申请/专利权人：复旦大学附属华山医院

申请日：2018-09-04

公开（公告）日：2024-03-08

公开（公告）号：CN109402254B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12N15/113

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.08#授权;2021.07.06#实质审查的生效;2019.03.01#公开

摘要：本发明属于生物医药领域,涉及一种预测胰腺癌患者不良预后风险的LncRNA模型及检测试剂盒。该模型包括样品采集、RNA提取、LncRNA测定和LncRNA表达量加权计算四部分；所述的LncRNA是筛选获得的、胰腺癌预后相关的17个LncRNA。本发明通过检测患者LncRNA表达水平，可应用于临床判断胰腺癌患者预后。本发明的17个LncRNA可以作为标志物预测胰腺癌患者术后生存，并提供了相应的试剂盒，通过检测试剂盒对胰腺癌病人术后的组织LncRNA水平进行检测，判断胰腺癌患者预后，具有高通量、高敏感性等优点。

主权项：1.一种胰腺癌标志物，其特征在于，所述的胰腺癌标志物由表1所示的LncRNA组成，

全文数据：一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒技术领域本发明属于生物医药领域,涉及一种长链非编码RNALncRNA模型及检测试剂盒，及其在预测胰腺癌病人不良预后风险方面的应用。背景技术根据最新流行病学调查，全球每年约250万人死于胰腺癌，死亡率位居恶性肿瘤第四位。近20年来我国胰腺癌的发病率持续增高，其死亡率位居恶性肿瘤第五位。在胰腺癌的治疗中，外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人意，其术后1年生存率不到20％，5年生存率仅为4％-7％。胰腺癌已经成为早期诊断最难、恶性程度最高、生存预后最差的肿瘤之一，是目前全世界肿瘤学研究的热点。胰腺癌发现时大部分已处于晚期，病死率高，其主要原因胰腺癌早期即有局部淋巴结或远处转移，85％的患者确诊时已失去手术根治的机会。目前其治疗策略制定和预后判断主要依赖TNM分期，然而其并不能精准反映患者所处的实际阶段和预后。临床上尚无高灵敏性、高特异性的分子诊断方法精准判断胰腺癌的预后。目前，公认LncRNA是一类序列长度大于200nt的非编码RNA；已有研究证实LncRNA在基因调控及各种细胞功能中起着重要的作用；而LncRNA在胰腺癌中的作用也被广泛关注。有研究表明，LncRNA通过对目标基因表达的调控，影响胰腺癌的恶性进程。近年来，越来越多的研究证实了LncRNA作为生物标记物预测肿瘤患者预后的可行性。基于现有技术的现状和基础，本申请的发明人拟提供一种预测胰腺癌患者预后的LncRNA模型及检测试剂盒，用于检测胰腺癌患者不良预后的分子标记物。发明内容本发明的目的是基于现有技术的现状和基础，提供一种预测胰腺癌患者预后的LncRNA模型及检测试剂盒，用于检测一种能在胰腺癌组织中检测的、有较高预测准确度的、胰腺癌患者不良预后的分子标记物。本发明的另一个目的是提供上述模型的应用，对术后胰腺癌患者不良预后风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，改善患者预后。本发明提供了一种检测胰腺癌预后相关LncRNA的模型包括样品采集RNA提取LncRNA测定和LncRNA表达量加权计算四部分；所述的LncRNA是筛选获得的、胰腺癌相关的17个LncRNA。所述的筛选是对胰腺癌癌组织进行RNA测序，并与和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，进而获得胰腺癌相关的17个LncRNA。所述的17个胰腺癌相关LncRNA如下表所示：LncRNA名ENSG00000272750.1ENSG00000235078.1ENSG00000270562.1ENSG00000250413.1ENSG00000249700.7ENSG00000260070.1ENSG00000232445.1ENSG00000244198.4ENSG00000271966.1ENSG00000176236.6ENSG00000279029.1ENSG00000257534.1ENSG00000257303.1ENSG00000269906.1ENSG00000276250.1ENSG00000267015.1ENSG00000271784.1表1相关序列参见http:www.gencodegenes.org网站。本发明提供了一种胰腺癌标志物，所述的胰腺癌标志物包括表1所述的LncRNA。本发明还提供一种预测胰腺癌患者预后的LncRNA模型，所述的模型包括表2所述的LncRNA的表达权重。LncRNA名权重系数BENSG00000272750.1-0.007894547ENSG00000235078.1-0.198597798ENSG00000270562.1-0.018438516ENSG00000250413.1-0.021035564ENSG00000249700.7-0.041273129ENSG00000260070.1-0.015183685ENSG00000232445.10.016172084ENSG00000244198.4-0.084552592ENSG00000271966.1-0.022991908ENSG00000176236.6-0.121026448ENSG00000279029.10.02416932ENSG00000257534.1-0.014257028ENSG00000257303.1-0.05251776ENSG00000269906.10.007557004ENSG00000276250.1-0.283657215ENSG00000267015.10.117787771ENSG00000271784.1-0.268003602表2本发明还提供了一种检测试剂盒，其中包括表3所述LncRNA的特异性引物。