申请/专利权人：西北农林科技大学

申请日：2020-09-30

公开（公告）日：2023-12-22

公开（公告）号：CN112285347B

主分类号：G01N33/569

分类号：G01N33/569;G01N27/62;C07K14/08

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.12.22#授权;2021.02.23#实质审查的生效;2021.01.29#公开

摘要：本发明涉及一种通过使用特异性抗体捕获猪源抗原加工提呈细胞APCs上负责加工提呈抗原的猪白细胞抗原II类DR分子（SLA‑DR），将SLA‑DR上提呈的抗原肽以三氟乙酸洗脱后，脱盐处理重悬后进行质谱分析以测定抗原肽氨基酸序列，鉴定出猪特定病原所有编码的蛋白中可被机体抗原提呈细胞所加工提呈的抗原肽序列，并通过基因工程的方法将以上方法获得的CD4+T表位抗原肽分别与NanoLuc荧光素酶融合后使用大肠杆菌进行体外重组表达并纯化，作为一种人工抗原与相应病原感染的猪血清样本进行ELISA检测，以寻找可被病原感染的猪血清样本识别的CD4+T表位抗原肽序列，进一步将所有抗体ELISA检测为阳性的抗原肽序列串联后在大肠杆菌中进行重组表达，作为人工抗原用于给定病原的特异性抗体检测。

主权项：1.一种猪血清样中病原抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括猪病原特异性抗原肽，所述猪病原特异性抗原肽是利用猪源APCs在猪种属上对病原或外源性蛋白进行CD4+T表位特异性抗原肽筛选鉴定的方法得到，所述方法包括如下步骤：步骤一，猪源APCs细胞的制备：使用4-6周龄仔猪腿骨，从中段使用无菌锯条锯断后，在断骨的另一端钻孔，使用含有EDTA的无血清RPMI1640培养基冲洗骨髓腔，以获得猪骨髓细胞悬液；将获得的猪骨髓细胞悬液以300g离心力离心10分钟后弃去上清，加入红细胞裂解液在37℃培养20分钟以充分裂解红细胞，再加入2倍体积的PBS以终止反应，再次以300g离心10分钟以获得纯化的骨髓细胞；将骨髓细胞进行计数，以1×107个骨髓细胞置于10mL含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，按照40ng每毫升的浓度加入猪粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子GM-CSF进行培养，每间隔2天更换一次培养液，连续培养7天后，收集悬浮细胞，即为作为猪源APCs的骨髓树突状细胞；步骤二，抗原肽的质谱鉴定：（1）制备富集“SLA-DR-抗原肽”复合物：使用病毒与APCs共培养，使得APCs被病毒感染，再使用细胞裂解缓冲液裂解APCs制备细胞裂解液，使用识别SLA-DR的抗体从全细胞裂解液中富集“SLA-DR-抗原肽”复合物；（2）获得抗原肽氨基酸序列：将富集“SLA-DR-抗原肽”复合物使用三氟乙酸缓冲液处理，从SLA-DR上分离洗脱抗原肽，再使用截留分子量为5kD的超滤管，去除残留抗体及SLA-DR分子单体，使滤过液中仅含有抗原肽，再通过脱盐处理后，即得到所述抗原肽氨基酸片段；（3）使用质谱仪测定抗原肽的分子量，并通过质谱分析软件搜索病原来源蛋白氨基酸数据库的方式以确定抗原肽氨基酸序列；步骤三，基于NanoLuc融合蛋白的抗原肽的ELISA验证。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体ELISA检测试剂盒

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD