申请/专利权人：广西科学院;广西大学

申请日：2022-03-31

公开（公告）日：2023-12-22

公开（公告）号：CN114574623B

主分类号：C12Q1/6895

分类号：C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/89

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.12.22#授权;2022.06.21#实质审查的生效;2022.06.03#公开

摘要：本发明公开了一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法，包括引物和探针的设计与合成，样品基因DNA提取，采用引物和探针配置荧光定量PCR定量体系以及构建定量标准曲线，并进行荧光定量PCR检测。将提取的核酸溶液所测得的Ct值带入定量标曲方程式，即可对单细胞球形棕囊藻定量。本发明提供定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法，最低定量限可达到32个单细胞，并且定量分析了实际环境样本中较低丰度的单细胞球形棕囊藻，能准确实现球形棕囊藻赤潮暴发早期低丰度的单细胞棕囊藻定量分析。

主权项：1.一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：1引物和探针的设计与合成：在球形棕囊藻核糖体基因5.8S-ITS2区域的保守区域设计与合成引物和探针，设计与合成引物序列为：上游引物序列PGf2：5’-ATGGCATTTCCAAGTTTCGC-3’，退火温度58.6℃；下游引物序列PGr2：5’-GCACTCCCCAGCTTCAGC-3’，退火温度58.1℃；TaqMan探针的序列PGp2：5’-FAM-TTCCCACCCCACCTC-NFQ-MGB-3’，退火温度68℃；2样品基因DNA提取：采用天根植物基因组DNA提取试剂盒进行提取，提取出样品基因的核酸溶液；3采用步骤1中的引物和探针配置荧光定量PCR定量体系，并进行荧光定量PCR检测；4采用步骤2提取的实际环境样本的核酸溶液与球形棕囊藻阳性对照样品的荧光定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序比对分析，以确定方法的特异性以及对实际环境样本中单细胞球形棕囊藻定量的可行性；5单细胞球形棕囊藻定量：取待测样品通过流式细胞仪准确计数，之后按步骤2提取核酸溶液，稀释后按步骤3对各数量级的样品进行定量体系的配置和上机检测，其中扩增曲线的阈值设定在扩增曲线的指数期，所设置的阈值＝0.105，阈值与扩增曲线相交时的值为Ct值，根据各个数量级的细胞和其所测得的Ct值之间的关系建立标准曲线，得到定量方程式，以此方程式计算出球形棕囊藻单细胞的数量；在步骤4中，步骤2中的核酸溶液与阳性对照样品的荧光定量PCR产物片段大小与所设计引物与探针时的预计产物片段大小一致；进行二代测序后通过比对和构建进化树分析，可确定特异性扩增信号的生物就是球形棕囊藻；在步骤5中，单细胞球形棕囊藻的定量方程式为：Y＝-3.305x+34.07，线性关系R2＝0.999。

全文数据：

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