所述的试剂盒中还包括抽提和或鉴定RNA的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成，说明书，等等。所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成。所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。表3本发明的模型的构建方法依次包括提取样本的RNA、RNA测序并筛选胰腺癌相关的LncRNA等几个方面。该构建方法包括以下步骤：1提取并纯化胰腺癌组织的RNA样本；2对胰腺癌癌组织进行RNA测序，组成训练集，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，筛选其中与患者生存相关的17个LncRNA；3计算上述17个LncRNA的表达权重，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数，根据其中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。本发明所述模型的构建方法还可以包括RNA质量控制：用光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量。在本发明的一个实施例中，采用NanoDrop2000作为光谱仪。可以对本发明所述的LncRNA模型进行验证：获取独立的另一组胰腺癌患者癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，进行RNA测序；依据表达水平对每个LncRNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值；判断每位患者的患者生存时间；通过COX多因素比例风险回归模型对LncRNA模型的预测效能进行评价。本发明提供了相应的试剂盒及引物，通过实时定量PCR检测试剂盒技术对胰腺癌病人术后的组织LncRNA水平的检测，具有高通量、高敏感性和高均一性等特征。该方法简便、快速且经济实用。更具体的，本发明所述的LncRNA模型构建与验证方法的步骤为:1收集胰腺癌患者的手术切除癌组织标本；2提取和纯化胰腺癌组织的RNA样本；3RNA质量控制：用NanoDrop2000光谱仪定量NanoDropTechnologies,Waltham,MA检测提取的总RNA的浓度及质量；4对胰腺癌癌组织进行RNA测序，组成训练集，和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，进而筛选出与疾病生存相关的LncRNA，所述的17个胰腺癌相关LncRNA如下表所示：LncRNA名ENSG00000272750.1ENSG00000235078.1ENSG00000270562.1ENSG00000250413.1ENSG00000249700.7ENSG00000260070.1ENSG00000232445.1ENSG00000244198.4ENSG00000271966.1ENSG00000176236.6ENSG00000279029.1ENSG00000257534.1ENSG00000257303.1ENSG00000269906.1ENSG00000276250.1ENSG00000267015.1ENSG00000271784.1表15计算上述17个LncRNA的表达权重如表2所示，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数RiskScoreRS：其指数的计算公式如下：RS＝B1*X1+…+B17*X17，其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数如表2所示；根据计算得出的RS值及其中位数，将患者划分为高危和低危，进而判断患者不良预后风险大小，同时通过COX多因素比例风险回归模型对所构建LncRNA模型的预测效能进行评价；6将上述所得的LncRNA模型及计算公式，在另外的胰腺癌患者组成独立的验证集中进行验证：经过组织RNA抽提并质检后，利用RNA测序检测如表1所示LncRNA的表达量，依据表达水平对每个LncRNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值及其中位数；依此判断每位患者的不良预后，通过COX多因素比例风险回归模型对LncRNA模型的预测效能进行评价。本发明的模型，可以通过COX比例风险回归模型，计算每个患者生存的风险指数，根据计算得出的值和中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。所述的风险指数的计算公式是RS＝B1*X1+…+B17*X17；其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数。LncRNA名权重系数BENSG00000272750.1-0.007894547ENSG00000235078.1-0.198597798ENSG00000270562.1-0.018438516ENSG00000250413.1-0.021035564ENSG00000249700.7-0.041273129ENSG00000260070.1-0.015183685ENSG00000232445.10.016172084ENSG00000244198.4-0.084552592ENSG00000271966.1-0.022991908ENSG00000176236.6-0.121026448ENSG00000279029.10.02416932ENSG00000257534.1-0.014257028ENSG00000257303.1-0.05251776ENSG00000269906.10.007557004ENSG00000276250.1-0.283657215ENSG00000267015.10.117787771ENSG00000271784.1-0.268003602表2本发明还包括所述模型在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用，其中包括检测表1所列LncRNA的特异性引物表3。