFUSE2-CLIg-hL2人类λ2轻链载体中（所有表达载体都来源于Invivogen。[0785]将Expi293细胞（生命技术公司）以6XIO5个细胞毫升接种在Expi293培养基（生命技术公司）中并且在37°C下在8^^02的加湿气氛中在125rpm振荡下孵育72小时。此细胞储备液用于将表达培养物以2.OXIO6个细胞毫升接种在Expi293培养基中。将这些培养物与上文一样在135rpm振荡下孵育24小时。[0786]关于转染，再次将细胞在Expi293培养基中稀释到2.5XIO6个细胞毫升。将用于抗体重链和轻链的蛋白质表达构建体以1:2的比率混合。关于每30mL的表达培养物体积，将30yg的DNA和81yL的Expifectamine生命技术公司）各自用Opti-MEM生命技术公司）单独稀释到1.5mL并且孵育五分钟。然后将经过稀释的DNA和Expifectamine混合并且在室温下孵育20分钟。然后将此添加到振荡器烧瓶中的表达培养物中并且如上所述在125rpm振荡下孵育。[0787]在转染后约20小时，向每个烧瓶中添加150yL的ExpiFectamine293转染增强剂1和1.5mL的ExpiFectamine293转染增强剂2。培养物再孵育五天转染后共计六天并通过离心收集上清液。使用AKTA纯FPLC通用电气医疗集团生物科学（GEHealthcareBio-Sciences和HiTrapMabSelectSure亲和柱通用电气医疗集团生物科学），根据制造商的说明书从上清液中纯化IgG。[0788]经过重新格式化的IgGl抗体的FACS筛选:除了对已纯化抗体进行剂量依赖性滴定之外，类似于本文中所述的基于PPE的筛选对经过重新格式化的抗体进行FACS筛选。将人类PVRIG过表达HEK293细胞或未转染的HEK293细胞与不同浓度0-10ygml的抗PVRIG抗体或同种型对照一起在FACS缓冲液中在4°C下孵育60分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤一次，再悬浮于经过1:200稀释的50μ1的AlexaFluor647结合的抗人类IgGFab片段特异性）中，并且在4°C下在暗处孵育30分钟。将细胞洗涤两次并且再悬浮于经过1:1000稀释的最终体积80μ1的FACS缓冲液和碘化丙啶Biolegend目录号421301中。使用IntellicytHTFC筛选系统（Intellicyt分析样品。使用FlowJoDeNovo分析数据，将数据导出到Excel微软）中并在GraphPadPrism^GraphPad软件公司）中绘成图。[0789]结果[0790]PVRIGHH重组蛋白的功能性QC:通过微流控毛细管电泳，使用LabChip系统评定PVRIGHH蛋白质的纯度。在还原性条件下，重组蛋白迀移到SOkDa处，与其计算得到的分子量80.4kDa—致，并且显示99%的纯度数据未示出）在非还原性条件下，观察到一个额外的峰，它可能由因为Fc-Fc相互作用而存在二聚形式的蛋白质而产生。[0791]通过在ELISA中评估重组蛋白与PVRL2PVRIG的已知配体）的结合来评定重组蛋白的功能完整性。观察到PVRIGHH与PVRL2结合的剂量依赖性反应数据未示出）。相比之下，未观察到不相关的人类IgGlFe对照的结合。综合而言，这指示PVRIGHH重组蛋白具有高纯度和功能活性，并且因此适合生物淘选。[0792]生物素标记的PVRIGHH重组蛋白的QC:通过微流控毛细管电泳，使用LabChip系统评定生物素标记的PVRIGHH蛋白质的纯度。在非生物素标记的重组蛋白和生物素标记的重组蛋白之间未观察到显著差异数据未示出）。应注意，在生物素标记的蛋白质样品中观察到了额外的44.3kDa峰。这个峰可能由单体形式的PVRIGHH蛋白质产生或可能是生物素化试剂盒的骤冷反应的伪影。[0793]通过在涂有抗生蛋白链菌素的EIA板上孵育生物素标记的蛋白质并且使用HRP结合的抗人类IgGIFc第二抗体检测结合的蛋白质来确认成功生物素化。生物素标记的PVRIGHH与涂有抗生蛋白链菌素的EIA板的结合与商业上获得的不相关的生物素标记的蛋白质相当数据未示出）。[0794]噬菌体淘选:使用生物素标记的PVRIGHH蛋白质进行针对X0MA031人类fab抗体·菌体展示库加利福尼亚州伯克利的XOMA公司）的噬菌体淘选。在洗涤严格性、抗原浓度和Fe结合剂的耗竭的4种不同组合亚周期A到D下进行三轮生物淘选。使用噬菌体输出滴度评估每一轮的成功。使用定性准则来定义淘选亚周期的成功，如在第1轮之后噬菌体滴度显著减小;在第2轮和第3轮之后噬菌体滴度增加或维持不变；以及在提高洗涤严格性或降低抗原浓度之后噬菌体滴度减小。所有4个亚周期都使得噬菌体滴度在亚周期一贯的预期范围内（数据未示出）。[0795]筛选噬菌体输出作为fabPPE:针对四个亚周期中的每一个，筛选两个96孔板的fab克隆（作为PPE来评估生物淘选的成功。结果概括在表3中并且在下文中进一步详细讨论。总的来说，所有4个亚周期都产生数量显著的PVRIGHH特异性fab。鉴别到总共49个靶特异性单一fab。亚周期B和D显示最高的ELISA命中率和FACS相关性并且被选来用于延伸筛选。[0796]表3:fabPPE的中试筛选的总结。关于每个亚周期，列出了所筛选的克隆的总数、ELISA命中、FACS命中以及序列单一性。开放阅读框ORF表示成功测序为全长fab的克隆。特异性是基于在ELISA中缺乏与不相关蛋白质的非特异性结合。FACS相关性表示也是FACS阳性特异性结合到PVRIG过表达HEK293细胞的ELISA命中的百分比。[0797][0798]*与不相关Fe结合物或PVRL2无非特异性结合;#35个单一HC，14个同胞[0799]初级fab筛选ELISA:关于每个亚周期，通过ELISA，针对PVRIGHH重组蛋白筛选两个96孔板（182个fab克隆）的PPE。应注意，虽然使用生物素标记的蛋白质进行淘选，但使用非生物素标记的版本进行ELISA筛选，这避免了生物素或抗生蛋白链菌素特异性结合剂的检测。当‘阳性’信号的阈值设定在3倍的靶特异性结合:空白PPE对照信号比时，4个亚周期得到的ELISA命中率在24-37%的范围内。[0800]二级筛选DNA序列分析、ELISA和FACSfab:给ELISA阳性克隆测序来选择非冗余fab。鉴别到七十三个序列单一fab克隆。19个克隆是亚周期A所特有的，13个克隆是亚周期B所特有的，10个克隆是亚周期C所特有的，18个克隆是亚周期D所特有的，而剩余23个克隆在各周期之间共用。序列单一ELISA阳性fab克隆再表达为PPE并且通过FACS筛选用于特异性结合。73个单一克隆中总共49个被鉴定为是PVRIG特异性ELISA和FACS结合剂根据2.6.5中建立的准则）。49个FACS结合剂对应于35个具有单一重链的抗体和14个具有单一轻链但与单一克隆中的一个共用重链的同胞。FACS结合数据的汇总呈现在表4中。[0801]还测试了序列单一fab的非特异性结合。所分析的所有fabPPE都以比空白PPE对照大3倍的分析信号结合到PVRIGHH重组蛋白。在平行分析中，测试fabPPE与两个具有相同IgGlFe区的不相关蛋白质以及PVRL2重组蛋白的结合。所述克隆皆不显示与对照的显著非特异性结合，表明所选择的fab对PVRIG具有特异性。[0802]表4:PVRIGfab的FACS结合总结。通过FACS分析所有单一ELISA阳性fab。测量PVRIG过表达HEK293细胞以及未转染的HEK293细胞的平均荧光强度MFI。计算靶特异性结合对比脱靶结合的MFI比。选择MFI比5的克隆作为命中并列于下文中。[0805]ELISA和FACS阳性fab重新格式化为hlgGl:将所有单一ELISA和FACS结合剂重新格式化以在Expi293细胞中表达为人类IgGl分子。初始的49个抗体中的44个被成功表达为全长抗体。测试这些经过重新格式化的抗体所保留的与PVRIG过表达HEK293细胞以及不相关的人类IgGl同种型对照的结合。还针对未转染的HEK293细胞测试了所有抗体。所得结合结果用于证明抗体的特异性并且也用于绘图以计算平衡结合常数KD。剩余44个抗体中的九个显示弱结合或显著非特异性结合。剩余35个抗体被选用于在基于细胞的功能分析中进一步分析。这些抗体的基于FACS的KD列于表6中。KD值在0.30nM到96nM的范围内，中位值是9.4nM，表明从淘选周期获得的大多数抗体特异性都很大并以高亲和力结合PVRIG。[0806]表5:经过重新格式化的抗体的表达和结合总结。将所有单一ELISA和FACS阳性fab重新格式化到人类IgGl骨架中。通过针对PVRIG过表达HEK293细胞的剂量滴定测定FACSKD值。通过针对未转染的HEK293细胞的剂量滴定测定脱靶结合。[0809]使用重组性Fc标记的抗原版本进行噬菌体展示抗体发现周期以分离针对免疫肿瘤学靶PVRIG的结合剂。质量控制分析显示淘选抗原是纯的并具有功能活性。淘选工作产生49个特异性结合到作为重组蛋白和在细胞表面上的PVRIG靶的单一fab克隆。在这些克隆中，35个成功产生了人类IgGl抗体并且显示保留了与PVRIG的特异性结合。这个抗体池在FACS分析中展现高亲和力，35个抗体中的18个以KD5倍（80%阻断）的fab克隆作为阻断性fab。[0812]方案：[0813]给ELISA板Costar9018涂布50μ1的2ygml抗原并将其储存在4°C下过夜。涂有抗原的培养板用IXPBS洗涤3次。用PBS中200μ1的5%脱脂奶阻断培养板并在室温RT下孵育1小时。接着用IXPB洗涤培养板。[0814]在添加50微升孔的FabPPE在5%脱脂奶中稀释过之后，将培养板与添加到相应孔中的lygml的人类PVRIG-Fc—起预孵育。用2个孔进行“无fab”对照。[0815]将培养板在室温下孵育1小时。[0816]将培养板用IXPBST洗涤3次并用IXPBS洗涤3次。[0817]在添加了50微升孔的在5%牛奶中在PBS中稀释过的HRP结合的第二抗体JacksonImmunoResearch，709-035_098之后，将培养板在室温下孵育1小时。[0818]将培养板用IXPBST洗涤3次并用IXPBS洗涤3次。[0819]在添加50微升孔的TMB底物并且等到显色之后，通过添加50微升孔的2NH2S〇4停止反应。测量450nm下的吸光度。[0820]结果[0821]图52显示测试抗PVRIG抗体阻断至少80%的PVRL2与PVRIG结合的能力的结果。如所显示的，大多数这类抗体都能够成功阻断至少80%的结合。具体来说，成功阻断的抗体指出如下：[0822]CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、CPA.7.050。[0823]实例11:37个与人类PVRIG融合蛋白结合的抗PVRIGIgG抗体的表位分库的表面等离子共振研究[0824]材料和方法[0825]使用ProteOnXPR36仪器在22°C下进行实验，所有样品在实验期间都保持在4°C下。[0826]步骤1:将以下抗PVRIGmAb各自在IOmM乙酸钠pH5.0中稀释到约lOygmL并且使用标准胺偶联共价固定于ProteOnGLC生物传感器芯片上的独立点上。[0828]活化步骤发生在水平流向，持续五分钟；而固定步骤发生在竖直流向。