申请/专利权人：南京工业大学

申请日：2022-01-25

公开（公告）日：2024-02-13

公开（公告）号：CN114395573B

主分类号：C12N15/60

分类号：C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/44;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.13#授权;2022.10.28#实质审查的生效;2022.04.26#公开

摘要：本发明公开了一种利用反乌头酸脱羧酶提高全细胞催化产衣康酸产量的方法，由擎科生物将玉米黑粉菌来源的反乌头酸脱羧酶（TcadA），优化合成，得到pETduet‑TcadA，与重组质粒pCDFduet‑acn‑cadA共转入大肠杆菌进行异源表达，采用全细胞催化法生产衣康酸，与出发菌株（pCDFduet‑acn‑cadA）相比，有效提高了衣康酸的产量。本发明生产衣康酸使用了全细胞催化法，与常规发酵相比，可以降低生产成本，缩短生产时间。此外，底物易于获得，生物转化产生的副产品较少，便于提纯，有效克服传统合成方法的产物复杂的缺点，并在工业生产中具有广泛的应用前景。

主权项：1.一种利用反乌头酸脱羧酶提高全细胞催化产衣康酸产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建出发菌株pCDFduet-acn-cadA来源于谷氨酸棒杆菌的顺乌头酸酶，根据已报导的黑曲霉来源的顺乌头酸脱羧酶氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，克隆到载体pCDF-duet1上，获得重组质粒pCDFduet-acn-cadA，将构建好的重组质粒pCDFduet-acn-cadA转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到出发菌株pCDFduet-acn-cadA，其中，顺乌头酸酶的氨基酸序列如SEQNO.1所示，顺乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQNO.2所示；步骤2，构建重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA根据已报导的玉米黑粉菌来源的反乌头酸脱羧酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，克隆到载体pET-duet上，获得重组质粒pETduet-TcadA，将构建好的重组质粒pCDFduet-acn-cadA和pETduet-TcadA共转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA，其中，反乌头酸脱羧酶TcadA的氨基酸序列进行密码子优化后的序列如SEQNO.3所示；步骤3，培养出发菌株pCDFduet-acn-cadA挑取出发菌株pCDFduet-acn-cadA的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6-0.7，再加入0.25mM-1mM的IPTG，18-30℃培养16-24小时，离心收集出发菌株pCDFduet-acn-cadA；步骤4，培养重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA挑取重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6-0.7，再加入0.25mM-1mM的IPTG，18-30℃培养16-24小时，离心收集重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA；步骤5，收集出发菌株pCDFduet-acn-cadA，4000-6000rpm，4℃，离心10-15min，除去上清，菌体用pH6-11的PBS缓冲液重悬，4000-6000rpm，4℃，离心10-15min，获得出发菌株pCDFduet-acn-cadA，用分光光度计测定菌体浓度；步骤6，收集重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA，4000-6000rpm，4℃，离心10-15min，除去上清，菌体用pH6-11的PBS缓冲液重悬，4000-6000rpm，4℃，离心10-15min，获得重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA，用分光光度计测定菌体浓度；步骤7，选取柠檬酸作为底物，Tween80为表面活性剂，分别加入出发菌株pCDFduet-acn-cadA和重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA，再添加PBS缓冲溶液，调节反应体系的pH至5.5,最后35℃反应24h，其中，柠檬酸的终浓度为10-300mmolL、Tween80的终浓度为0.1%-1%，出发菌株pCDFduet-acn-cadA与重组菌株pCDFduet-acn-cadApETduet-TcadA的终浓度均为OD60010-30；步骤8，完成催化反应，加入等体积比1mmolL稀盐酸，12000rpm离心3min，采用1ml注射器吸取离心得到的上清液，并用0.22μm滤膜除去杂质，将去除杂质的反应液注入1.5ml液相小瓶中，检测产物生成情况。

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