所述的试剂盒中还包括抽提和或鉴定RNA的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成，说明书，等等。所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成。所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。表3本发明经过严格细致的研究，构建了一种预测胰腺癌患者预后LncRNA模型；在预测96个月的病人生存中，所述LncRNA均呈现出较好预测效能。本发明所述模型能够为患者肿瘤治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。临床治疗中，在胰腺癌患者诊断明确后，即可通过对上述LncRNA的检测，快速判断患者不良预后风险，并根据结果选择合适的治疗方案，实现个体化治疗。附图说明图1是本发明实施例中训练组和验证组中LncRNA模型对于预测胰腺癌患者不良预后的预测分析结果图，结果显示高风险组生存比低风险组显著差。具体实施方式以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下面结合实施案例来具体说明本发明。实施例1LncRNA模型的构建和分析一、研究对象：本实施案例的研究对象分别为:胰腺癌组织106例，构成训练集；胰腺癌组织71例，构成验证集,纳入及排除标准为：1病理确诊为胰腺癌，导管腺癌；2确诊时无其他肿瘤病史；3排除其他导管原位癌。二、实验方法1收集胰腺癌患者的手术切除癌组织标本2胰腺癌组织总RNA的抽提和纯化将患者切除的胰腺癌旁组织与TRIzol试剂按比例75毫克：1mL混合，用匀浆器匀浆；将匀浆液在室温下孵育5分钟，按1：0.2的体积比加入氯仿，盖严，用手摇晃15秒钟，室温下孵育2.5分钟；于12000×g、4℃条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，取上层水相，按照每1mLTRIzol试剂加入0.5mL的比例加入异丙醇，混匀，20℃下静置10分钟，于12000×g、4℃条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照每1mLTRIzol试剂加入1mL的比例加入75％乙醇，振荡混匀；于7500×g、4℃条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀10分钟；用DEPCDEPCdiethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯处理过的水重新溶解RNA；用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度及A260A280的比值，当A260A280的比值为1.9-2.1时，进入下一步。3RNA质量检测将10×MOPS3-N-吗啡啉丙磺酸RNA变性缓冲液l0mL、0.1％DEPC焦碳酸二乙酯处理过的水70mL、37％甲醛20mL与RNA琼脂糖1.0g混合制备甲醛变性琼脂糖凝胶；用DEPC处理过的水将10×MOPS缓冲液稀释成1×MOPS缓冲液配制电泳缓冲液；将步骤2.1中得到的RNA样品5.5μL、10×MOPS缓冲液1.0μL、37％甲醛3.5μL以及去离子甲酰胺10.0μL混合，配成电泳样品，65℃孵育5分钟，冰上冷却；将电泳槽内注入电泳缓冲液，置入甲醛变性琼脂糖凝胶；电泳样品内加入2μL10×RNA加样缓冲液以及0.1μLEB溴化乙锭，混合均匀后加入上样孔内，电压100V条件下电泳30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照；当检验证实RNA没有降解时，进一步进行研究。4将106例胰腺癌组织组成训练集，按照操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的RNA样本进行全转录组测序。以测序内部参考基因表达为参照对结果进行标化处理。LncRNA表达水平和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归分析，计算每个LncRNA与患者生存的关系，进而筛选出与胰腺癌预后相关的LncRNA表1。5计算上述17个LncRNA的表达权重，训练集106例胰腺癌组织筛选出的LncRNA表达权重如表2所示。通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数RiskScoreRS：其指数的计算公式如下：RS＝B1*X1+…+B17*X17，其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数；根据计算得出的RS值和中位数，将患者划分为高危和低危，进而判断患者不良预后风险大小。运用该预测模型对训练组106例胰腺癌患者进行不良预后预测分析图1，结果显示，模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的不良预后风险训练组：HR＝8.32，95％CI:4.31-16.07，P＝2.3e-13。