在表面活化之后注射mAb，持续四分钟。阻断步骤发生在竖直位置和水平位置，各自五分钟，以使得水平“中间点”可以用作参考表面。将mAb固定在约450RU到5000RU的范围内。在此研究中还对额外的mAbCPA.7.041进行了分库，但是仅作为溶液中的分析物。参见下文。[0829]步骤2:初步实验涉及若干个以下循环:在所有固定的mAb上以25yLmin的流动速率注射约20nMPVRIG抗原PVRIGHH-2-1-1M48,金斯瑞），持续三分钟，接着取决于GLC芯片阵列中水平行的mAb，用pH2.0或pH2.5的IOmM甘氨酸盐酸盐的30秒脉冲再生。在含有100μgmLBSA的经过脱气的I3BSTPBS与0.05%吐温20操作缓冲液中制备抗原样品。这些初步实验显示克隆CPA.7.026和CPA.7.029不与抗原结合并且因而不分库。ProteOn阵列上的剩余mAb显示与抗原的可再现的结合。[0830]步骤3:因为fc融合PVRIG抗原是二价的，所以执行“预混合”的表位分库方案。在这个方案中，将步骤1中所列的每个mAb加上mAbCPA.7.041与PVRIG抗原预混合，并且然后注射到所有固定的mAb上，持续三分钟。每个mAb的摩尔结合位点浓度超过了摩尔抗原结合位点浓度。每个mAb的最终结合位点浓度是约400nM并且抗原的最终结合位点浓度是约20nM。在整个实验期间，在每八个mAb注射循环之后进行仅抗原的对照循环以监测所固定的mAb的活性。有关双参考，在大约每八个mAb注射循环之后还进行了缓冲液空白注射。额外的对照包括以与预混合注射循环相同的浓度单独注射在所有固定的mAb上的每个mAb。所有表面都用30秒脉冲的IOmMpH2.0或pH2.5的甘氨酸盐酸盐再生，pH取决于阵列中的哪一行mAb被再生，并且所有循环都以25yLmin的流动速率进行。mAb和抗原样品在含有100ygmLBSA的经过脱气的PBST操作缓冲液中制备。[0831]步骤4:使用3·1·0·6版ProteOnManager，使用中间点和缓冲液空白进行双参考来处理和参考传感图数据。仅mAb的对照注射液用作注射参考，其中观察到与仅mAb注射液的显著结合。如果混合的mAb和抗原注射到固定的mAb上时未观察到结合，或如果相比于仅抗原的对照在相同的固定的mAb上的注射来说结合显著减少，那么将抗体对归类为具有共用抗原结合表位在图43的矩阵中表示为红色的“0”）。如果混合的mAb和抗原的注射显示与固定的mAb的结合类似于或大于仅抗原的对照在相同的固定的mAb上的结合，那么将抗体对归类为与不同的抗原表位结合，或对抗原进行“夹心”（在图43的矩阵中表示为绿色的“1”）。[0832]步骤5:因为GLC芯片阵列只有36个点，所以仅研究mAbCPA.7.041#37作为分析物的阻断模式。因而关于一致性，使用11.0.0版JMP软件，在与抗原预混合的每个mAb的二元矩阵中进行结合模式的层次聚类（图42中的竖直模式）。还对固定的mAb的阻断模式（图42中的水平模式进行了聚类，与在溶液中预混合的mAb的阻断模式形成对比数据未示出，结果参见讨论）。[0833]结果：图42显示了每个mAb对之间的阻断“0”）或夹心（“1”）的二元矩阵，其中mAb竖直地表面“配体”上的mAb和水平地溶液“分析物”中的mAb按相同的顺序列出。图42中突出了所有mAb的与分析物相同的阻断模式“库”，每个具有相似的竖直模式的组用黑框围起来。图43显示42图中的矩阵中的竖直分析物阻断模式的树状图。根据表位“库”的最严格的定义，其中仅那些显示相同的阻断模式的mAb在技术上分库到一起，总共存在4个离散库。具体来说，进行分库的35个mAb中的33个包含两个库，其中这两个库之间的唯一区别是mAb是与CPA.7.039形成夹心（库2,参见图42和图43还是阻断（库1，参见图42和图43与CPA.7.039的结合。这意味着CPA.7.039在其自己单独的库中。第四个库仅由mAbCPA.7.050组成，所述mAb不能够阻断抗原与其它34种mAb中的任一种的结合。mAb作为配体的阻断模式的层次聚类（图42中的水平模式显示mAbCPA.7.016与mAbCPA.7.039对抗原形成夹心，而作为分析物，它阻断抗原与固定的CPA.7.039的结合。因此将克隆CPA.7.016放在库2中而不是库1中。每种结合中的mAb列于图43中。代表每个库的经过处理的传感图数据示出在图44到图47中。[0834]总结:使用SPR，根据mAb与fc融合人类PVRIG的成对阻断模式对35个抗PVRIGIgGmAb进行分库。根据表位库的最严格的定义，总共存在四个离散库。35个mAb中的33个包含两个库，两者的不同之处仅在于其相应组分mAb是阻断抗原与克隆CPA.7.039还是与克隆CPA.7.039—起对抗原进行夹心。[0835]实例12在周质提取物中制备的50种抗PVRIG人类FAB的表面等离子共振动力学筛选[0836]材料和方法[0837]所有实验全都使用Biacore3000仪器和ProteOnXPR36仪器在22°C下进行。[0838]步骤1:使用Biacore3000仪器，在22°C下对周质提取物上清液中的所有52种fab的摩尔浓度进行定量。将每个fab稀释20倍，并且然后以5yLmin注射到使用与CM5Biacore芯片（通用电气医疗集团）标准胺偶联制备的高密度抗人类fab通用电气医疗集团28-9583-25表面上，持续2分钟。然后在状况与fab上清液相同的抗fab表面上注射已知浓度的标准人类fabBethyIP80-115。在操作缓冲液中制备样品，所述操作缓冲液是添加了0.01%BSA的经过脱气的HBSP0.01MHEPES、0.15MNaCl、0.005%P20，pH7.4。使用CLAMP3.40软件拟合每个fab上清液的每个SPR传感图的结合斜率与已知浓度的标准人类fab的SPR结合斜率，从而估计上清液中每个fab的摩尔浓度。[0839]步骤2:使用标准胺偶联，在GLC芯片的两个泳道上，使用ProteOnXPR36生物传感器制备高密度山羊抗人类fc多克隆抗体表面英杰H10500。使用标准胺偶联，在相同GLC芯片的两个不同泳道上制备高密度抗小鼠fc多克隆抗体表面通用电气医疗集团BR-1008-38。所有四个捕获表面的活化和阻断步骤都发生在竖直流向。然后按三种浓度将上清液中的每个fab注射到fc融合人类PVRIGPVRIG-HH-2-l-l#448,金斯瑞）和fc融合小鼠PVRIGPVRIG-MM-2-l-l#198，金斯瑞上，它们分别以每循环平均约200RU和约290RU被分别）捕获到一个高密度抗人类fc表面和一个抗小鼠fc表面。每个fab浓度系列都是注射两分钟，然后在50yLmin的流动速率下解离10分钟。起始浓度范围（如在步骤1中所测定）是约20nM到约400nM，每个fab都有两个最高浓度的三倍稀释液。在操作缓冲液中稀释Fab，所述操作缓冲液是添加了0.05%吐温20和0.01%BSA的经过脱气的roS。在每个循环之后，用两个30秒脉冲的146mM磷酸再生抗人类fc捕获表面;并且在每个循环之后，用两个30秒脉冲的IOmM甘氨酸pH1.7再生抗小鼠fc表面。[0840]步骤3:使用3.1.0.6版ProteOnManager处理并双参考上清液中与被捕获的PVRIG结合的fab的传感图数据。使用不含被捕获的PVRIG的相应抗物种捕获表面作为参考表面并在被捕获的PVRIG上在与fab的注射相同的条件下进行空白注射，对传感图进行双参考。如果可能，就将每个fab的三个不同浓度的传感图与1:1动力学模型全局拟合含有关于质量传递的项），从而估计结合和解离速率常数。不显示1:1单一结合的传感图不与动力学模型拟合并且因此未被赋予kjPkd的估计值。[0841]结果[0842]本研究中所包括的fab中没有一个显示出与小鼠PVRIG的结合活性数据未示出）。针对人类PVRIG进行筛选的50个fab中的17个的传感图可能适合于可靠估计其速率常数。二十八个克隆显示复杂动力学，其中五个fab不显示与被捕获的人类PVRIG融合蛋白的任何结合扣?厶.7.025、〇?厶.7.026、〇?厶.7.027丄?厶.7.029丄?厶.7.035，并且一个克隆扣卩厶.7.035在进行步骤1中的浓度测定时显示无滴度。速率常数和其相应传感图下文显示于图49和图50中。下文所列的克隆显示复杂动力学。图51显示了这些数据的一些实例。[0845]实例13使用流式细胞仪测量IGG克隆CPA.7.021与在HEK细胞上表达的PVRIG的结合亲和力[0846]材料和方法[0847]使用流式细胞仪测量CPA.7.021IgG与在HEK293细胞上表达的人类PVRIG的结合亲和力。向96孔板的17个孔中恒定量的细胞（100,000个细胞孔）中一式两份地添加2倍连续稀释液中的与Alexa647结合的CPA.7.021，结合位点浓度范围是3pM-101nM。一个孔含有不添加任何IgG的细胞，充当空白孔。用IgG将细胞在4°C下平衡4小时。将细胞洗涤两次，并且然后使用IntelIicyte流式细胞仪根据约10，000个“事件”记录平均荧光强度MFI。下文显示了随CPA.7.021IgG结合位点浓度而变的所得MFI值。如Drake和Klakamp，《免疫学方法杂志（JournalofImmunolMethods》，3182007147-152中所详述，通过拟合MFI对比IgG结合位点浓度曲线与1:1平衡模型来估计CPA.7.021与表达人类PVRIG的HEK293细胞结合的KD。[0848]结果：用表达人类PVRIG的HEK293细胞滴定Alexa647标记的CPA.7.021IgG并使用流式细胞仪测量结合信号。所得结合等温线呈现于下文中，显示了一式两份的MFI与CPA.7.021的结合位点浓度。红线是曲线的1:1平衡拟合，得到2.5nM±0.5nM的KD估计值95%的拟合置信区间，N=I。[0849]实例14PVRIG敲低KD和抗PVRIG抗体对人类黑素瘤特异性TIL功能的影响[0850]这些分析的目的是评估PVRIG在人类衍生的TIL中的功能能力，如在与黑素瘤靶细胞共培养后通过活化标志物和细胞因子分泌所测量。使用HH作为敲低SiRNA研究的基准免疫检查点。评估抗PVRIG抗体CPA.7.21的作用，所述抗体显示可单独地或与其它抗体例如aTIGIT、DNAMl组合阻断PVRIG和PVRL2的相互作用。[0851]材料和方法[0852]TIL[0853]使用来自三个黑素瘤患者的肿瘤浸润性淋巴细胞TIL:[0854]OTILHS-HLA-AS-Martl特异性[0855]Otil-Fa-Hla-ASipIOO特异性[0856]OTlLiog-HLA-ASiplOO特异性[0857]在]01出1，01-058-1六完全培养基中解冻1'几，所述培养基补充有10%人类血清西格玛，H3667+1%Glutamax生命技术公司，35050-038+1%丙酮酸钠（BiologicalIndustries，03_042_1Β+1%非必需氨基酸（BiologicalIndustries，01-340-1B+1%青霉素-链霉素（BiologicalIndustries，03-〇31_lB+300Uml的rhIL2Biolegend，509129〇[0858]肿瘤细胞系:在MHC-I单倍型HLA-A2的情况下，人类黑素瘤细胞Mel_6M表达MART-1和gp-100抗原。