申请/专利权人：上海赛伦生物技术股份有限公司

申请日：2021-08-20

公开（公告）日：2024-01-26

公开（公告）号：CN113637072B

主分类号：C07K16/18

分类号：C07K16/18;G01N33/68;G01N33/558

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.01.26#授权;2021.11.30#实质审查的生效;2021.11.12#公开

摘要：本发明公开了一种抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法及其应用，所述抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：1抗原制备：提取银环蛇毒素，将银环蛇毒素进行灭活得到银环蛇毒素抗原；2免疫马匹：将步骤一制得的所述银环蛇毒素抗原免疫马匹，收集所述马匹的血清；3抗体提取：从步骤2的血清中提取马IgG，经眼镜蛇毒素吸附，得到抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体。本发明制备了抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体，在此基础上研制了银环蛇毒素免疫层析检测试纸条，具有操作简单、不需要复杂仪器、灵敏度高和特异性好等优点，从而有效解决了银环蛇毒素的现场快速检测难题。

主权项：1.一种银环蛇毒免疫层析素检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括银环蛇毒素免疫层析检测试纸条的组装步骤，具体为：所述试纸条由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，金标垫为吸附胶体金标记抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体溶液的玻璃纤维，检测膜为印迹银环蛇毒检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜，检测线T为抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体印迹，质控线C为羊抗马IgG二抗印迹；所述胶体金标记抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体溶液的制备方法为：将0.01%氯金酸水溶液加热煮沸，搅动下加入1%柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，加入终浓度为30µgmL抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体，搅拌，加入10%BSA，搅拌，再加入10%PEG2000，搅拌后5000rpm离心，取上清，将上清在15000rpm离心取沉淀，将沉淀保存于0.3%四硼酸钠溶液中，得到所述胶体金标记抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体溶液；所述抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法为：步骤1：取雌雄各半健康的成年银环蛇，采集蛇毒，立即置冰水浴，新鲜毒液低温2000g离心15分钟去除杂质，用孔径0.22微米的除菌过滤膜进行除菌过滤；步骤2：过滤后的蛇毒用Tris缓冲液调50mgmL浓度，将蛇毒溶液与等体积碘乙酰胺溶液混合，充分搅拌混匀，置35℃避光孵育5小时；反应完成后，超滤去除残留的碘乙酰胺，得到灭活银环蛇毒素抗原；步骤3：取灭活银环蛇毒素抗原调0.5mgmL浓度，与等体积羊毛脂石蜡油佐剂充分混匀，每只马皮下注射10mL，免疫马匹；每隔14天重复注射同剂量用等量弗氏非完全佐剂混匀的灭活银环蛇毒素抗原，共注射4次；步骤4：对步骤3中免疫后的马匹，每匹马采血5升，分离马血清，用50％饱和度硫酸铵去除血清中白蛋白，用33％饱和度硫酸铵沉淀IgG，将沉淀复溶后透析除盐获得部分纯化的马IgG，用PBS调整浓度为20mgmL；每10mL粗纯马IgG，同时加入100mg甲醛灭活的大肠杆菌菌体和100mg与CNBr激活琼脂糖偶联的眼镜蛇毒素，4℃颠倒混匀16小时以上，2000g低温离心10分钟收集上清，利用蛋白A亲和层析柱纯化马IgG，获得抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体；所述Tris缓冲液为100mMTris，100mMNaCl，pH8.0；所述碘乙酰胺溶液为200mM碘乙酰胺，100mMTris，100mMNaCl，pH8.0。

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