实施例2LncRNA模型的验证将上述所得的LncRNA模型及计算公式，在另外71例胰腺癌患者中进行验证：71例胰腺癌患者组成独立的验证集，获取其癌组织，按照上述方法抽提RNA并通过质量检测，进一步进行RNA测序。依据表达水平对每个LncRNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值及中位数；依此判断每位患者的不良预后风险；通过COX多因素比例风险回归模型对LncRNA模型的预测效能进一步进行评价。运用该预测模型对验证组71例胰腺癌患者进行不良预后预测分析图1，结果显示，模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的不良预后风险验证组：HR＝2.32，95％CI:1.13-4.74，P＝0.018，可对患者不良预后进行准确预测。SEQUENCELISTING复旦大学附属华山医院一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒34PatentInversion3.3121DNAENSG00000272750.1Forwardprimer1gctttcttctcatgggtagcg21222DNAENSG00000272750.1Reverseprimer2gccaagtgtaattcttaggcgg22320DNAENSG00000235078.1Forwardprimer3tcggccgcgctttatcttat20420DNAENSG00000235078.1Reverseprimer4tttgcttccgaaaacagcgg20520DNAENSG00000270562.1Forwardprimer5aaagtacttccccttgcggg20620DNAENSG00000270562.1Reverseprimer6aaggggcattacgcgaaaga20720DNAENSG00000250413.1Forwardprimer7agggccccacaagaacaaaa20820DNAENSG00000250413.1Reverseprimer8aagagaagtctcaggcgtgc20917DNAENSG00000249700.7Forwardprimer9gcctctgcttccaccac171017DNAENSG00000249700.7Reverseprimer10cagccagtcctccatcc171120DNAENSG00000260070.1Forwardprimer11aagtgctcccacaacttgct201221DNAENSG00000260070.1Reverseprimer12gtcttgtcagtcacctgtggt211320DNAENSG00000232445.1Forwardprimer13ggagccggtaggttttcaca201419DNAENSG00000232445.1Reverseprimer14ccccgccgatccaatttct191521DNAENSG00000244198.4Forwardprimer15tctatacaaactaatggaagg211617DNAENSG00000244198.4Reverseprimer16ctgacagaagggcaagt171720DNAENSG00000271966.1Forwardprimer17ctttctgatgggggtgcagt201820DNAENSG00000271966.1Reverseprimer18gacagcagttccgtgcacta201919DNAENSG00000176236.6Forwardprimer19gactcgagtttaggccccg192020DNAENSG00000176236.6Reverseprimer20gggctcaagattccctgcat202120DNAENSG00000279029.1Forwardprimer21cgccagacagaaggacaagt202220DNAENSG00000279029.1Reverseprimer22ggtgcagagtaagcctcctg202320DNAENSG00000257534.1Forwardprimer23atggggttgccactcaactt202420DNAENSG00000257534.1Reverseprimer24gaaaaccacccaaagctcgg202520DNAENSG00000257303.1Forwardprimer25tcaccttggttcccaagagc202620DNAENSG00000257303.1Reverseprimer26cctgatcagcacccttctcc202720DNAENSG00000269906.1Forwardprimer27atgatggccacaggaaggtg202820DNAENSG00000269906.1Reverseprimer28gccacaccagtggtacttga202920DNAENSG00000276250.1Forwardprimer29atacaacaggctccctggtc203020DNAENSG00000276250.1Reverseprimer30gatgagcgattggtgaccct203120DNAENSG00000267015.1Forwardprimer31cacatcatcgccacacatcg203220DNAENSG00000267015.1Reverseprimer32tgaatcccactcaggttgcc203320DNAENSG00000271784.1Forwardprimer33ccacctctcagttggtcgtc203420DNAENSG00000271784.1Reverseprimer34tgacccttccgactctgact20