在完全DMEM培养基BiologicalIndustries，01-055_1A中培养细胞，所述培养基补充有10%FBSBI，04-127-1A、25mMHEPES缓冲液（ΒΙ，03-025-1Β、1%GlutamaxLifetechnologies，35050-038和1%青霉素-链霉素（BiologicalIndustries，03_031_1Β〇[0859]TIL中的敲低：使用IOOpmol的DharmaconON-TARGETplus人类PVRIGsiRNA-SMART池（L-032703-02或人类PDlsiRNA-SMART池（L-004435或非靶向siRNAD-001810-01-05，进行TIL中的人类PVRIG和人类的敲低KD。将siRNA电穿孔到TIL中ΑΜΑΧΑ，程序X-005。对解冻24小时后在补充有IL-2的完全頂DM中培养的静息TIL进行电穿孔。在电穿孔之后，将HL接种到96孔TC板中，恢复24小时。24小时后，收集细胞并用活力染料BDHorizon;目录号562247，BD生物科学）染色，用PBS洗涤并用抗人类PVRIG-CPA.7.021CPA.7.021IgG2A647,7.5ygml或用抗人类PD-IBiolegend，#329910AF647,5ygml在室温下染色30分钟。所用的同种型对照分别是西那吉斯（IgG2A647，7.5μgm1和小鼠IgG1Biolegend#400130A647,5ygml。在MACSQuant分析仪美天旎上运行所有样品并且使用FlowJo软件vlO.0.8分析数据。[0860]TIL与624黑素瘤细胞的共培养:收集经过siRNA电穿孔的TIL并将其以5XioMV孔接种在96TC板中。再次收集Mel-624细胞并将其以1:11:3的E:T比接种在共培养物中。将培养板在37°C，5%C02下孵育过夜（18小时）。[0861]为了评定抗PVRIG抗体CPA.7.021、抗TIGIT克隆10A7和抗DNAMl克隆DXll对黑素瘤特异性TIL活性的影响，在以1:1的效靶比添加624黑素瘤靶细胞之前，将TILIXIO5个细胞孔与测试抗体或相关同种型对照一起在单处理（IOygAiL中或在组合处理各自最终10ygmL中预孵育。将培养板在37°C，5%C02下孵育过夜（18小时）。[0862]TIL活化的评定：共培养16小时后，将细胞用活力染料（BDHorizon;目录号562247,BD生物科学）染色，用I3BS洗涤并且暴露于Fc阻断溶液（目录号309804,Biolegend中，然后用抗CD8a目录号301048，Biolegend和抗CD137目录号309804，Biolegend在4°C下表面染色30分钟。在MACSQuant分析仪（美天旎）上运行所有样品并且使用Flowjo软件vlO.0.8分析数据。收集培养上清液并且通过CBA试剂盒（目录号560484，BD分析细胞因子分泌。[0863]结果[0864]TIL中的PVRIG敲低:将TILMART-1和TILF4与IL-2培养24小时。将IOOpmol的ON-TARGETplus人类PVRIGsiRNA-SMART池（L-032703-02或人类PDlsiRNA-SMART池（L-004435或非靶向siRNAD-001810-01-05电穿孔到TIL中（ΑΜΑΧΑ，程序X-005。电穿孔24小时后（并且在共培养之前）进行PVRIG或PD-I的检测。将细胞用活力染料染色，然后与抗PVRIG或抗Η-1—起室温孵育30分钟。KD群体的百分比指出在图82中。[0865]使用敲低的TIL进行功能分析：用编码人类PVRIG或PD-I的siRNA或作为对照的乱序序列对与IL2—起培养了24小时的人类TIL进行电穿孔。电穿孔24小时后测试TIL的PVRIG和PD-I表达。相比于经过乱序电穿孔的TIL，观察到约80%的PVRIG敲低和约50%的PD-I敲低图82。[0866]将KDTIL与Mel-624细胞以1:1或1:3的E:T—起培养18小时，并针对CD137的表达进行染色。在用PVRIGsiRNA电穿孔的TILMART-I中，类似于用Η-1siRNA电穿孔的TIL，相比于对照乱序siRNA来说，显示出活化标志物⑶137的水平升高（图83A。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。相比于对照SCRsiRNA，用PVRIGsiRNA电穿孔的TIL显示IFNy和TNF水平显著增加。在经过Η-1siRNA电穿孔的TIL中显示出了类似的作用（图83B-C〇[0867]在TILF4中观察到了相同的活化水平增加趋势。PVRIGsiRNA电穿孔的TILF4与Mel-624以1:3的E:T共培养导致⑶137表面表达水平增加（图84A以及共培养上清液中IFNγ的分泌增加（图84B。在经过Η-1siRNA电穿孔的TIL中观察到类似趋势。[0868]使用阻断性Ab进行功能分析：[0869]抗PVRIG和抗TIGIT的体外单一疗法和组合疗法:将209个TIL与Mel-624细胞以1:IE:T培养18小时。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。用抗TIGIT处理不影响IFNy或TNF分泌水平。然而，当以组合形式向共培养物中添加抗TIGIT和抗PVRIG时，观察到IFNγ和TNF水平增加（图85A-B。[0870]抗PVRIG和抗TIGIT的体外单一疗法和组合疗法:将209个TIL与Mel-624细胞以1:IE:T培养18小时。针对活化标志物⑶137的表面表达对TIL进行染色，并且在用抗DNAM-I处理后显示表达水平降低。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。抗DNAM-1处理介导了增加所分泌的细胞因子IFNy和TNF的趋势。用抗DNAM-I和抗PVRIG组合处理部分地逆转了对⑶137表达的影响（图86C并增强了对细胞因子IFNy和TNF分泌的影响（图5A-B。将MART-1TIL与Mel-624细胞以1:IE:T培养18小时。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。用抗DNAM-I处理减少了TIL上的CD137表面表达以及所分泌的细胞因子IFNy和TNF。用抗DNAM-I和抗PVRIG组合处理部分地逆转了这些作用（图86D-F。[0871]总结和结论[0872]PDlKD改良了TIL活性，如通过F4和MART-1TIL中的IFNy和分泌所测量。在PVRIGKD后，相比于对照siRNA，在MART-1TIL中观察到IFNy和TNF分泌增加（约20%。在与624黑素瘤细胞共培养后，在F4TIL上关于⑶137表达观察到相同趋势。[0873]抗TIGIT处理不影响与624Mel共培养的TIL的IFNy或TNF分泌水平，然而，当以组合形式向共培养物中添加抗TIGIT和抗PVRIGCPA.7.021时，观察到IFNγ和TNF水平增加。[0874]抗DNAM-1处理减少了TIL-MART-1活化，由减少的⑶137和细胞因子分泌体现，并且抗PVRIGCPA.7.21与DNAM-IAb组合处理可以部分地逆转这种作用。在TIL209中，在抗DNAM-I的情况下，IFNy和TNF分泌水平略微升高（约10%;并且当以组合形式向共培养物中添加抗DNAMl和抗PVRIGCPA.7.021时，观察到IFNγ和TNF水平增加（分别是约40%和30%。总的来说，我们的结果表明PVRIG是PVRL2的新的共抑制性受体。[0875]实例15抗PVRIG抗体与抗TIGIT和抗PDl抗体组合对人类黑素瘤特异性TIL功能的影响[0876]材料和方法[0877]TIL:使用来自三个黑素瘤患者的肿瘤浸润性淋巴细胞TIL:[0878]OTILHS-HLA-AS-Martl特异性[0879]OTlL-Fd-HLA-ASiplOO特异性[0880]OTlLiog-HLA-ASiplOO特异性[0881]在11«^出1，01-058-14完全培养基中解冻1'几，所述培养基补充有10%人类血清西格玛，H3667+1%Glutamax生命技术公司，35050-038+1%丙酮酸钠（BiologicalIndustries，03_042_1Β+1%非必需氨基酸（BiologicalIndustries，01-340-1B+1%青霉素-链霉素（BiologicalIndustries，03-〇31_lB+300Uml的rhIL2Biolegend，509129〇[0882]肿瘤细胞系:在MHC-I单倍型HLA-A2的情况下，人类黑素瘤细胞Mel_6M表达MART-1和gp-100抗原。在完全DMEM培养基BiologicalIndustries，01-055_1A中培养细胞，所述培养基补充有10%FBSBI，04-127-1A、25mMHEPES缓冲液（ΒΙ，03-025-1Β、1%Glutamax生命技术公司，35050-038和I%青霉素-链霉素BiologicalIndustries，03_031-1B。[0883]在抗PVRIG、抗TIGIT和PDl阻断抗体存在下共培养TIL与624黑素瘤细胞:为了评定抗PVRIG抗体CPA.7.021、抗TIGIT克隆10A7和抗mAb1B8,默克公司）对黑素瘤特异性HL活性的影响，在以1:3的效靶比添加624黑素瘤靶细胞之前，将HL3XIO4个细胞孔）与测试抗体或相关同种型对照一起在单处理（IOygAiL中或在组合处理（各自最终IOygmL中预孵育。将培养板在37°C，5%C02下孵育过夜（18小时）。[0884]TIL活化的评定:收集培养上清液并且通过CBA试剂盒目录号560484,BD分析细胞因子分泌。[0885]体外单一疗法抗PVRIG和与抗TIGIT和PDl阻断抗体的组合疗法:将F4TILgp100特异性与Mel-624细胞以1:3E:T培养18小时。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。抗TIGIT或抗1处理不影响IFNγ或TNF分泌水平。然而，当以组合形式向共培养物中添加抗TIGIT或抗与抗PVRIG的组合时，观察到IFNy和TNF水平增加（图87Α-Β。[0886]抗PVRIG、抗TIGIT和roi单独处理不影响与624Mel共培养的TIL的IFNγ或TNF分泌水平，然而，当与抗PVRIGCPA.7.021组合添加抗TIGIT或抗PDl抗体时，观察到IFNγ和TNF水平增加。所呈现的数据表明，与抗TIGIT或抗roi抗体的组合疗法存在协同作用。[0887]实例16:使用报告基因分析，抗PVRIG抗体对TCR信号传导的影响[0888]使用针对TCR信号传导的报告基因检测系统来测试抗PVRIG抗体对TCR介导的信号传导的影响，如Jurkat-NFAT-Luc细胞系。这个Jurkat细胞系衍生物在NFAT反应元件的控制下表达荧光素酶报告基因。用编码全长人类PVRIG的载体转染这些细胞。作为阴性对照，使用经过空载体转染的细胞。具有编码共刺激或共抑制参考分子的载体的转染子充当阳性对照，如⑶28和Η-1。通过在不存在或存在抗PVRIG抗体的情况下添加抗人类⑶3例如，0KT3来刺激转染子。同种型对照充当阴性对照。针对参考分子的已知功能性抗体充当阳性对照。