申请/专利权人：中国科学院生态环境研究中心

申请日：2022-09-05

公开（公告）日：2023-11-03

公开（公告）号：CN116987799A

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/01

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.11.21#实质审查的生效;2023.11.03#公开

摘要：本发明公开了一种识别环境水体样品中MIB产嗅藻种类的方法，本发明方法将水体中的细胞与丙烯酰胺反应，制成单细胞凝珠；接着进行细胞溶解处理后，再依次进行融合PCR、BlockPCR、巢式PCR反应，并对巢式PCR反应产物进行基因测序，将测序结果与NCBI数据库进行比对，获知水体中携带产MIB的mic基因的藻类的种类。本发明方法通过对mic基因及16SrRNA基因引物的选择及扩增条件的优化，建立针对MIB产嗅藻的单细胞融合PCR方法，本发明方法可以在未培养的单细胞中实现mic功能基因与系统发育基因的连接，并且通量高，成本低，能精准识别环境样品中全部产嗅藻，且可特异性地识别环境样品中产嗅藻。

主权项：1.一种识别环境水体中MIB产嗅藻种类的方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：A、将环境水体水样、丙烯酰胺溶液和过硫酸铵溶液混合均匀后加入STT乳化油；接着再加入四甲基乙二胺，混合均匀，静置，丙烯酰胺进行聚合反应，生成聚丙烯酰胺，制成包裹水体中藻类细胞的聚丙烯酰胺-细胞凝珠混合液；B、对聚丙烯酰胺-细胞凝珠混合液进行纯化处理，获得聚丙烯酰胺-细胞凝珠；然后向聚丙烯酰胺-细胞凝珠加入TK缓冲液，进行重悬，并采用细胞过滤器进行过滤，制得纯化聚丙烯酰胺-细胞凝珠TK悬液；C、向纯化聚丙烯酰胺-细胞凝珠TK悬液中添加溶菌酶，溶解藻类细胞细胞壁；接着加入蛋白酶K和TritonX-100，酶解去除与核酸结合的组蛋白，使藻类细胞DNA游离，以及破坏藻类细胞细胞膜，使得藻类细胞基因组暴露在聚丙烯酰胺凝珠壳内，获得细胞溶解聚丙烯酰胺-细胞凝珠；D、以细胞溶解聚丙烯酰胺-细胞凝珠为模板进行融合PCR反应，并进行清洗处理，制得融合PCR纯化DNA；E、以融合PCR纯化DNA为模板进行BlockPCR反应，并进行清洗处理，获得BlockPCR纯化DNA；F、以BlockPCR纯化DNA为模板进行巢式PCR反应，获得巢式PCR扩增产物；G、对巢式PCR扩增产物进行基因测序，产物中融合PCR的搭桥引物和巢式反向引物之间的扩增片段为目标16SrRNA基因，即携带mic基因的蓝藻物种信息，将扩增获得的16SrRNA基因与NCBI数据库的基因组序列进行比对，获知携带产MIB的mic基因的藻类，即识别出环境水体中产MIB的蓝藻种类。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国科学院生态环境研究中心 一种识别环境水体中MIB产嗅藻种类的方法

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