申请/专利权人：浙江理工大学;浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司

申请日：2021-12-29

公开（公告）日：2023-12-29

公开（公告）号：CN115287299B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/66;C12N15/24;C12N15/19;C12N15/62;C12N7/01;A61K35/768;A61K38/20;A61K38/19;A61P35/00;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.12.29#授权;2022.11.22#实质审查的生效;2022.11.04#公开

摘要：本发明公开的是本发明提供了一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用，首先在分子水平以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将IL‑7基因、CCL19基因和IL‑7‑F2A‑CCL19基因连接到载体质粒上，然后将重组质粒与野生痘苗病毒在293A细胞内同源重组转染得到表达IL‑7和CCL19的重组溶瘤痘苗病毒药物，在细胞水平上增强了痘苗病毒对肿瘤细胞的杀伤作用，IL‑7和CCL19的表达一定程度上引起了细胞水平一些炎症因子的表达升高，在细胞水平显示出对抗肿瘤免疫的诱导作用。

主权项：1.一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1）构建TK区缺失的pCB质粒；2）以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将目的基因连接到载体质粒上以构建pCB-IL-7质粒、pCB-CCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒；目的基因包括IL-7基因、CCL19基因和IL-7-F2A-CCL19基因；3）通过脂质体转染，将步骤2）所得的pCB-IL-7质粒、pCB-CCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒分别转至293A细胞，获得3种重组溶瘤痘苗病毒；具体的:1）首先应用高保真PCR方法扩增IL-7基因片段、CCL19基因片段和IL-7-F2A-CCL19基因片段；2）然后将3种基因片段通过限制酶酶切和连接酶连接的方法连接到pCB载体质粒中，得到pCB-hIL-7质粒、pCB-hCCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒；3）将3种重组质粒和野生病毒通过脂质体转染的方法在293A细胞内同源重组包装病毒；4）步骤3）所属野生病毒为经过改造TK缺失的WR株；5）包装后经过药物筛选；6）挑空斑筛选，药筛后的病毒梯度稀释后铺低熔点胶，出现病毒空板后挑取空板提基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因，鉴定正确后扩增病毒，获得3种重组溶瘤痘苗病毒，分别未溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19；利用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切IL-7和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-IL-7重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-CCL19重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切IL-7-F2A-CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-IL-7-F2A-CCL19重组质粒；IL-7的引物如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示；CCL19引物如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示；IL-7-F2A-CCL19引物如SEQIDNO.1或SEQIDNO.4所示，IL-7基因序列如SEQIDNO.5所示；CCL19基因序列如SEQIDNO.6所示；IL-7-F2A-CCL19基因序列如SEQIDNO.7所示；步骤5）中药物筛选为：用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基筛选重组病毒，将构建得到的溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19感染293A细胞2小时后，用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基培养，收集细胞，-80℃和37℃反复冻融3次，1000rpm离心5mins，此过程重复至少3次；鉴定为：对3种重组溶瘤痘苗病毒进行qPCR、westernblot和Elisa检测，检测痘苗病毒感染肿瘤细胞是否表达IL-7基因和CCL19基因；具体鉴定方法为：提取病毒液病毒基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因IL-7、CCL19和IL-7-F2A-CCL19，选择鉴定正确的病毒液作为种子病毒；还包括重组溶瘤痘苗病毒的扩增、纯化和保存步骤：利用BSC40细胞扩增重组溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19；利用蔗糖梯度离心方法纯化重组溶瘤痘苗病毒；利用TCID50法测定重组溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19的滴度，最后分装纯化病毒，保存于-80℃冰箱。

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