预计功能性激动性交联抗体会显示对荧光素酶活性的抑制作用。[0889]实例17使用PVRL2-FC，抗PVRIG抗体对T细胞活化的影响[0890]使用板结合分析测试抗PVRIG抗体对T细胞活化、增殖和细胞因子分泌的影响。使用lygml板结合的抗人类CD3例如，0KT3和5ygmlPVRL2-FC由PVRL2的ECD，即PVRIG的对应物组成的重组性融合蛋白）或阴性对照刺激经过纯化的人类大量T细胞。通过例如CD137的活化标志物的表达或通过如通过CFSE染料在刺激T细胞之前，用CFSE标记T细胞）的稀释所评估的细胞分裂来评估T细胞活化。还评定了细胞因子产生（例如，IFNg、IL-2作为T细胞活化的额外读出。使用T细胞亚型标志物来区分对CD4或CD8T细胞的特异性作用。共固定的PVRL2-FC可能对T细胞活化具有基础的刺激作用，由T细胞上的PVRL2的已知共刺激对应物受体内源性DNAMl介导。在存在拮抗性抗PVRIGAb的情况下，预计PVRL2-FC的这种刺激性基础作用被进一步增强，因为其阻断了内源性PVRIG对T细胞活化的抑制性影响。因此，预计激动性抗PVRIGAb显示T细胞活化的抑制。[0891]实例18:使用PVRL2异位表达细胞，抗PVRIG抗体对T细胞活化的影响[0892]使用基于细胞的分析测试抗PVRIG抗体对T细胞活化、增殖和细胞因子分泌的影响。在与异位表达PVRL2或空载体的CHO刺激细胞表达膜结合的抗CD3的CHO细胞共培养后，经过纯化的人类大量或⑶4或⑶8T细胞被刺激。通过例如⑶137的活化标志物的表达或通过如通过CFSE染料在刺激T细胞之前，用CFSE标记T细胞的稀释所评估的细胞分裂来评估T细胞活化。还评定了细胞因子产生例如，IFNγ、IL-2作为T细胞活化的额外读出。使用T细胞亚型标志物来区分对⑶4或⑶8T细胞的特异性作用。预计表达PVRL2的CHO刺激子stimulator对T细胞活化具有基础性实例19刺激作用，由T细胞上的PVRL2的已知共刺激对应物受体内源性DNAMl介导。在存在拮抗性抗PVRIGAb的情况下，预计表面表达的PVRL2的这种刺激性基础作用被进一步增强，因为其阻断了内源性PVRIG对T细胞活化的抑制性影响。因此，预计激动性抗PVRIGAb显示T细胞活化的抑制。[0893]实例20使用SEB分析，抗PVRIG抗体对T细胞活化的影响[0894]使用来自健康的志愿者的血细胞和SEB葡萄球菌肠毒素B超抗原结合并活化所有表达VK和Vi38T细胞受体链的T细胞来测试抗PVRIG抗体对T细胞活性的影响。在96孔圆底板中培养人类PBMC并与测试抗体一起预孵育30-60分钟。然后添加10ngmL到10ygmL范围内的各种浓度的SEB。培养2到4天后收集上清液，并且通过ELISA或使用标准CBA试剂盒对所产生的细胞因子例如，IL-2、IFNγ的量进行定量。SEB通过全血细胞以剂量依赖性方式刺激细胞因子产生。测试若干Ab剂量下抗PVRIGmAb对细胞因子产生的影响。预计阻断抗PVRIGmAb可相对于对照IgG增强IL-2产生。除了IL-2之外，还可以在此分析中使用CBA试剂盒测试Ab对额外细胞因子的水平的影响，如TNFa、IL-17、IL-7、IL-6和IFNγ。[0895]实例21抗PVRIG抗体在Ag特异性分析中的作用[0896]用于概述抗人类PVRIG抗体对健康的供体血液中预先存在的记忆T细胞的Ag特异性刺激的功能作用的分析是破伤风类毒素TT分析。为此目的，将新鲜制备的PBMC2XIO5个细胞涂铺在96孔圆底板中的完全RPMI1640培养基含有5%热灭活人类血清）中，与不同浓度的测试抗体一起预孵育并用浓度为100ngmL的TTAstarteBiologies刺激。在37°C下孵育细胞3到7天，之后收集上清液。通过ELISA和或CBA试剂盒测定细胞因子浓度例如，IL-2、IFN-γ。相比于用单独的TT抗原所获得的，预计阻断抗PVRIGAb可增强T细胞增殖和细胞因子产生。[0897]类似于以上所述的使用TT来刺激人类记忆T细胞的方法，我们可以在对例如CMV、EBV、流感HIV、腮腺炎和TB等额外抗原的回忆反应后，使用与上文所述类似的实验装置测试抗PVRIGAb对T细胞活化的影响。使用如KLH的新抗原，这还能够用于测试抗PVRIG抗体对初始细胞的刺激的影响。[0898]另外，测试抗PVRIGAb对经过四聚体分选的Ag特异性⑶8T细胞的抗原特异性反应的影响，所述T细胞来自患有如HCV和HIV的病毒感染的患者的外周血。将经过四聚体分选的CD8T细胞与负载肽的自体PBMC共培养5天。评估CD8Ag特异性T细胞的增殖和细胞因子例如，IFNγ、IL2、TNF-a的分泌。相比于单独的抗原，我们预计抗PVRIG抗体可增强增殖和细胞因子产生。[0899]实例22融合瘤衍生的抗体针对PVRIG的结合和功能分析[0900]本实例显示融合瘤衍生的抗体CHA抗体与细胞系和原代白细胞中的人类和食蟹猴PVRIG蛋白质的结合的特征，以及融合瘤衍生的抗体阻断PVRIG与PVRL2之间的相互作用的能力的特征。[0901]方案[0902]hPVRIG过表达细胞的FACS分析:使用以下细胞系评定抗人类PVRIG抗体的特异性:HEK亲本细胞和HEKhPVRIG过表达细胞。在DMEMGibco+10%胎牛血清Gibco+glutamaxGibco中培养这些细胞。关于HEKhPVRIG过表达细胞，还向培养基中添加0.5ygml嘌呤霉素Gibco进行正选择。关于FACS分析，收集所有对数生长期的细胞系并且在96孔板中每孔接种50,000到100,000个细胞。以单点稀释液5以81111或从1^81111开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类PVRIG抗体mlgGl或mIgG2a和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续稀释进行。使用FACSCantoIIBD生物科学）或IntelliCytIntelliCyt公司）采集数据并使用FlowJoTreestar和Prism^Graphpad软件分析。[0903]针对hPVRIG对人类细胞系进行FACS分析:使用以下细胞系评定抗人类PVRIG抗体的表达和特异性:Jurkat和HepG2。在RPMI培养基+10%胎牛血清、glutamax、非必需氨基酸Gibco、丙酮酸钠Gibco和青霉素链霉素Gibco中培养Jurkat细胞。在DMEM+10%胎牛血清+glutamax中培养HepG2细胞。关于FACS分析，收集所有对数生长期的细胞系并且在96孔板中每孔接种50,000到100,000个细胞。以单点稀释液細81111或从1^1111开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类PVRIG抗体mlgGl或mIgG2a和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续稀释进行。使用FACSCantoII或IntelliCyte采集数据并使用FIowJo和Prism软件分析。[0904]针对hPVRIG对初始人类原代白细胞进行FACS分析:通过外周血斯坦福血库）的Ficoll通用电气医疗集团）梯度分离获得原代白细胞。将白细胞作为经过分离的外周血单核细胞PBMC于10%DMS0西格玛）、90%胎牛血清混合物中以介于IXIO7与5XIO7个细胞毫升之间的密度冷冻在液氮中。为了评定PVRIG在PBMC上的蛋白质表达，设计针对主要免疫亚组的抗体鸡尾酒，包括人类抗PVRIG抗体。以单点稀释液5ygml或在一些情况下从10μgml开始的4点滴定系列在冰上添加抗人类PVRIG抗体mlgGl或mIgG2a和其相应对照，持续30分钟到1小时。[0905]简单来说，向复苏的PBMC中添加抗体鸡尾酒混合物，以5XIO5到IXIO6个细胞孔接种，然后是Fc受体阻断和活死染色AquaLiveDead，生命技术公司）。将抗体鸡尾酒与PBMC—起在冰上孵育30分钟到1小时。接着洗涤PBMC并且使用FACSCantoII通过FACS采集数据。使用Flowjo和Prism软件分析数据。所分析的免疫亚组包括⑶56暗淡NK细胞、CD56明亮NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、非常规T细胞例如，NKT细胞和γδΤ细胞）、B细胞以及单核细胞。[0906]食蟹猴PVRIG工程改造的过表达细胞的FACS分析：使用以下细胞系评定抗人类PVRIG抗体与食蟹猴PVRIGcPVRIG的交叉反应性:expi亲本细胞和expicPVRIG过表达细胞。在DMEM+10%胎牛血清+glutamax中培养这些细胞。通过使用Neon转染系统将cPVRIGDNA电穿孔到亲本expi细胞中产生expicPVRIG瞬时过表达细胞。关于FACS分析，使用转染1至IJ3天后的expicPVRIG细胞。收集对数生长期的亲本expi细胞。在96孔板中每孔每种类型接种50,000到100,000个细胞。以单点稀释液5以81111或从1^81111开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类PVRIG抗体mlgGl或mIgG2a和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续稀释进行。使用FACSCantoII或IntelliCyte采集数据并使用FlowJo和Prism软件分析。[0907]初始原代食蟹猴白细胞的FACS分析:从表达分析前不超过24小时抽取的新鲜血液获得原代食蟹猴cyno白细胞。血液来源于生物再生。为了评定PVRIG在cynoPBMC上的蛋白质表达，设计针对主要免疫亚组的抗体鸡尾酒，包括人类抗PVRIG抗体。以单点稀释液5μgml或从10ygml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类PVRIG抗体mlgGl或mIgG2a和其相应对照，持续30分钟到1小时。[0908]简单来说，向PBMC中添加抗体鸡尾酒混合物，以5XIO5到IXIO6个细胞孔接种，然后进行Fc受体阻断和活死染色。将抗体鸡尾酒与PBMC—起在冰上孵育30分钟到1小时。接着洗涤PBMC并且使用FACSCantoII通过FACS采集数据。使用Prism软件分析数据。所分析的免疫亚组包括⑶16+淋巴细胞、⑶14+⑶56+单核细胞骨髓细胞和⑶3+T细胞。[0909]基于细胞的竞争分析：在细胞竞争分析中评定PVRIG抗体抑制PVRIG与其配体PVRL2的相互作用的能力。在此分析中，配体PVRL2在未被操控的HEK细胞上内源性表达并添加可溶性Fc标记的PVRIG由金斯瑞根据需要制造）。在这种情况下，通过向100，OOO个HEK细胞中相伴地添加33nM可溶性PVRIG蛋白质和PVRIG抗体0.066-66nM并在冰上孵育1小时来评定PVRIG抗体阻断可溶性PVRIG与HEK细胞结合的能力。通过在冰上添加抗人类FeAlexa647杰克逊实验室JacksonLaboratories，持续20-30分钟来检测PVRIGFc结合程度。将细胞在PBS中洗涤两次，使用FACSCantoII进行采集。使用FlowJoTreestar、Excel微软）和Prism^GraphPad分析数据。[0910]结果[0911]融合瘤PVRIG抗体识别过表达细胞上的PVRIG:为了筛选对PVRIG具有特异性的抗体，我们评定了由两个融合瘤周期产生的抗体结合经过工程改造以过表达人类PVRIG的HEK细胞系的能力。大部分来自这些周期的抗体都结合到HEKhPVRIG细胞，尽管亲和力不同。此夕卜，这些抗体中的大部分还显示出与HEK亲本细胞系的低背景结合，指示针对PVRIG的高特异性。图77显示了PVRIG抗体的特异性的一个实例。在融合瘤周期中产生的抗体与HEKhPVRIG细胞相对于对照的所有结合特征的汇总呈现在图79中。[0912]PVRIG抗体识别初始NK和T细胞上的PVRIG蛋白质：在初始PBMC亚组上展示最高水平的PVRIG的群体是NK和⑶8T细胞，并且这两个细胞亚组之间的绝对表达水平是相似的gMFIXD4T细胞显示低水平的PVRIG，而B细胞和单核细胞具有非常低的可检测表达无可检测表达。如通过抗体检测的初始NK细胞和⑶8T细胞上的表达的汇总显示在图91中。其它次要亚组也展现了PVRIG表达并且包括非常规T细胞，如NKT细胞和γδΤ细胞。在所获得的和分析的所有供体中，在PBMC亚组上的表达模式非常相似。[0913]通过融合瘤衍生的PVRIG抗体检测Jurkat细胞系上的PVRIG:除了对PBMC进行PVRIG蛋白质表达筛选之外，我们还想要了解它是否也在癌细胞系上表达。我们选择鉴于PVRIGRNA的高表达来筛选Jurkat细胞上的我们的抗体。我们还选择HepG2作为阴性对照细胞系来进一步验证我们的抗体的特异性。大多数融合瘤衍生的抗体确实检测到PVRIG蛋白质在Jurkat细胞上的表达（图79PVRIG融合瘤抗体与原代人类PBMC、cyno过表达细胞和cyno原代PBMC结合的特征）JxpicynoOE表示经过cPVRIG瞬时转染的expi细胞，expipar表示expi亲本细胞。gMFIr指示PVRIG抗体染色的几何MFI相对于其对照的倍数差异。浓度指示计算gMFIr时的浓度。未测试指示因为缺少与人类HEKhPVRIG、expicPVRIG细胞的结合或不符合PBMC亚组的结合要求而未进行测试的抗体。突出显示的抗体是进行人源化的四个抗体参见图90。[0914]图92，但不是HepG2细胞数据未示出）Jurkat上的PVRIG检测的实例显示在图78中，代表性抗体为CPA.7.518。[0915]基于细胞的生化分析:在细胞生化分析中筛选出我们的29个融合瘤抗体之后，我们发现存在20个明显阻断剂和9个PVRIG-PVRL2相互作用的非阻断剂。所有阻断抗体都能够使PVRIGFc与HEK细胞的相互作用抑制至少50%，其中这些抗体中的大多数完全消除了PVRIGFc结合。与确实显示出阻断能力的那些抗体相关的IC5q值报告在图92中。大部分IC50值介于20到60nM之间。[0916]总结和结论[0917]使用融合瘤平台，我们已经能够成功地产生针对人类PVRIG抗原的单克隆抗体。使用经过工程改造的过表达细胞以及一系列癌细胞系，我们证明了，我们的抗体对PVRIG抗原很有特异性，并且能够检测与RNA表达相关的蛋白质表达。在人类PBMC亚组的分析后，我们证明了，PVRIG蛋白质在NK和T细胞上表达最高，并且在B细胞和骨髓细胞上低阴性表达。通过评定这些抗体与过表达细胞的结合，我们还证明了一定比例的这些抗体可与食蟹猴cynoPVRIG抗原交叉反应。此外，cynoPBMC上的表达模式类似于人类PBMC。最后，我们通过基于FACS的竞争分析能够证明，一定比例的我们的融合瘤抗体能够抑制PVRIG与其配体PVRL2的相互作用。就所有前述数据来说，显示出最佳特征的抗体是CHA-7-518、CHA-7-524、CHA-7-530和CHA-7-538。[091S]实例23.CHA抗PVRIG抗体在MLR分析中的作用[0919]用于概述抗人类PVRIG抗体对同种异体抗原反应的功能作用的分析是在混合淋巴细胞反应MLR分析中人类CD8+T细胞的增殖。如本领域中已知，MLR是提供T细胞功能的体外相关性的离体细胞免疫分析。[0920]预计抗PVRIG抗体响应于来自MHC错配供体的细胞增强人类CD4和CD8T细胞的增殖。通过使用人类T细胞RosetteSepRTMStemCellTechnologies，根据制造商的说明书，从一个供体例如，供体A的全血富集人类T细胞。在分离之后，用CFSE染料分子探针公司）对细胞进行荧光标记。为了充当同种异体抗原呈递细胞APC，首先从来自MHC错配供体例如，供体B的全血中分离出单核细胞，然后是CD3+T细胞耗竭。然后在铯辐射器中用2500拉德辐射APC。[0921]—般来说，如下进行MLR分析。将人类T细胞和150，000个同种异体APC在含有150，000个CD8+T细胞和APC的96孔平底板中与不同浓度的抗PVRIG抗体共培养5天。在第5天收集细胞，洗涤并且相继用抗⑶8生物素、抗生蛋白链菌素-PerCp染色。通过FACS运行样品以评定如由CFSE稀释液所描绘的增殖程度。预计功能阻断性抗PVRIG抗体可响应于来自MHC错配供体的细胞增强T细胞增殖和细胞因子分泌。[0922]使用MLR分析表征本发明的CHA抗体对静息的和活化的人类T细胞的生化影响，并且表征融合瘤衍生的抗体在MLR环境中调节T细胞增殖的能力。[0923]方案[0924]混合淋巴细胞反应MLR:通过在同种异体环境中共培养源自不同供体的树突状细胞DC和T细胞来建立混合淋巴细胞反应。通过将经过纯化的单核细胞与100ngmlGM-CSF安迪生物科技公司）和100ngmlIL-4安迪生物科技公司）培养7天产生DCJ天后，将经过纯化的CFSE标记的⑶3T细胞与DC以10:1的比率组合并且在Xvivo-20无血清培养基龙沙Lonza中培养5天。在一些条件下，向培养板中添加10ygml未结合的抗PVRIG抗体或同种型对照抗体。设置三种MLR分析排列，其中将来自一个供体的DC与来自另外3个同种异体供体的⑶3T细胞共培养。所有血液产品全来源于斯坦福血库。[0925]表达和功能分析:在5天MLR培养之后，通过CFSE稀释液和如⑶25和PD-I的活化标志物的表达评定T细胞活化和增殖的水平和程度。使用来自噬菌体周期和融合瘤周期的内部（in-house抗PVRIG抗体评定PVRIG的表达。还按动力学方式评定了PVRIG配体PVRL2在DC上的表达。使用流式细胞仪采集所有数据并使用FlowJoTreestar和PrisnKGraphpad软件进行数据分析。[0926]基于FACS的表位分析：因为我们在MLR中测试了抗体阵列，所以我们想要确定这些抗体是否可以根据基于FACS的结合进行表位‘分库’，并且这种‘分库’是否与所述分析中T细胞活化和增殖的改变有关。为此，将从分析中收集到的T细胞与未结合的PVRIG抗体一起预孵育，并且然后用不同克隆的结合的PVRIG抗体进行复染。结合的PVRIG抗体在T细胞上给出信号的程度指示这个抗体必须针对T细胞上的PVRIG结合与未结合的抗体竞争的程度。阴性或低信号将指示存在高竞争，指示两个抗体在同一个表位‘库’中。高信号将指示低竞争或无竞争，并且因此将认为抗体在不同的‘库’中。[0927]结果[0928]PVRL2在单核细胞衍生的DC上的表达:为了确定就MLR分析来说PVRL2是否将在DC上表达，由单核细胞产生DC，并且在添加GM-CSF和IL-4之后按每天一次的时间间隔以动力学方式评定PVRL2表达。如图72中所指示，PVRL2表达从第0天起直到第5天一直在增加，在第5天，表达达到峰值。在第6天，表达相比于第5天略微降低。在第7天，表达类似于第6天，指示PVRL2表达在这些时间点稳定了。因此，在恰当的时间点DC表达的PVRL2适用于MLR分析。[0929]在MLR培养之后PVRIG在T细胞上的表达:许多在MLR中调节功能的T细胞受体在增殖T细胞上表达。因此，我们想要确定PVRIG是否也表达。我们分析了在MLR共培养开始后第5天的增殖T细胞，并且通过其CFSE稀释（即CFSE低）进行表征。如图73和图74中所示，相对于同种型对照mlgGl，PVRIG在CFSE低细胞上表达，如通过多个PVRIG抗体在所分析的三个供体中在⑶4和⑶8T细胞上所测定。在图73中所示的FACS图指示CFSE低细胞上的PVRIG，并且图74中的条形图指示PVRIG相对于mlgGl的表达水平。[0930]PVRIG抗体增强T细胞增殖:在已经证明了PVRIG表达在MLR中在增殖T细胞上表达之后，我们想要确定用PVRIG抗体处理是否会影响T细胞增殖的水平。如图4中所示，向MLR分析中添加PVRIG抗体能够相比于对照提高所测试的所有融合瘤抗体中CFSE低细胞的百分比。在所分析的所有供体中都观察到了这一点。[0931]PVRIG抗体与PVRIG上的多个表位结合:为了比较PVRIG抗体结合PVRIG上的不同表位的能力，我们进行了竞争实验，其中将来自MLR的T细胞与衍生自我们的融合瘤周期的未标记的抗PVRIG抗体一起培养5天。然后在第5天收集T细胞并且用衍生自我们的噬菌体周期的结合的抗PVRIG抗体CPA.7.021复染。如图76中所示，当相比于背景荧光水平时，观察到在含有CHA·7·516-M1、CHA·7·518-MI、CHA·7·524-MI、CHA·7·530-M1和CHA·7·538-M1的条件下CPA.7.021结合完全减少或接近完全减少，表明这些抗体在表位识别中可以重叠。在CHA.7.537-MI、CHA.7.528-M1和CHA.7.548-M1的情况下，观察到CPA.7.021结合部分减少，表明在表位识别中部分重叠。在与CHA.7.543-M1预培养的细胞中，观察到CPA.7.021结合无减少，表明缺乏表位识别。总的来说，这份数据指示，当相对于CPA.7.021进行评定时，来自我们的周期的PVRIG抗体可以识别PVRIG上至少3个不同的表位。[0932]结论:我们表征了我们的PVRIG抗体与增殖的和静息的T细胞结合的能力，以及其在MLR中的功能活性。在增殖T细胞上检测到多个PVRIG抗体的结合并且所述结合在增殖T细胞上比在静息T细胞上，尤其是⑶8+亚组上高。这份数据证明PVRIG表达在T细胞活化后增加。此外，相比于mlgGl同种型，若干PVRIG抗体提高了T细胞增殖，指示其还能够调节T细胞功能。如上，这些抗体全都具有阻断PVRIG与其配体PVRL2的能力。基于这点，我们得出以下结论:通过阻断PVRIG-PVRL2相互作用，这些抗体引起T细胞活化和增殖增加，这是将用于治疗癌症的免疫检查点抑制剂的所期望的作用的标志性指示。最后，我们进行竞争实验，相对于噬菌体衍生的抗体比较了多个融合瘤衍生的PVRIG抗体与活化的T细胞的结合。根据这个系列的实验，我们为我们的噬菌体和融合瘤衍生的抗体的表位多样性提供了证据。[0933]实例24.抗PVRIG抗体在与免疫检查点阻断组合后对T细胞活化的影响[0934]预计PVRIG阻断与已知免疫检查点（例如，PDUPDL-I或TIGIT的阻断性Ab的组合进一步增强了以上所描绘的分析中对T细胞活化的刺激作用。[0935]实例25.PVRIG抗体的功能分析[0936]表征本发明的人类PVRIG抗体抑制PVRIG与其配体PVRL2的相互作用的能力和其在基于原代细胞的分析中调节效应淋巴细胞功能的能力。