权利要求：1.一种胰腺癌预后预测相关LncRNA的模型，其特征在于，该模型包括样品采集、RNA提取、LncRNA测定和LncRNA表达量加权计算四部分；所述的LncRNA是筛选获得的、胰腺癌预后相关的17个LncRNA。2.按权利要求1所述的模型，其特征在于，所述的筛选是对胰腺癌癌组织进行RNA测序，并与和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，获得胰腺癌相关的17个LncRNA。3.按权利要求1或者2所述的模型，其特征在于，所述的17个胰腺癌相关LncRNA如下表所示：LncRNA名ENSG00000272750.1ENSG00000235078.1ENSG00000270562.1ENSG00000250413.1ENSG00000249700.7ENSG00000260070.1ENSG00000232445.1ENSG00000244198.4ENSG00000271966.1ENSG00000176236.6ENSG00000279029.1ENSG00000257534.1ENSG00000257303.1ENSG00000269906.1ENSG00000276250.1ENSG00000267015.1ENSG00000271784.1表1。4.一种胰腺癌标志物，其特征在于，所述的胰腺癌标志物包括表1所述的LncRNA。5.权利要求1所述模型的构建方法,其特征在于，该构建方法依次包括提取样本的RNA、RNA测序并筛选胰腺癌相关的LncRNA。6.按权利要求5所述的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：1提取并纯化胰腺癌组织的RNA样本；2对胰腺癌癌组织进行RNA测序，组成训练集，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，筛选其中与患者生存相关的LncRNA；3利用LASSOCox回归模型，在训练集中建立LncRNA预后模型，并运用十折交叉验证进行验证，计算获得LncRNA预后预测模型中包含的17个LncRNA的权重系数，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数，根据其中位数，将患者划分为高危和低危两组，判断患者不良预后风险。7.权利要求1所述的模型在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用。8.按权利要求7所述的应用，其特征在于，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者生存的风险指数，根据计算得出的值及其中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。9.按权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的风险指数的计算公式是RS＝B1*X1+…+B17*X17；其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数。10.按权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的权重系数如表2所示：LncRNA名权重系数BENSG00000272750.1-0.007894547ENSG00000235078.1-0.198597798ENSG00000270562.1-0.018438516ENSG00000250413.1-0.021035564ENSG00000249700.7-0.041273129ENSG00000260070.1-0.015183685ENSG00000232445.10.016172084ENSG00000244198.4-0.084552592ENSG00000271966.1-0.022991908ENSG00000176236.6-0.121026448ENSG00000279029.10.02416932ENSG00000257534.1-0.014257028ENSG00000257303.1-0.05251776ENSG00000269906.10.007557004ENSG00000276250.1-0.283657215ENSG00000267015.10.117787771ENSG00000271784.1-0.268003602表2。11.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测表1所列LncRNA的如表3所示的特异性引物；所述的试剂盒中还包括抽提和或鉴定RNA的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成和说明书；所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成；所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成；表3。

百度查询： 复旦大学附属华山医院 一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD