申请/专利权人：浙江恒驭生物科技有限公司

申请日：2023-12-08

公开（公告）日：2024-03-12

公开（公告）号：CN117686709A

主分类号：G01N33/569

分类号：G01N33/569;G01N33/577;G01N33/532

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.03.29#实质审查的生效;2024.03.12#公开

摘要：本发明涉及一种AAV9中和抗体检测方法，该方法建立了一种以假病毒为基础、以HEK293T为宿主细胞的中和抗体检测方法。该假病毒是一种含有萤火虫荧光素酶fireflyluciferase报告基因的重组活病毒，利用中和抗体对病毒感染的抑制原理，使用种属血清样本稀释液作为样品稀释液，通过设置阳性对照组、阴性对照组、样品组，根据稀释样品对阴性对照化学发光信号抑制率来确定待测样品的中和活性。本发明方法具有耗时短、样品种属适用性宽、细胞和病毒使用量少、灵敏度高、结果判定准确度高、自动化水平高的特点，因而更加适用于大规模、高通量、标准化的血清检测，可广泛应用于AAV9预存抗体和特异性体液免疫应答的检测。

主权项：1.一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1细胞铺板按照5×103～1×105个孔活细胞数，将HEK293T细胞铺板至化学发光板中，37℃、5％CO2浓度培养20～24h；S2病毒感染使用种属血清样品稀释液分别将待测样品、阳性对照、AAV9-Luc稀释；将稀释后的待测样品、稀释后的阳性对照、阴性对照分别和稀释后的AAV9-Luc等比例混合，各混合液在室温下孵育0.5～2h；取S1得到的含有HEK293T细胞的化学发光板，将板孔中的溶液全部吸出，分别吸取50μL混合液添加至相应板孔中，37℃、5％CO2浓度培养2～8h；取出化学发光板，每孔补充50μL细胞培养液，37℃、5％CO2浓度继续培养16～20h；阴性对照为种属血清样品稀释液；种属血清样品稀释液是通过稀释食蟹猴AAV9NAb阴性混合血清、比格犬AAV9NAb阴性混合血清、SD大鼠AAV9NAb阴性混合血清、BALBc小鼠AAV9NAb阴性混合血清中的一种制备而得，稀释比例为15～120，稀释溶液为无血清样品稀释液；AAV9-Luc是一种含有萤火虫荧光素酶报告基因的重组活病毒，具体为AAV29-pAAV-CMV-Luc2；S3中和活性检测及判断将S2得到的化学发光板取出，室温下平衡10～30min，每孔加入100μL萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂，室温下振荡孵育3～10min，检测化学发光信号；计算各稀释比例的稀释样品对阴性对照化学发光信号抑制率，抑制率50％对应的最大稀释倍数即为该待测样品的中和活性滴度值。

全文数据：

权利要求：

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