[0937]方案[0938]基于细胞的生化分析[0939]在两种方向的细胞生化分析格式中评定PVRIG抗体抑制PVRIG与其配体PVRL2的相互作用的能力。[0940]在第一方向，配体PVRL2在未被操控的HEK细胞上内源性表达并且添加可溶性生物素标记的Fc标记的PVRIG由金斯瑞根据需要制造）。在这种情况下，通过两种排列评定PVRIG抗体阻断可溶性PVRIG与HEK细胞结合的能力。在第一排列中，将各种浓度的PVRIG抗体（范围0.066-66nM与33nM的可溶性PVRIG—起在磷酸盐缓冲盐水PBS，Gibco中在冰上孵育30分钟。随后将这个复合物添加到100，000个HEK细胞中并在冰上再孵育1小时。1小时后，在PBS中洗涤HEK细胞两次并且通过添加与Alexa647杰克逊实验室）结合的抗生蛋白链菌素在冰上持续30分钟来检测可溶性PVRIG与HEK细胞的结合程度。将HEK细胞在PBS中洗涤两次，并且再悬浮于1〇〇μ1的PBS中以便在FACSCantoIIBD生物科学）上采集。使用FlowJoTreestar和Prism^Graphpad软件分析数据。在第二排列中，向100,000个HEK细胞中同时添加33nM的可溶性PVRIG蛋白质和PVRIG抗体0.066-66nM并在冰上孵育1小时。用于分析此排列的后续步骤等效于第一排列。[0941]在第二方向，将HEK细胞工程改造成过表达PVRIG并添加可溶性生物素标记的Fc标记的PVRL2CD生物科学）。在这种情况下，向100，000个HEKhPVRIG或亲本HEK细胞中同时添加各种浓度的PVRIG抗体（范围0-200nM与160nM可溶性PVRL2，并在PBS+1%BSA+0.1%叠氮化钠FACS缓冲液）中在冰上孵育1小时。通过在冰上添加FACS缓冲液中的抗生蛋白链菌素Alexa647持续30分钟来检测可溶性PVRL2结合。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，并且再悬浮于50μ1的PBS中以便在IntellicytHTFCIntellicyt上采集。使用FlowJoTreestar、Excel微软）和Prism^GraphPad分析数据。[0942]原代NK细胞分析[0943]具有最强的PVRIG表达谱的I3BMC亚组在NK细胞上。因此，我们用表达PVRL2的肿瘤细胞设计了基于NK细胞的共培养分析来判定我们的抗体是否可以调节NK细胞介导的针对这些靶标的细胞毒性。我们选择的靶标是急性B细胞淋巴细胞性白血病细胞系RehATCC细胞库和急性骨髓性白血病细胞系M0LM-13DSMZ细胞库）。使Reh和M0LM-13细胞在RPMI培养基Gibco+20%胎牛血清Gibco、glutamaxGibco、青霉素链霉素Gibco、非必需氨基酸Gibco、丙酮酸钠Gibco、HEPESGibco和β-巯基乙醇Gibco中生长。[0944]在共培养分析两天前，使用人类NK细胞分离试剂盒美天旎生物技术公司）分离原代NK细胞并在RPMI培养基+20%胎牛血清、glutamax、青霉素链霉素、非必需氨基酸、丙酮酸钠、HEPESJ-巯基乙醇和250UmlIL-2安迪生物科技公司）中培养。在分析当天，收集NK细胞，进行计数并与PVRIG抗体一起在室温下预孵育15-30分钟。在此孵育期间，从培养物中收集靶细胞，用钙黄绿素AM生命技术公司）在37°C下标记30分钟，在培养基中洗涤，并且经过计数以用于所述分析。建立NK细胞介导的细胞毒性分析，其中将恒定量的靶细胞50,000个与跟5ygml的PVRIG抗体预孵育过的递增浓度的NK细胞共培养油此改变NK细胞与靶标的比率）。或者，在分析中使用固定的NK细胞与靶标的比率，但是在剂量滴定中NK细胞与不同浓度的PVRIG抗体范围3.9ngml-5ygml—起预孵育。在添加了NK细胞和靶标之后，使培养板在I，400rpm下脉冲旋转1分钟并且放置在37°C下5%⑶2气氛中，持续4小时。4小时后，使培养板在MOOrpm下旋转4分钟，并且收集80μ1的上清液以对从靶细胞释放的钙黄绿素AM进行定量。通过SpectramaxGeminiXS焚光计分子仪器公司）评定从祀标释放的f丐黄绿素AM的数量。作为钙黄绿素AM释放的对照，通过在分析的持续时间内将靶细胞暴露于70%乙醇或仅培养基中来评定总释放和自发释放。使用下式计算NK细胞的杀死水平（按百分比计）：[0945]样品释放-自发释放八总释放-自发释放*100[0946]除了PVRIG抗体之外，在一些情况下，还添加了针对NK细胞受体的其它抗体作为比较，如TIGIT基因泰克（Genentech，克隆10A7,专利号：W02009126688A2和DNAM-IBiolegend，克隆11A8。[0947]结果[0948]基于细胞的生化分析:在细胞生化分析中筛选出一组我们的PVRIG抗体之后，我们发现在所测试的抗体中，抑制水平不同，并且抑制水平取决于分析的排列和方向（图98。在图93中具体显示了四个抗体来说明这些要点。相对于对照给出最强的抑制作用的分析方向和排列是在向HEK细胞中添加与PVRIG抗体一起预孵育过的可溶性PVRIG时（图93a。在这种排列中，相比于另外三个抗体CPA.7.002、CPA.7.005和CPA.7.050，CPA.7.021显示出最佳的绝对阻断能力。尽管阻断水平有差异，但是这个排列中的所有抗体都显示出类似的IC50值，这些值在低纳摩尔范围内，并且阻断能力在较高的浓度下达到稳定。[0949]当在向HEK细胞中同时添加可溶性PVRIG和PVRIG抗体时测量由四个PVRIG抗体所产生的绝对抑制水平时，在所述分析中观察到较多的阻断可变性（图93bXPA.7.021依然是最佳阻断抗体。然而，CPA.7.002和CPA.7.005所显示的抑制可溶性PVRIG与HEK细胞结合的能力明显小于对照抗体。相比于CPA.7.021、CPA.7.002和CPA.7.005，CPA.7.050显示中等阻断水平。绝对抑制水平的这种差异还对应于每个抗体的IC5q值的差异。CPA.7.021和CPA.7.050再次显示低纳摩尔IC5q值，但他们均高于分析的第一排列中。相比之下，CPA.7.002和CPA.7.005的IC5Q值大幅增加，CPA.7.002增加了约20倍，并且CPA.7.005增加了约30倍。这份数据指示抗体如何必须与PVRIG与其同源配体的结合相竞争，将指示抗体能够阻断这种相互作用的效能。[0950]当生化分析的方向逆转（即评定PVRL2FC与HEKhPVRIG细胞的结合时，四个PVRIG抗体阻断PVRL2Fc相互作用的能力是可变的（图93c。与使用HEK细胞作为靶标的生化分析一致（图93a-b，CPA.7.021和CPA.7.050抑制PVRL2Fc与HEKhPVRIG细胞结合，并且其阻断结合的能力是相似的。然而出人意料的是，我们看到在存在CPA.7.002和CPA.7.005抗体的情况下PVRL2Fc结合增强，在使用HEK细胞作为靶标时我们并没有观察到这一点。[0951]采用Reh细胞进行NK细胞的细胞毒性分析:在NK细胞的细胞毒性分析中我们研究的第一靶标是Reh系。最初选择Reh是因为它在流式细胞仪中显示稳固的PVRL2水平，但是如NKG2D配体的其它活化配体的频率低，并且PVR的表达低（图94。不使用传统的NK细胞靶标，如K562,这是因为其对高频率NKG2D配体的表达和PVR的表达高，这些会掩盖PVRIG抗体的功能作用。重要的是，Reh细胞不表达任何已知与PVRL2和PVR相互作用的NK细胞受体，如TIGIT、DNAM-1和PVRIG。[0952]在此分析中筛选出一组我们的PVRIG抗体之后，我们发现了四个能够调节NK细胞介导的细胞毒性的抗体（图99。这四个抗体是在生化分析结果部分中被讨论的那些：〇卩八.7.002工?4.7.005工?4.7.021和0?4.7.050。在所有情况下，这些抗体的添加都增强了NK细胞介导的针对Reh细胞的细胞毒性（图95a-cXPA.7.002和CPA.7.005的添加最大地增强了细胞毒性（图95a-b，其次是CPA.7.021和CPA.7.050，它们显示出类似的增强水平（图95c。图95d显示通过CPA.7.002和CPA.7.021获得的NK细胞介导的细胞毒性的增强的浓度依赖性分析。向分析中与Reh细胞一起添加针对已报导也结合PVRL2的受体（如TIGIT和DNAM-1的阻断抗体作为比较。如图95e-f中所示，TIGIT和DNAM-I抗体的添加在此分析中不显示功能作用。[0953]采用M0LM-13细胞进行NK细胞分析:为了评定PVRIG抗体是否能够调节NK细胞介导的针对第二靶标的细胞毒性，采用M0LM-13细胞。类似于Reh细胞，M0LM-13也表达PVRL2，而且具有稳固的PVR表达（图94。与Reh细胞一样，M0LM-13不表达任何NK细胞受体。除了Reh细胞之外，采用这个细胞系将指示PVRIG抗体是否能够在不同的受体-配体相互作用的情况下，尤其是在PVR表达时调节NK细胞介导的细胞毒性。[0954]在此分析中筛选出我们的PVRIG抗体之后，我们发现CPA.7.021的功能作用减弱并且不显示NK细胞介导的细胞毒性相对于对照水平的显著增强（图97a。相比之下，在此分析中，CPA.7.002和CPA.7.005能够增强NK细胞介导的细胞毒性（图97a。使用比较抗体，在此分析中当相比于对照时，TIGIT的阻断不显示功能作用（图97b。[0955]总结和结论[0956]使用我们的抗体噬菌体平台，我们产生了一组针对人类PVRIG抗原的抗体，其显示阻断PVRIG与其配体PVRL2的相互作用并增强NK细胞介导的针对两个血液细胞系的细胞毒性的能力。PVRIG抗体抑制PVRIG和PVRL2相互作用的能力受分析方向以及预孵育步骤的影响，预孵育步骤代表着与PVRIG在例如癌症的生理背景下的潜在抗体动力学。四个抗体显示出增强NK细胞介导的针对Reh细胞系的细胞毒性的能力，但是仅两个抗体显示出增强针对M0LM-13细胞的细胞毒性的能力。这种差异可能归因于每个细胞系的NK细胞介导的识别中所涉及到的替代性受体-配体相互作用和或抗体的不同特性和其在调节PVRIG功能方面的效能。[0957]实例26.使用PVRL2异位或天然表达细胞，抗PVRIG抗体对GDT细胞活化的影响[0958]使用基于细胞的分析测试抗PVRIG抗体对γδΤ细胞活化、增殖和细胞因子分泌的影响。用HMBPP或IPP活化经过纯化的人类γδΤ细胞并与天然表达PVRL2的靶细胞（例如，1^1、10111-13或与异位表达?¥1^2或空载体的靶细胞例如，〇10、1^1721.221共培养。通过检查所培养的上清液中的细胞因子产生例如，IFN-γ、IL-17或对靶细胞的细胞毒性活性来评定γδΤ细胞功能。预计PVLR2表达对γδΤ细胞活化具有基础性刺激作用，由γδΤ细胞上的PVRL2的已知共刺激对应物受体内源性DNAMl介导。在存在拮抗性抗PVRIGAb的情况下，预计细胞因子产生或细胞毒性活性被进一步增强，因为其阻断了内源性PVRIG对γδΤ细胞活化的抑制功能。因此，预计激动性抗PVRIGAb显示γδΤ细胞活化的抑制。[0959]实例27:在存在自体PBMC的情况下，蛋白质对使用抗CD3和抗CD28活化的人类T细胞的影响[0960]材料和方法[0961]在这些实验中，在存在自体PBMC的情况下评估PVRIG对使用抗⑶3和抗⑶28活化的人类T细胞的影响。反之，此分析还能够用于分析抗PVRIG抗体对T细胞活化的影响。[0962]PVRIGhECD-hlg融合蛋白（图92ΒΑ由人类PVRIG的ECD融合人类IgGl的Fc组成，在铰链处含C220、C226和C229的S突变，在金斯瑞（中国）通过在CH0-3E7细胞中瞬时转染，培养6天，然后对所收集的细胞进行蛋白A纯化而产生。在PBSpH7.2中配制最终产物。所用的表达载体是哺乳动物表达载体PTT5,其中PVRIG基因由CMV启动子驱动。[0963]CD4+人类T细胞分离试剂盒II购自美天旎（目录号130-094-131AIgGl对照Synagis®从医学免疫公司MedimmuneInc.获得。抗人类CD3Ab0ΚΤ3,目录号16-0037和抗人类CD28Ab克隆CD28.2;目录号16-0289购自eBioscience。戴诺磁珠M-450Epoxy目录号140.11购自英杰。人类血液的血块黄层从LifeSource获得。Fico11-PaquePlus目录号17-1440-02购自通用电气医疗集团。[0964]使用Ficoll分离从血块黄层分离PBMC:将全部的PBMC悬浮于离体20培养基中，并且用3000拉德辐射。使用CD4+人类T细胞分离试剂盒II美天旎），根据制造商的说明书从三个健康人类供体血液的血块黄层中分离出初始CD4+T细胞，并与经过辐射的自体PBMC以1:1的比率1.5XIO5个T细胞，每孔1.5XIO5个经过辐射的PBMC共培养。用抗⑶30.5ygml和抗CD280.5ygml抗体活化培养物。向培养物中添加指定浓度的抗PVRIG抗体或PVRIGECD蛋白质。培养24小时后，用H3-胸苷给细胞施加脉冲。培养72小时后收集细胞。[0965]关于ECD实验，预计结果是引起T细胞增殖和或活化的剂量依赖性抑制，支持基于免疫抑制性PVRIG的治疗剂例如，根据本发明的至少一些实施例的PVRIG多肽或PVRIG融合蛋白）的以下治疗潜能：用于治疗T细胞驱动的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣和发炎性肠病；以及用于治疗其它免疫相关疾病和或用于减少在基因或细胞疗法之后不合需要的免疫活化。基本上，激动PVRIG的免疫抑制性PVRIG蛋白质应该防止或减少T细胞的活化和这类病况的疾病病理学中所涉及的促炎性细胞因子的产生。[0966]另外，预计这些结果还支持免疫刺激性抗PVRIG抗体的以下治疗潜能：降低PVRIG的抑制活性以治疗将受益于增强的免疫反应的病况，如癌症、传染病、尤其是慢性感染以及脓毒症的免疫疗法。基本上，免疫刺激性抗PVRIG抗体将促进T细胞的活化并引起促炎性细胞因子的产生，从而促进癌性或被感染细胞或感染物的耗竭。[0967]实例28:T细胞活化分析的抑制.[0968]在这些实验中，在珠粒分析中分析PVRIGE⑶或抗PVRIG抗体对T细胞活化的影响。[0969]材料和方法[0970]人类T细胞的分离:从斯坦福血库从健康人类供体获得血块黄层。使用RosetteSep试剂盒StemCellTechnologies根据制造商的说明书从血块黄层分离出⑶3+T细胞。通过流式细胞仪用抗CD45和抗CD3分析细胞以评估所获得的CD3+细胞的百分比。在解冻之后在分析之前评估活力。[0971]珠粒涂查和QC:用抗⑶3mAb和PVRIGECD蛋白质或抗PVRIG抗体在两步方案中以500XIOfVml涂布甲苯磺酰基活化的珠粒（英杰，目录号14013:50ygml人类抗⑶3克隆UTCHl安迪生物科技公司，目录号mab100于磷酸钠缓冲液中，在37°C下过夜，然后是0-320ygml的PVRIGECD蛋白质或抗PVRIG抗体，再在37°C下孵育过夜。[0972]分析结合到珠粒上的PVRIG蛋白质ECD或抗体的量。[0973]珠粒分析设置:将IOOk人类CD3+T细胞与IOOk或200k涂有各种浓度的PVRIG蛋白质的珠粒在完全MDMGibco，目录号12440-053中培养5天，所述完全MDM补充有2%AB人类血清Gibco，目录号34005-100、GlutmaxGibco，目录号35050-061、丙酮酸钠Gibco，目录号11360-070、MEM非必需氨基酸溶液（Gibco，目录号11140-050以及2-巯基乙醇Gibco，目录号21985。在5天培养结束时，用抗⑶25、抗⑶4、抗⑶8和可固定的活死染料给细胞染色以测定每个细胞亚组上的⑶25表达水平。收集上清液并且通过ELISA人类INFγduoset，安迪生物科技公司，DY285分析IFNγ分泌。[0974]在这些实验中，分析与涂有各种浓度的PVRIG蛋白质的珠粒共培养过的人类CD3T细胞的⑶25表达水平。预期⑶4+和⑶8+细胞均显示受到PVRIG-ECD融合蛋白的剂量依赖性抑制，或反之，预期⑶4+和⑶8+细胞均显示受到PVRIG-抗体的剂量依赖性活化。[0975]实例29:抗人类PVRIG抗体的基于食蟹猴交叉反应性的表位作图（Epitopemapping[0976]原理和目标[0977]本研究的目标是为了鉴别PVRIG蛋白质上决定抗人类PVRIG抗体对食蟹猴cyno直系同源物的交叉反应性的表位。许多针对人类PVRIG靶标的主导抗体显示不同程度的食蟹猴交叉反应性，尽管事实上这些抗体中的许多属于同一个表位库。为了弄清人类食蟹猴交叉反应性或其缺乏）的分子基础，设计了若干食蟹猴到人类的PVRIG重组蛋白突变，使其表达并进行纯化，并且在ELISA中测试其与一组抗人类PVRIG抗体的结合。[0978]方法[0979]食蟹猴到人类的PVRIG变异体的设计：人类和PVRIG胞外结构域ECD的序列比对显示人类与食蟹猴直系同源物之间90%的序列同一性和93%的序列同源性（图100。基于突变的性质保守的对比非保守的）和突变区的二级结构预测卷曲对比延伸），设计食蟹猴PVRIG的三种定点突变体来探测以食蟹猴交叉反应性为重点的表位作图。这些突变体包括H6IR、P67S和L95RT97IcynoPVRIG。还产生了野生型食蟹猴和人类PVRIG。[0980]食蟹猴、人类和混合PVRIG变异体的表达和纯化:所有PVRIG变异体全都在哺乳动物细胞中表达为具有C端6XHis标签的ECD融合体。通过亲和纯化、离子交换色谱和尺寸排阻色谱纯化蛋白质。将经过纯化的蛋白质的缓冲液更换为PBS缓冲液pH7.4并储存在4°C下。[0981]用于测定PVRIG-抗体相互作用的ELISA:如下进行功能性ELISA:将食蟹猴、人类和食蟹猴人类混合PVRIGHis标记的）重组蛋白吸附到IA培养板上，在4°C下过夜。将涂布后的板孔用I3BS冲洗两次并且与300yL阻断缓冲液5%脱脂奶粉，于PBS中，pH7.4—起在室温RT下孵育1小时。去除阻断缓冲液并且再用PBS冲洗培养板两次。将板结合的PVRIG变异体与抗人类PVRIGmAb人类IgGl同种型一起在溶液线性范围0.lygmL到8ygmL，体积是50μΐν孔）中在室温下孵育1小时。将培养板用I3BS-TPBS7.4,0.05%吐温20洗涤三次，接着用PBS洗涤三次，并且添加50yL孔的HRP结合的第二抗体（人类IgGFc结构域特异性，JacksonImmunoResearch。将此在室温下孵育1小时并再次洗涤培养板。通过添加50yL的SureblueTMB底物KPL公司）并且孵育5-20分钟，在所有孔中产生ELISA信号。通过添加50μL2ΝH2S〇4VWR停止HRP反应并且在SpectraMax分子仪器公司）或EnVision拍金埃尔默）分光光度计上读取450nm下的吸光度信号。将数据导出到Excel微软）中并在GraphPadPrismGraphPad软件公司）中绘成图。[0982]结果[0983]S67、R95和197残基作为食蟹猴交叉反应性的决定子：图101中所示的结合数据清楚显示，S67、R95和197残基影响各种抗体的食蟹猴交叉反应性。虽然P67S食蟹猴到人类的突变不利地影响CPA.7.002和CPA.7.041的结合，但是L95RT97I食蟹猴到人类的突变显著改良了〇?4.7.002工?4.7.021工?六.7.028和0?八.7.041的结合。另一方面，册11?食蟹猴到人类的突变不影响任何所测试抗体的结合。[0984]与食蟹猴到人类变异体的相对结合表明了三个表位组:抗体与食蟹猴、人类和混合PVRIG变异体的相对结合表明了3个不同的表位组:第1组结合到R95I97残基CPA.7.021和CPA.7.028。第2组结合到S67和R95I97残基CPA.7.002和CPA.7.041。第3组不结合S67或R95I97残基CPA.7.024和CPA.7.050。表位组显示与这些抗体的食蟹猴交叉反应程度的强相关性图102。绘制ELISA信号随抗体浓度而变的图。[0985]总结和结论[0986]在PVRIGE⑶中基于食蟹猴到人类的变异的限定表位作图鉴定了S67、R95和197残基为抗人类PVRIG抗体的食蟹猴交叉反应性的决定子。CPA.7.021和CPA.7.028抗体与L95RT97IcynoPVRIG的结合完全恢复并且CPA.7.002与此突变体的结合改良有利地表明，R95和197残基是这些抗体的关键人类PVRIG表位。这些发现还表明了一种可能基于非人类灵长类PVRIG直系同源物的一级氨基酸序列来预测与所述直系同源物的交叉反应性的方式。

权利要求：1.一种活化患者的细胞毒性T细胞CTL的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体，其中所述患者的所述CTL的亚组被活化。2.—种活化患者的NK细胞的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体，其中所述患者的所述NK细胞的亚组被活化。3.—种活化患者的γδτ细胞的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体，其中所述患者的所述γδΤ细胞的亚组被活化。4.一种活化患者的Th1细胞的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体，其中所述患者的所述Th1细胞的亚组被活化。5.—种减少或消除患者体内的调节性T细胞Treg中的至少一种的细胞数量和或活性的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体。6.—种增加患者体内的干扰素-γ产生和或促炎性细胞因子分泌的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体。7.—种治疗患者的癌症的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体，其中所述癌症被治疗。8.—种抑制患者体内的PVRIG和PVLR2的相互作用的方法，包含向所述患者投予抗PVRIG抗体。9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述患者具有癌症。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症选自以下组成的组：前列腺癌、肝癌HCC、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌鳞状细胞癌和基底细胞癌）、神经胶质瘤、肾癌RCC、淋巴瘤NHL或HL、急性骨髓性白血病AML、T细胞急性成淋巴细胞性白血病T-ALL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤以及食道癌。