申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2022-04-26

公开（公告）日：2023-09-01

公开（公告）号：CN114778852B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/569;G01N33/58;G01N33/543;C12N15/70;C12N15/57;C12N9/50

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.09.01#授权;2022.08.09#实质审查的生效;2022.07.22#公开

摘要：本发明公开了一种检测PRRSVPLP2抗体的间接ELISA方法，该方法针对PRRSVJXwn06PLP246～323基因序列设计特异性引物，构建原核表达质粒pET28a+‑PLP2‑StrepⅡ，在E.coliBL21中实现了高效可溶性表达。经过亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化，获得了高纯度PLP2重组蛋白，将其作为包被抗原，建立了检测PRRSVPLP2抗体的间接ELISA方法。本发明发现PLP2可作为一种新的PRRSV诊断抗原，应用其建立的抗体检测方法重复性和特异性好，能够在PRRSV感染仔猪后第3～5天检测到PLP2抗体，可用于PRRS抗体检测和早期诊断。

主权项：1.一种非诊断目的检测PRRSVPLP2抗体的间接ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：S0：构建PRRSVPLP2重组表达质粒，制备PRRSVPLP2重组蛋白；步骤S0包括以下步骤：S0-1：准备材料；S0-2：设计扩增目的基因的PCR引物，以GenBank:EF641008登录的PRRSVJXwn06毒株为模式病原，以pET28a+为载体，在PLP2羧基端融合StrepⅡ标签蛋白，设计引物并扩增46~323aaPLP2目的基因序列SEQIDNO.1，设计得到PCR引物，46~323aaPLP2的上游引物：SEQIDNO.2；46~323aaPLP2的下游引物：SEQIDNO.3；S0-3：PRRSVPLP2蛋白编码基因的扩增，以PRRSVJXwn06感染性cDNA克隆为模板，利用步骤S0-2得到的PCR引物，PCR扩增获得PLP2目的基因片段；S0-4：将步骤S0-3得到的PCR扩增PLP2目的基因片段进行凝胶回收，得到纯化的PLP2目的基因；S0-5：构建pET28a+-PLP2-StrepⅡ重组表达质粒，使用限制性内切酶NcoⅠ、BamHI对pET28a+载体进行双酶切，得到酶切产物线性化pET28a+载体，将步骤S0-4得到的PLP2-StrepⅡDNA片段与线性化pET28a+载体连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，得到pET28a+-PLP2-StrepⅡ重组表达质粒；S0-6：获取PRRSVPLP2重组蛋白，将步骤S0-5得到的pET28a+-PLP2-StrepⅡ重组表达质粒转化E.coliBL21感受态细胞，使用LB培养基进行培养和IPTG诱导表达，得到PRRSVPLP2重组蛋白；S0-7：SDS-PAGE鉴定PRRSVPLP2重组蛋白的表达形式，鉴定出PRRSVPLP2重组蛋白为原核可溶性表达，利用HiCapStreptactin亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化，获得纯化的PLP2重组蛋白；S1：包被PRRSVPLP2重组蛋白，利用包被液将PRRSVPLP2重组蛋白稀释，加入酶标板中，4℃包被过夜，其中包被液将PRRSVPLP2重组蛋白稀释为0.4µgml；S2：洗涤，甩干酶标板中的包被液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；S3：封闭，将浓度为2%BSA封闭液加入酶标板中，4℃封闭10~12h；S4：洗涤，甩干酶标板中的封闭液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；S5：血清孵育，将猪血清样本用稀释液按1:50稀释，加入酶标板中，37℃孵育30min；S6：洗涤，甩干酶标板中的血清，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；S7：酶标二抗孵育，将兔抗猪IgG-HRP抗体用稀释液按1:5000稀释，加入酶标板中，37℃避光孵育30min；S8：洗涤，甩干酶标板中的酶标二抗，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；S9：酶标板中加入TMB底物液，室温避光15min显色；S10：终止反应，酶标板中加入50μL浓度为2molL的H2SO4终止反应；S11：读取吸光值，判定检验结果为阴性或阳性，使用酶标仪读取酶标板各孔OD450nm，当血清样本OD450nm≥0.27，判定为阳性，反之血清样本OD450nm＜0.27，判定为阴性；所述封闭液BSA的溶剂为0.3%PBST溶液；所述包被液为碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为0.1%PBST溶液；所述血清和所述酶标二抗的稀释液为含0.3%PBST的1%BSA溶液。

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