11.根据权利要求189到10中任一项所述的方法，其中抗PVRIG抗体包含选自以下组成的组的抗体的vhCDRl、vhCDR2、vhCDR3、vlCDRl、vlCDR2以及V1CDR3序列：CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、〇卩八.7.040、0?厶.7.046、0?厶.7.047、0?厶.7.049以及0?厶.7.050。12.根据权利要求189到10中任一项所述的方法，其中所述抗PVRIG抗体包含选自以下组成的组的抗体的vhCDRI、vhCDR2、vhCDR3、VICDRI、VICDR2以及VICDR3序列：CHA·7·502、CHA·7·503、CHA·7·506、CHA·7·508、CHA·7·510、CHA·7·512、CHA·7·514、CHA·7·516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549以及CHA.7.550。13.根据权利要求189到10中任一项所述的方法，其中所述抗PVRIG抗体选自以下组成的组：CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA·7·019、CPA·7·021、CPA·7·022、CPA·7·023、CPA·7·024、CPA·7·033、CPA·7·034、〇卩八.7.036、0?厶.7.040、0?厶.7.046、0?厶.7.047、0?厶.7.049以及0?厶.7.050。14.一种诊断癌症的方法，包含：a使来自患者的组织与抗PVRIG抗体接触;并且b判定所述组织中PVRIG的过表达的存在作为癌症存在的指示。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组织是血液样品。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述组织是实体肿瘤的活检。17.根据权利要求14到16所述的方法，其中所述抗PVRIG抗体经过标记。18.根据权利要求17所述的方法，其中使结合到所述抗PVRIG抗体的第二标记抗体与所述样品接触。19.一种抗PVRIG抗原结合结构域，包含：a重链可变结构域，包含来自抗PVRIG抗体的vhCDRl、vhCDR2和vhCDR3;和b轻链可变结构域，包含来自所述抗PVRIG抗体的V1⑶RlV1⑶R2和V1⑶R3;其中所述抗PVRIG抗体选自以下组成的组：CPA.7.021、CPA.7.OOI、CPA.7.003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA·7·023、CPA·7·024、CPA·7·033、CPA·7·034、CPA·7·036、CPA·7·040、CPA·7·046、CPA·7·047、CPA·7·049、CPA·7·050、CHA·7·502、CHA·7·503、CHA·7·506、CHA·7·508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、〇^.7.546、〇^.7.547、〇^.7.548、：拟.7.549以及：拟.7.550。20.根据权利要求19所述的抗PVRIG抗原结合结构域，其中所述抗体是单链FvscFv，其中所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域通过scFv连接子共价连接。21.—种抗PVRIG抗体，包含：a重链可变结构域，包含来自抗PVRIG抗体的vhCDRl、vhCDR2和vhCDR3;和b轻链可变结构域，包含来自所述抗PVRIG抗体的V1⑶Rl、VICDR2和V1⑶R3;其中所述抗PVRIG抗体选自以下组成的组：CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA·7·023、CPA·7·024、CPA·7·033、CPA·7·034、CPA·7·036、CPA·7·040、CPA·7·046、CPA·7·047、CPA·7·049、CPA·7·050、CPA·7·021、CPA·7·001、CPA·7·003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA·7·013、CPA·7·014、CPA·7·015、CPA·7·017、CPA·7·018、CPA·7·019、CPA·7·022、CPA·7·023、CPA·7·024、CPA·7·033、CPA·7·034、CPA·7·036、CPA·7·040、CPA·7·046、CPA·7·047、CPA·7·049、CPA·7·050、CHA·7·502、CHA·7·503、CHA·7·506、CHA·7·508、CHA·7·510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、〇1^7.547、〇1^7.548、：拟.7.549以及：拟.7.550。22.—种抗PVRIG抗体，它与包含以下的抗体竞争结合：a重链可变结构域，包含来自抗PVRIG抗体的vhCDRl、vhCDR2和vhCDR3;和b轻链可变结构域，包含来自所述抗PVRIG抗体的V1⑶Rl、VICDR2和V1⑶R3;其中所述抗PVRIG抗体选自以下组成的组：CPA.7.021、CPA.7.OOI、CPA.7.003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA·7·023、CPA·7·024、CPA·7·033、CPA·7·034、CPA·7·036、CPA·7·040、CPA·7·046、CPA·7·047、CPA·7·049、CPA·7·050、CPA·7·021、CPA·7·001、CPA·7·003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA·7·013、CPA·7·014、CPA·7·015、CPA·7·017、CPA·7·018、CPA·7·019、CPA·7·022、CPA·7·023、CPA·7·024、CPA·7·033、CPA·7·034、CPA·7·036、CPA·7·040、CPA·7·046、CPA·7·047、CPA·7·049、CPA·7·050、CHA·7·502、CHA·7·503、CHA·7·506、CHA·7·508、CHA·7·510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、〇1^7.547、〇1^7.548、：拟.7.549以及：拟.7.550。23.—种组合物，包含选自以下组成的组的抗PVRIG抗体：CPA.7.001、CPA.7.003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049#CPA.7.050。24.—种组合物，包含选自以下组成的组的抗PVRIG抗体：h518-1、h518-2、h518-3、h518-4、h518-5、h524-l、h524-2、h524-3、h524-4、h530-l、h530-2、h530-3、h530-4、h530-5、h538·1-1、h538·l-2、h538·l-3、h538·l-4、h538·2-1、h538·2-2以及h538·2-3。25.—种核酸组合物，包含：a第一核酸，编码包含来自抗PVRIG抗体的vh⑶Rl、vhCDR2和vh⑶R3的重链可变结构域;和b第二核酸，编码包含来自所述抗PVRIG抗体的vlCDRlvlCDR2和vlCDR3、vhCDR3的轻链可变结构域；其中所述抗PVRIG抗体选自以下组成的组：CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA·7·004、CPA·7·006、CPA·7·008、CPA·7·009、CPA·7·010、CPA·7·011、CPA·7·012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA·7·023、CPA·7·024、CPA·7·033、CPA·7·034、CPA·7·036、CPA·7·040、CPA·7·046、CPA.7.047、CPA.7.049、CPA.7.050、CHA.7.518、CHA.7.524、CHA.7.530#CHA.7.538。26.—种表达载体组合物，包含：a第一表达载体，包含根据权利要求25所述的所述第一核酸;和b第二表达载体，包含根据权利要求25所述的所述第二核酸。27.—种表达载体组合物，包含:包含根据权利要求25所述的所述第一核酸和根据权利要求25所述的所述第二核酸的表达载体。28.—种宿主细胞，包含所述表达载体组合物，包含根据权利要求26或27所述的表达载体组合物。29.—种制造抗PVRIG抗体的方法，包含：a在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求28所述的宿主细胞;并且b回收所述抗体。30.—种活化患者的细胞毒性T细胞CTL的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24所述的抗体，其中所述患者的所述CTL的亚组被活化。31.—种活化患者的NK细胞的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24所述的抗体，其中所述患者的所述NK细胞的亚组被活化。32.—种活化患者的γδΤ细胞的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24所述的抗体，其中所述患者的所述γδτ细胞的亚组被活化。33.—种活化患者的Thl细胞的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24所述的抗体，其中所述患者的所述Th1细胞的亚组被活化。34.—种减少或消除患者体内的调节性T细胞Treg中的至少一种的细胞数量和或活性的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24所述的抗体。35.—种增加患者体内的干扰素-γ产生和或促炎性细胞因子分泌的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24所述的抗体。36.—种抑制患者体内的PVRIG和PVLR2的相互作用的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24所述的抗体。37.—种治疗患者的癌症的方法，包含向所述患者投予根据权利要求19到24中任一项所述的抗体。

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